このプロトコルは、レーザーカット神経血管インプラントを用いた血液接触装置の包括的な血溶性評価について説明する。新鮮なヘパリン化されたヒト血液を有するフローループモデルは、血流を模倣するために適用される。灌流後、種々の血液学的マーカーを分析し、試験された装置の血相適合性評価のために採血後に直接得られた値と比較する。
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この記事について
サマリー
要約
体内の循環系に残る一時的または永続的な目的のために医療機器(例えば、血管移植片、ステント、心臓カテーテル)の使用が増えている場合、これらの装置によって引き起こされる可能性のある血液学的合併症(すなわち、血液成分の活性化および破壊)を評価する信頼性の高いマルチパラメトリックアプローチが必要である。血液接触インプラントの包括的なインビトロヘモ適合性試験は、生体内での実装に成功するための第一歩です。したがって、国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)による広範な分析は、臨床応用前に必須です。提示されたフローループは、ステント(この場合は神経血管)の止血性能を分析し、悪影響を明らかにする敏感なモデルを記述する。新鮮な人間の全血と穏やかな血液サンプリングの使用は、血液の事前活性化を避けるために不可欠です。血液は、試験検体を含むヘパリンチューブを通して、37°Cで150 mL/minの速度で60分間の蠕動ポンプを使用して浸透する。灌流の前後、血液学的マーカー(すなわち、 血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、および血漿マーカー)は、白血球(多形核[PMN]エラスターゼ)、血小板(β-トロンボグロブリン[β-TG])、凝固系(トンビンアンチトロンビンIII[TAT])、および補体カスケード(SC5b-9)の活性化を示す。結論として、我々は臨床応用前にステントおよび他の血と接触装置の広範なヘモ適合性テストのための必須で信頼できるモデルを提示する。
概要
ヒトの血液と相互作用するインプラントや生体材料の生体内応用には、止血システムの様々なマーカーの調査に焦点を当てた強力な前臨床試験が必要です。国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)は、血液接触装置(すなわち、ステントおよび血管移植片)の評価の中心原則を規定し、デバイス設計、臨床有用性、および必要な材料を考慮する。
ヒト血液は、白血球(白血球[BPC])、赤血球(赤血球[RBC])、血小板など、さまざまな形質タンパク質や細胞を含む流体であり、人体2において複雑な機能を行う。血液との異物の直接接触は、炎症または血栓性合併症および移植後の深刻な問題を引き起こす可能性がある免疫または凝固系の活性化などの副作用を引き起こす可能性があります3,4,5.したがって、in vitroのヘモ適合性検証は、移植前に、異物表面6との血液の接触時に誘発される可能性のある血液学的合併症を検出および排除する機会を提供する。
提示されたフローループモデルは、脳の流れ条件と動脈径を模倣するために....
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プロトコル
血液採取手順は、火ビンゲン大学の医学部の倫理委員会によって承認されました (プロジェクト識別コード: 270/2010BO1).すべての被験者は、参加前に包含のための書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。
1. ヘパリンを積んだモノベットの準備
- 希釈されていないヘパリン(5,000 IU/mL)と塩化ナトリウム(NaCl、0.9%)を混ぜる15 IU/mLのヘパリンの結果濃度の溶液を調製した。
- 各中性モノベット(9 mL)に希釈ヘパリン溶液900μLを加えて、血液サンプリング後に1.5 IU/mLの最終ヘパリン濃度を得る。ドナー1人につき3個のモノベットと3枚のリザーブモノベットを用意し、ヘパリンを積んだモノベットを4°Cで血液サンプリングまで保存します。
2. 血液サンプリング
- 血液サンプリングの30分前に冷蔵庫からヘパリンを積んだモノベットを取り出します。
- フローループの静脈穿刺により、各健常ドナー(n=5)から27mLの血液サンプルを採取する。血小板と血液凝固カスケードの早期活性化を避けるために滑らかな止血帯のみを適用します。
- ヘパリン溶液(1.5 IU/mL)900 μLを含む3つのモノベットで血液サンプルを採取し、3つのモノベットをすべて1つのプラスチック容器にプールして、すべての成分が....
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結果
簡単に要約すると、ヒト全血をヘパリンを積んだモノベットで採取し、細胞数のベースラインレベルと血漿血漿血化適合マーカーを評価するために使用した。
続いて、神経血管インプラント試料を含むチューブを充填し、蠕動ポンプを用いて150mL/minで60分間、37°Cで血液を透過させた。再び、細胞数を全群で分析し、ELISA分析用に血漿サンプルを調製した(図1)。血液細胞および血液パラメータの定量は、ヘモグロビンおよびヘマトクリットなどの、全てのサンプルタイプおよび対照のためのフローループモデルに灌流した後だけでなく、採血後に直接行った。WBCの数(図2A)、RBCs(図2B)、またはヘマトクリット値(図2C)に関する変更は検出されなかった。しかし、フロール.......
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ディスカッション
提示された議定書は人間の血流を模倣するせん断流モデルのISO 10993-4に従って血通しのインプラントのヘモ適合性テストのための包括的で信頼できる方法を記述する。この研究は、レーザーカット神経血管インプラントのテストに基づいていますが、様々なサンプルで行うことができます。この方法により、血球数、いくつかの血性適合マーカーの有病率、および血球接触後のデバイス表面の顕微鏡的可視化などの様々なパラメータの広範な分析が可能であることを実証した。このプロトコルを使用すると、異なるデバイスのヘモ互換性に関する潜在的な違いを検出できます。
in vitroヘモ適合性評価の代替は、生体内動物実験の選択肢であり、組織損傷の圧倒的な短期的効果によるデバイス関連の影響の変動性および歪みが高いなど、いくつかの欠点に関連する6。
インビトロ血体適合性試験では、(1)静的血液インキュベーションモデル、(2)撹拌血液インキュベーションモデル、(3)せん断流モデルの3種類のモデルが利用可能です。静的モデルは、.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
走査型電子顕微鏡の性能については、大学病院テュービンゲンの医学材料科学技術部門のエルンスト・シュヴァイツァーに感謝します。研究は、国家持続可能性プログラムII(プロジェクトBIOCEV-FAR LQ1604)内のCRの教育・青少年・スポーツ省とチェコ科学財団プロジェクト第18-01163Sによって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, | Germany-Citrat | |
| monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, ドイツ | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| グルタルアルデヒド (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| ヘパリンコーティング チューブ用 | Ension, Pittsburgh, USA-Heparin-Natrium | ||
| (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| マルチプレートリーダー Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, | Germany-NaCl | |
| 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| 蠕動ポンプ ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| ピペット (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| プラスチック容器 (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, ドイツ | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie | France-Reaction | |
| Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| 神経血管レーザーカットインプラント | Acandis GmbH,Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| 走査型電子顕微鏡 | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| シーリングテープ (96 ウェルプレート) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TATマイクロキット | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik、ブルクヴェーデル、ドイツ | - |
参考文献
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99(2018).
- Li, Y., Boraschi, D.
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