方法論記事

スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いたHBx-DDB1相互作用の同定阻害剤

DOI：

10.3791/60652

⸱

2019年12月21日

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1Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science

この記事について

サマリー

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ここでは、スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗肝炎ウイルス剤をスクリーニングする方法を提示する。このシステムはタンパク質間相互作用の容易な検出を可能にし、そのような相互作用の阻害剤を同定するのに適している。

要約

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B型肝炎ウイルス(HBV)感染に対する新しい治療薬が緊急に必要である。現在利用可能なnucleos(t)ideアナログはウイルス複製を強力に阻害しますが、ウイルス共有閉じた円形DNA(cccDNA)から転写されたウイルスタンパク質の発現に直接影響はありません。高いウイルス抗原負荷は、この慢性およびHBV関連発癌の役割を果たし得るとして、HBV治療の目的は、ウイルスタンパク質を根絶することである。HBV調節タンパク質X(HBx)は、クロムソーム5/6(Smc5/6)の構造維持を分解するために宿主DNA損傷結合タンパク質1(DDB1)タンパク質に結合し、cccDNAからのウイルス転写の活性化をもたらす。ここでは、スプリットルシフェラーゼ補体アッセイシステムを用いて、HBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定する包括的な化合物スクリーニングシステムを提示する。当社のプロトコルは、生細胞内の相互作用ダイナミクスをリアルタイムで簡単に検出できるようにします。この技術は、HBV感染の治療のための新しい治療薬を発見するための重要なアッセイとなり得る。

概要

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B型肝炎ウイルス(HBV)感染は世界的に大きな公衆衛生上の懸念事項であり、年間推定では2億4,000万人がHBVに慢性的に感染し、肝硬変や肝細胞癌(HCC)1を含む感染症による合併症による死亡が9万人にのぼります。現在の抗HBV治療薬である核(t)ideアナログは、ウイルス逆転写を十分に阻害するが、長期的な臨床目標であるウイルスタンパク質の排除を達成することはめったにない。ウイルスタンパク質除去に対する彼らの悪い効果は、肝細胞核2におけるエピソームウイルス共有閉環DNA(cccDNA)ミニクロモソームからのウイルス転写に対する直接的な影響の欠如によるものである。

HBV転写は、HBV調節X(HBx)タンパク質3によって活性化される。最近の研究では、HBxがDDB1-CUL4-ROC1 E3ユビキチンリガーゼ複合体4、5、6をハイジャックすることによって、cccDNAからのHBV転写をブロックする宿主制限因子である染色体5/6(Smc5/6)の構造維持を低下させることが明らかになった。したがって、cccDNAからのウイルス転写を促進する上で重要なステップは、HBx-DDB1相互作用であると考えられている。HBxとDDB1との結合を阻害し得る化合物は、ウイルス転写を遮断し得るが、実際にニタゾキサニドは、当研究室7で開発されたスクリーニングシステムを介したHBx-DDB1相互作用の阻害剤として同定された。

ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイ7、8を利用したHBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定するために用いられる便利なスクリーニングシステムを提示する。スプリットルシフェラーゼサブユニットはHBxおよびDDB1に融合され、HBx-DDB1相互作用はサブユニットを近接させ、明るい発光シグナルを生成する機能的酵素を形成します。サブユニット間の相互作用は可逆的であるため、このシステムはHBx-DDB1タンパク質の急速な解離を検出することができます(図1)。このシステムを使用すると、大きな化合物ライブラリーを容易にスクリーニングすることができ、HBx-DDB1相互作用を効率的に阻害し得る新規化合物の発見をもたらす可能性がある。

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プロトコル

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注: 分割ルシフェラーゼアッセイの概略図を図1Aに示し、アッセイプロセスを図1Bに概説する。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスなしでリアルタイムで測定することができます。

1. 細胞調製

  1. ドゥルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で培養HEK293T細胞を維持し、10%v/v胎児ウシ血清(FBS)、1xペニシリン/ストレプトマイシンを37°Cで20%O2および5%CO2で補充する。
  2. 種子5 x 106細胞を100mm皿にDMEMの10mLで、37°Cで一晩インキュベートする。
  3. 以下の方法に従って細胞内に分割ルシフェラーゼを用いてHBxおよびDDB1の1μgを一過性にトランスフェクトする。
    注:トランスフェクトされたプラスミドDNAの量は、使用されるトランスフェクションリージェントに依存し得る。標的タンパク質に融合した分割ルシフェラーゼの最適位置は、事前に決定されなければならない。この場合、HBxはHBxのC末端(HBx-LgBit)でLgBitに融合し、DDB1(SmBit-DDB1)のN末端でSmBitに融合し、最良の結果(すなわち、最も明るいルシフェラーゼ信号)を提供した。このプロセスは、以前に詳細7で報告されています。
    1. Dna縮合緩衝液中のDNAプラスミド(材料表)を発現するHBx-LgBitの希薄1μgとSmBit-DDB1の1μgを、総体積300μLにした。
    2. エンハンサー溶液(材料表)を16°L加え、1sのボルテックスで混ぜます。
    3. 室温で3分間サンプルをインキュベートします。
    4. 60°Lのトランスフェクション試薬(材料表)を試料に加え、10sのボルテックスで混合します。
    5. 室温で8分間サンプルをインキュベートします。
    6. インキュベーション中に、皿から培養培地を吸引し(ステップ1.2で調製)、リン酸緩衝生理食塩酸(PBS)を5mLで細胞を洗浄した。吸引によってPBSを削除し、DMEMの7 mLを追加します。
    7. トランスフェクション複合体を含むチューブに3mLのDMEMを加えます。ピペットで混ぜ、トランスフェクションコンプレックスを10cm皿のセルに加えます。
  4. 5%CO2の下で37°Cの細胞を10時間インキュベートします。
  5. 次の方法に従って、5 x 104セル/ウェルの 50°L の中/ウェルで白い 96 ウェルプレートに細胞を再シードします。
    1. 使用済み細胞培養培地を除去し、5mLのPBSで細胞を洗浄します。
    2. 吸引によってPBSを取り除き、0.25%トリプシンEDTAの1 mLを加え、細胞を剥離するために37°Cでインキュベートします。
    3. DMEMを4mL加え、細胞層の表面に数回ピペットをして培地を分散させます。細胞懸濁液をチューブに移します。
    4. 室温で5分間500 x gで遠心分離細胞。
    5. 上清を廃棄し、1 mLのPBSで細胞ペレットを再サスペンドする。
    6. 室温で5分間500xgで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。
    7. 10%FBSを添加した緩衝細胞培養培地(材料表)で細胞ペレットを1.0 x 106細胞/mLの播種密度に希釈します。
    8. ピペット50μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、細胞をインキュベーターに戻す。
  6. 細胞を37°Cで5%CO2で10時間インキュベートする。

2. 複合スクリーニング

  1. インキュベーション中に、スクリーニング化合物(材料表)および溶媒(ジメチルスルホキシド[DMSO])を13.5倍濃度で希釈する。例えば、ストックが10mMで、スクリーニング濃度が10μMの場合、73.1μLの緩衝細胞培養培地に1μLの原液を加えます。
  2. 12.5°Lの発光基板(材料表)を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベートします。
    注意:負のコントロールとして、プレートの両端のウェル(すなわち、列1と12)は発光基板を含んでいてはなりません。
  3. ルミノメータ(材料表)を使用してベースライン発光を測定します。
  4. 最初の測定の直後に、5μLの化合物を加え、各ウェルにステップ2.1で希釈したDMSOを制御します。
    メモ:最終濃度は10μMとなります。
  5. 2時間30分ごとに発光値を測定します。
    メモ:プレートは室温で暗闇の中でインキュベートする必要があります。
  6. ベースラインシグナルへの正規化後の制御DMSO処理と比較して阻害効果を計算する。
    メモ:重複または三重に各化合物をスクリーニングすると、変動を減らすことができます。

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結果

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このプロトコルの使用に続く代表的な結果を図 2A,Bに示します。信号対バックグラウンド比は80より大きく、Z'ファクター9(ハイスループットスクリーニングのゴールドスタンダード品質指数)は0.5より大きく、このアッセイシステムがハイスループットスクリーニングに許容されたことを示しています。閾値を対照と比較して>40%阻害に設定した(DMSOのみ)と共に、ナイタゾキサニドを候補薬7として同定した。このシステムを使用して、より良い候補薬は、他のより大きな化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって見つけることができます。

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ディスカッション

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HBx-DDB1結合阻害剤を見つけるためにスプリットルシフェラーゼアッセイを用いた便利なスクリーニング方法を開発した。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスを必要とせずに生細胞内でリアルタイムに検出することができる。HBx-DDB1相互作用の阻害は、Smc5/6の回復をもたらし、ウイルス転写、タンパク質発現、およびcccDNA産生の抑制をもたらす7。抗ウイルス作用のこの新しいメカニズムは、現在のHBV療法の不十分さを克服するかもしれない。

生きている細胞におけるタンパク質間相互作用を調べる方法は数多くありますが、これらの相互作用を調べるのは困難なまま10.私たちの手順は簡単で、1つの96ウェルプレートをスクリーニングするために短い時間を必要とします。また、スクリーニング品質は、高いZ'スコア、ハイスループットスクリーニングのためのゴールドスタンダード品質指数9で満足でした。当社のアッセイはロボットオートメーション

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開示事項

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著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

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この作品は、文部科学省の助成金によって支えられ、 スポーツ・サイエンス・テクノロジー,#19J11829 #19H03430 日本のスポーツ・科学・#17K09405,・#17K09405,革新的分野科学研究助成(#18H05024~M.O.)による日本医学 #JP19fk021005研究開発機構の肝炎研究プログラムによる、B型肝炎の革新的開発と新薬の応用に関するプログラムによる革新的開発・新薬の応用に関するプログラムによる革新的な開発・#JP19fk0310102国際交流基金、小林がん研究財団(M.O.)、GSKジャパン研究助成2018(株式会社)、宮川記念研究財団(代表)の助成を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養マイクロプレート、96ウェル、PS、F-BOTTOMGreiner-Bio-One GmbH655098
DMEMSigma AldrichD6046
DMSOTocris Bioscience3176
エフェクテントランスフェクション試薬Qiagen301425DNA縮合バッファー、エンハンサー溶液、トランスフェクション試薬
FBSニチレイを含む
GloMax 96 マイクロプレートルミノメーターPromegaE6521
HBx–LgBitは、DNAプラスミドを発現します私たちの研究室ご要望に応じて利用可能
HEK293T細胞アメリカンタイプカルチャーコレクションCRL-11268
NanoBiT PPIスターターシステムPromegaN2015含まれる Nano-Glo ライブセル試薬
Opti-MEMサーモフィッシャーサイエンティフィック11058021原稿では「緩衝細胞培養培地」と記載されています
PBSタカラT900
ペニシリン-ストレプトマイシンシグマ アルドリッチP0781
スクリーンウェル FDA 承認済み薬剤ライブラリ V2 バージョン 1.0エンツォ ライフサイエンスBML-2841ここで使用された化合物は、メキノール、メルカプトプリン水和物、メスナ、メストラノール、メタプロテレノール半硫酸塩、酒石酸メタラミノール、メタキサロン、塩化メタコリン、メタゾラミド、馬尿酸メテナミン、メトカルバモール、メトトレキサート、メトキサレン、臭化メトスコポラミン、メツキシミド、メチクロチアジド、アミノレブリン酸メチル·HCl、マレイン酸メチルエルゴノビン、メトラゾン、メチラポン、メキシレチン·HCl、ミカファンギン、ミコナゾール、ミドドリン·HCl、ミグリトール、ミルナシプラン·HCl、ミルタザピン、ミトタン、モエキシプリル·HCl、フロ酸モメタゾン、ムピロシン、ナドロール、ナフシリン·Na、ナフチフィン&ミッドドット;HCl、ナラトリプタン·HCl、ナタマイシン、ネビボロール·HCl、ネララビン、ネパフェナク、ネビラピン、ナイアシン、ニコチン、ニロチニブ、ニルタミド、ニタゾキサニド、ニチシノン、ニトロフラントイン、ニザチジン、ノルトリプチリン·HCl、オルサラジン·Na、オルリスタット、オキサプロジン、オキストリフィリン、オキシブチニンクロリド、オキシテトラサイクリン·HCl、パリペリドン、パロノセトロン·HCl、パロモマイシン硫酸塩、パゾパニブ·HCl、ペメトレキセド二ナトリウム、ペミロラストカリウム、ペニシラミン、ペニシリンGカリウム、イセチオン酸ペンタミジン、ペントスタチン、ペリンドプリルエルブミン、ペルメトリン、ペルフェナジン、硫酸フェネルジン、フェニレフリン、フィトナジオン、ピメクロリムス、ピタバスタチンカルシウム、およびポドフィロック
スSmBit–DNAプラスミドを発現するDDB1私たちの研究室ご要望に応じて利用可能
トリプシン-EDTASigma AldrichT4049
175012

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
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  4. Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
  5. Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
  6. Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648(2017).
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  14. Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).

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