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方法論記事

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染

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DOI:

10.3791/60617

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2020年2月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

この記事について

サマリー

ここでは、レーシュマニア・アマゾネンシスを用いたマウスの皮状感染を評価するためのコンパイル済みプロトコルを提示する。これは、寄生虫の病原性を研究するための信頼性の高い方法であり、感染に対する脊椎動物宿主応答の全身的な見解を可能にする。

要約

リーシュマニア属は、リーシュマニアーゼを引き起こす原虫の寄生虫であり、皮疹から内臓病変まで幅広い臨床症状を示す疾患である。現在、世界中で1,200万人がリーシュマニアに感染していると推定されており、10億人以上が感染の危険にさらされています。リーシュマニアアマゾネンシスは中南米で流行しており、通常は動物モデルで直接視覚化できる病気の皮形成につながる。したがって、L.アマゾネンシス株は、インビトロでも容易に栽培されるため、皮状リーシュマニア症研究に適したモデルです。C57BL/6マウスは、ヒトで観察されるL.アマゾネンシス主導の疾患進行を模倣し、皮状リーシュマニア症のモデルに最適なマウス株の1つと考えられている。脊椎動物宿では、これらの寄生虫は、これらの細胞の防御機構にもかかわらずマクロファージに生息する。いくつかの研究は、異なる条件下で寄生虫の感染性を評価するために、インビトロマクロファージ感染アッセイを使用しています。しかし、インビトロアプローチは、生物の応答を無視する単離された細胞系に限定される。ここでは、宿主寄生虫相互作用の全身生理学的概要を提供するインビボマウス感染法をまとめます。L.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染に関する詳細なプロトコルは、感染性アマスティゴテ、マウスフットパッドの皮状接種、病変発生、および寄生虫負荷測定への寄生虫分化を含む。この確立された方法は、皮状リーシュマニア症に対する宿主免疫および代謝反応の生理学的研究のための最も適切な方法として提案する。

概要

リーシュマニア症は、発展途上国で重要な課題を表す世界的に流行している寄生虫感染症であり、世界保健機関1、2によって最も重要な放置熱帯病の一つとして認識されています。リーシュマニア症は、皮、粘膜、および/または内臓症状によって特徴付けられる。通常、L. アマゾネンシスによって引き起こされます, L. メキシカーナ, L. ブラジル人, L. ガイアナシス, L. メジャー, L. 熱帯と L. aethiopica3.この疾患の形態は、保護細胞性免疫応答の誘導によるヒトにおける自己治癒性が高い。しかし、細胞性免疫応答が失敗する可能性があり、病気は広がった皮状リーシュマニア症4、5に進行する可能性がある。リーシュマニア種とホスト遺伝的背景の間の多様性に利用可能なワクチンはありません6,7.現在入手可能な薬物のほとんどが高価で有毒であり、および/または長期治療8、9を必要とすることができるので、治療の選択肢も制限されている。その上、利用可能な治療10、11に対する薬剤耐性の報告があった。

リーシュマニア症の原因物質は原虫寄生虫リーシュマニアである。寄生虫は、そのライフサイクルに2つの異なる形態を提示する:プロマスティゴテ、サンドフライに見られる旗揚げ形態;そして、アマスティゴテは、哺乳動物宿主マクロファージ12、13の寄生性空胞に見られる細胞内形態である。脊椎動物宿主のマクロファージの防御機構にもかかわらず、アマスティゴテスの侵略、生存、複製する能力は、多くの研究の対象となる14、15、16、17。その結果、いくつかの研究グループが、特定の環境要因の影響を評価するためにインビトロマクロファージ感染アッセイを記述し、寄生虫および宿主遺伝子が寄生虫感染性に及ぼす影響を評価している。このアッセイは、高スループット形式に研究を適応させる能力、結果を得るための比較的短い期間、および犠牲にした実験動物の数を減少させる18のようないくつかの利点を提示する。しかし、インビトロアッセイの所見は、インビボ研究14、19、20、21を常に複製するとは限らない。インビボアッセイは、宿主寄生虫相互作用の全身的な生理学的概要を提供し、インビトロアッセイでは完全に模倣することができない。例えば、免疫学的研究は、回収されたフットパッド組織切片から、あるいは回収された免疫細胞22の分析のために球輝リンパ節からも免疫組織化学的アッセイを通して行うことができる。

動物は、多くの場合、疾患23の基礎的な生理学的メカニズムをよりよく理解するために、生物学的および生物医学的研究におけるヒト疾患のモデルとして使用される。リーシュマニア症の場合、接種の経路、部位、または用量が疾患の結果24、25、26、27に影響を与える。さらに、ヒトおよびマウスにおける感染に対する感受性および耐性は、宿主および寄生虫4の遺伝的背景によって高度に調節される4、5、22、28、29、30、31である。BALB/cマウスは、L.アマゾニスの皮感染に対して非常に感受性であり、寄生虫がリンパ節、脾臓、および肝臓32に広がることを伴う急速な疾患進行を示す。病気が皮の転移に進行する可能性があるため、感染は致命的になる可能性があります。対照的に、C57BL/6マウスは、L.アマゾネンシス感染アッセイ33において持続的な寄生虫負荷を有する慢性病変をしばしば発症する。それにより、この特定のマウス種に対するL.アマゾネンシス感染は、ヒトにおける慢性形態の皮状リーシュマニア症を研究する優れたモデルと考えられているが、それはBALB/cマウス感染モデル5、34よりも疾患進行を模倣するからである。

したがって、マウスインビボ感染は、ヒト疾患に適用可能なリーシュマニア病原性生理学的研究に有用な方法であり、宿主と寄生虫の相互作用の全身的な見解を可能にすることを提案する。確立されたアッセイ22を再検討し、我々はここに、亜感染性アマスタチゴテへの寄生虫分化、マウスフットパッドの細部発微、病変の発達、および寄生虫負荷測定を含むL.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染のコンパイルされたステップバイステッププロトコルを提示する。このプロトコルは、他のマウス株および皮状リーシュマニアーゼを引き起こすリーシュマニア種に適応させることができる。結論として、ここで提示された方法は、新しい抗リーシュマニア薬物標的およびワクチンを同定する上で重要であり、また、リーシュマニア感染に対する宿主の免疫および代謝応答の生理学的研究において重要である。

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プロトコル

すべての実験手順は、サンパウロ大学生物科学研究所の動物ケアと使用委員会によって承認され(CEUA 342/2019)、サンパウロ州の実験動物のケアと使用に関する勧告と方針に従って実施されました(Lei Estadual 11.977、 de 25/08/2005)とブラジル政府(レイ連邦11.794、de 08/10/2008)。セクション1-5に記載されているすべてのステップは、層流キャビネット内で無菌的に行われるべきである。リーシュマニアの生きた寄生虫を取り扱う際には、個人用保護具を利用する必要があります。

1. In Vitro Differentiation of L. amazonensis Promastigotes into Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38

注: L. アマゾネンシス(MHOM/BR/1973/M2269) (La) 寄生虫は、このアッセイで使用されました.研究目的に応じて、感染性寄生虫形態は、先に述べたように、密度勾配を用いてメタサイクリック形態の精製によって、または以下のプロトコルに従って、プロマチゴテスをアキセンチックなアマスティゴテに分化することによって得ることができる。

  1. ラ・プロマスチゴは、プロマスティゴテ(プロ培地)用培地10mL(pH=7.0)を含む25cm2細胞培養フラスコで増殖する。
  2. 25°Cで3日間インキュベートする。
    注:寄生虫39、40、41、42、43、44の病原性および異常変化の損失を避けるために、10倍未満のvitroで通過したプロマスティゴテ培養物を使用してください。
  3. ピペット5mLの対数成長相の前駆植物培養を新しい25cm2フラスコに入れた。
  4. アキセンチックなアマスティゴテス(アマ培地)用の培地5mL(pH=5.2)を加える。
  5. 34°Cで3~4日間インキュベートします。
  6. 1:3の割合でアマ培地で希釈して新しい25cm2フラスコに分けます。
  7. 34°Cで3~5日間インキュベートします。
    注:それは成熟の終わりを表すとして、最大5日間、アキセンチックなアマスティゴテをインキュベート37.

2. C57BL/6 L.アマゾネンシスによるフットパッド感染

注:サンパウロ大学生物医学研究所動物センターで、雌のC57BL/6マウス(生後6~8週)を入手し、維持した。動物は食べ物と水アドリビタムを受け取りました。

  1. PBSで希釈した寄生虫懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバー(すなわち、ヘモサイトメーター)に移すことによって、アキセキニック系アマスティゴテの培養を数える。アマスティゴテスの形態を表す非フラグラ状寄生虫を数える。
    注:または、トリパンブルー(1:1)は、実行可能なアマスティゴテ(すなわち、トリパンブルーで染色されていないもの)の数をカウントするために使用することができます。
  2. 望ましい接種量および意図した接種数に応じてPBS中のアキセキセン系アマスチゴテスを希釈する(PBSの50μLで1 x106アキセン系アマスティゴトが推奨される)。
  3. 調製した寄生虫懸濁液で27G針で結核注射器をロードします。
  4. ジョンズ・ホプキンス大学アニマルケアと使用委員会45が推奨する3-5%イソファフルランを使用してC57BL/6マウスを麻酔する。つま先のピンチに対するマウスの反応をテストして、麻酔の深さを評価します。
  5. 左後足パッドの下足板組織に均質化された寄生虫懸濁液(1 x106アキセンチックなアマスティゴテまたは所望の接種量)の50μLを接種し、予め装填されたツベルクリンシリンジ(ステップ2.3)を用いた。

3. マウスフットパッドの病変開発

  1. キャリパーを使用して左(感染)および右(非感染)フットパッドの厚さを測定することによって、週に1回の病変の進行を測定します。
  2. 病変の進行を評価するために、左と右の後ろ足パッドの厚さの差を毎週計算します。
  3. X軸上のY軸と感染時間に計算された差をプロットし、統計的有意性を計算します。
    注:動物のケアと使用委員会の勧告に従って、皮膚潰瘍は二次感染につながる可能性があるため、感染病変が潰瘍になる前に動物を犠牲にする必要があります。補助図1に示すように、このプロトコルで使用される寄生虫用量(106アキセンチック・アマスティゴテ)および宿主株(C57BL/6)で潰瘍化の徴候が示されるまでに約10週間かかる。マウスは、潰瘍の徴候が観察される前に病変抽出のために屠殺されるべきである。

4. マウスフットパッド病変抽出と寄生虫制限希釈

  1. すべての井戸に180 μLのプロミディアムを加えて、制限希釈アッセイ46、47用の96ウェルプレート(平底)を準備します。
    注:四重アッセイ(すなわち、動物1 = レーンA-D;動物2 = レーンE-H)を表す、各動物に対して4つのプレートレーン(プレートの半分)を使用します。
  2. 病変あたりガラス組織グラインダーチューブに1mLのプロミディアムを加え、チューブの重量を量る。
    注:チューブは無菌状態に保たれる必要がありますので、薄層流キャビネットの外側で重量を量る場合は、滅菌蓋を使用し、閉じた蓋でチューブを計量してください。
  3. 動物のケアと使用委員会の勧告に従って、CO2室で動物を犠牲にします。70%エタノールを噴霧して動物を消毒する。
  4. 感染したフットパッドを抽出し、消毒のためにフットパッドに70%のエタノールをスプレーするために、それかかとで動物の足を切除します。70%エタノールに浸し続けることで、はさみや鉗子の滅菌を確保します。
  5. 感染したフットパッドを無菌のペトリ皿に入れ、無菌鉗子とメスを使ってすべての軟部組織を採取します。骨を捨てる。
    注:偏った組織回復を避けるために、解剖ステップの均一性が推奨されます。
  6. 収集した組織をプロ培地でガラス組織グラインダーチューブに移し、その後、チューブを再度計量して病変重量を決定する。
    注:小さな体積が取り除かれ、組織重量が過小評価されるため、鉗子とメスを直接媒体に入れないようにしてください。病変の重量は、プロ培地のみを含むチューブの重量から、収集された組織を有するプロ培地を含むチューブの重量を差し引くことによって計算される。
  7. 完全な組織破壊のために粉砕機を使用して組織10xを均質化する。
  8. 混合物を10分間沈降させ、上清の20μLを集めます。
  9. ステップ4.1で調製した96ウェルプレートの1番目のレーンの1番目の列に上清の20μLをロードする。次の 3 つのレーンについて、動物ごとに 4 つ四つんたつものを持つ場合は、この手順を繰り返します (動物 1 の場合は、各ウェルに 20 μL を追加し、ラベル A1、B1、C1、および D1 を表します)。
  10. マルチチャンネルピペットを使用して、1番目の列10xの各ウェルを均質化します。次いで、希釈したサンプルを1番目のカラムから2番目のカラムに20μL転写する。
    注: 各ウェルを 10 倍ずつ列ごとに均質化することが重要です。
  11. 最後の列(12番目)まで残りのすべてのカラムに対してステップ4.10を繰り返し、希釈されたサンプルの最後の20 μLを廃棄します。
    注: クロスコンタミネーションを避けるために、各希釈後にチップを変更します。
  12. フィルムでプレートを密封し、湿気の多いチャンバーで7日間25°Cでインキュベートします。

5. 病変寄生虫負荷測定

  1. 反転顕微鏡を使用して7日間のインキュベーション後にプレートを分析し、各レーンの最後の寄生虫含有ウェルを決定します。
    注:また、媒質の色変化や濁度の視覚的分析によって、寄生虫、または細胞密度の成長の指標を有することも可能である。
  2. 病変重量当たりの希釈係数を割ることにより、各レーンの寄生虫組織負荷を計算する。
    注: 特定のレーンでは、1 ~ 5 桁目にのみ寄生虫が存在する場合 (つまり、ウェル A1-A5 は寄生虫の成長に対してプラス)、列 5 には 1 つの寄生虫のみが含まれ、列 4 には 10 個の寄生虫が含まれ、その後は 10 の倍数になります。列1には10個の4個の寄生虫が含まれ、これは最初の20 μLの上清(ステップ4.7の非希釈サンプル)の寄生虫の数を表す。この20μLを180μLのプロ培地で希釈したため、初期管には5 x 105寄生虫((1 x 104)/(0.02mL)=5 x 105寄生虫/1mLが含まれていました。そして、その病変における寄生虫負荷は、寄生虫の初期濃度を病変重量で割ることによって算出することができる:(5 x105)/病変重量(ステップ4.6参照)。
  3. ログ Y スケールを持つ各動物の四重化結果の平均をプロットします。

6. 統計分析

  1. 反復として実験群ごとに少なくとも5匹の動物を用いて平均±標準偏差としてデータを表す。
  2. p値 < 0.05 を有意と見なして、対になっていない両側検定を使用して統計分析を実行します。

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結果

リーシュマニア原虫寄生虫は、無脊椎動物および脊椎動物の宿主におけるライフサイクルの間に2つの発達形態に存在する:プロマチゴテ、雌のサンドフライの内腔に見られる増殖形態;そして、哺乳動物宿主細胞の寄生性空胞に見られる増殖性形態を有する。プロマスチゴは幅約1.5μm、長さ20μmの細長い体を有し、典型的には前肢から出てくるフラグエルムを有する。アマスティゴは、長さが2~6μm、幅が1.5~3μmの範囲の丸みまたは欠型体を有し、見かけにくいフラグラム12、13(図1A)を有する。血液中に無脊椎動物の宿主、家族サイコジダエの血液型昆虫は、リーシュマニアのアマスティゴテスに感染したマクロファージを獲得する。これらの細胞がサンドフライ消化管に到達すると、アマスティゴテが放出され、プロサイクリックプロマスチゴテに分化されます(

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ディスカッション

このプロトコルで説明されているin vivo感染アッセイは、全身的なシナリオにおける宿主寄生虫相互作用を考慮して、すべての研究者が生体内での皮状リーシュマニア症を評価することを可能にする。これらのアッセイは、多くのグループ22、24、27、29、31、32、34、49で使用されており、ここではいくつかのグループが持つかもしれないインフラストラクチャの制限を考慮しながら、この方法を標準化するためのステップバイステップのプロトコルをまとめました。このプロトコルはまた、生体内バイオイメージング50、51、...

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開示事項

著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言します。

謝辞

サンパウロ大学生物医学研究所動物センターのニールセン・サライヴァ・カマラ教授の皆様の支援、ガラス組織グラインダーの提供に対するシルビア・レニ・ウリアナ教授に感謝申し上げます。この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP - MFLSの助成金2017/23933-3)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルプレートGreiner bio-ne655180希釈アッセイを制限するための平底プレート
アデニンSigmaA8626M199細胞培養培地に添加したサプリメント
リパーミツトヨ700-118-20の厚さを測定するためのキャリパー
コーニング353014リーシュマニア寄生虫の遠心分離機を培養するための25cm2容量の細胞培養フラスコ
エッペンドルフ5804R密度に基づいてサンプルを分離するために使用される装置
CO2インキュベーター34 °CThermo Scientific3110アマスチゴテス分化
エタノールメルクK50237083820一般品用消毒剤
ウシ胎児血清Gibco12657-029M199細胞培養培地にサプリメントを追加
ガラス組織グラインダーチューブトーマスサイエンティフィック3431 E04感染したフットパッド組織
を採取して破壊するチューブグルコースSynthG1008.01.AHサプリメントを M199 細胞培養培地に追加
GraphPad プリズム ソフトウェアGraphPadデータをプロットし、統計的有意性を計算するために使用されるソフトウェア
ヘミンSigmaH-2250サプリメントを M199 細胞培養培地に追加
HEPESPromegaH5303サプリメントを M199 細胞培養培
インキュベーターに追加 25°CFanem347CD前胸茎培養用インキュベーター
倒立顕微鏡ニコンTMS前胸動物および母乳牛培養物の視覚的分析に使用される機器
イソフルランマウス用吸入麻酔薬(3-5%)
層流キャビネットVecoVLFS-09無菌作業領域に使用されるバイオセーフティキャビネット
M199細胞培地Gibco31100-035リーシュマニア培養用細胞培養培地
微量遠心チューブAxygenMCT150Cサンプルの収集、処理、保存に使用するマイクロチューブ
マルチチャンネルピペットLabsystemsF61978希釈アッセイを制限するために使用するマルチチャンネルピペット
NaHCO3Merck6329M199細胞培養培地
NaOHシグマS8045サプリメント M199細胞培養培地に追加されたサプリメント
ノイバウアーチャンバーHBG2266寄生虫懸濁液をカウントする血球計算盤
顕微鏡ニコンE200寄生虫パラフィルムをカウントするために使用される光学機器
Bemis349シールする柔軟で耐性のあるプラスチックプレート
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ15140122M199細胞培養培地にサプリメントを追加
ペトリ皿TPP93100フットパッド組織を解剖するための無菌皿
ピペットマンキットギルソンF167360ピペッター(P2、P20、P200、P1000)が4個入ったマイクロピペットキット
かりキミスBG2000回収したフットパッドの計量に使用した機器病変用
メスSolidor10237580026フットパッド組織を切断して採取するためのメス
血清学的ピペット 10mLネスト327001ミリリットル容量の転送に使用される滅菌ピペット
チップAxygenマイクロリットル容量の転送に使用されるピペットチップ
トリパンブルーGibco15250-061生存可能な寄生虫をカウントするために使用される染料
トリプチカーゼペプトンメルクサプリメントは、M199細胞培養培地
ツベルクリンシリンBDに追加寄生虫懸濁液を接種するための27G針付きシリンジ
キャ フットパッド細胞培養フラスコ用インキュベーター 地に追加された光学はジされました BD 305945

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