方法論記事

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

DOI：

10.3791/60658

⸱

2021年2月23日

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

固体腫瘍細胞株における側集団細胞の割合を測定する便利で迅速かつ費用対効果の高い方法が提示される。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

がん幹細胞(CSC)は、腫瘍の増殖、転移、再発の重要な原因です。CSCの単離と同定は、腫瘍研究にとって非常に重要です。現在、腫瘍組織および腫瘍細胞株からのCSCの同定と精製にはいくつかの技術が用いられている。側母集団(SP)細胞の分離および分析は、一般的に使用される方法の2つである。これらの方法は、Hoechst 33342のような蛍光色素を迅速に排出するCSCの能力に依存します。色素の流出は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターに関連付けられており、ABCトランスポーター阻害剤によって阻害され得る。Hoechst 33342で培養腫瘍細胞を染色し、フローサイトメトリーによってそれらのSP細胞の割合を分析する方法が記載されている。このアッセイは、便利で、高速で、費用対効果が高い。このアッセイで生成されたデータは、腫瘍細胞の幹細胞性に対する遺伝子または他の細胞外および細胞内シグナルの影響をよりよく理解するのに役立つ。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

がん幹細胞(CSC)は、自己再生能および複数の分化能を有する細胞のサブセットであり、腫瘍の増殖、転移、再発1、2において重要な役割を果たす。現在、CSCは、肺、脳、膵臓、前立腺、乳房、および肝臓癌3、4、5、6、7、8、9を含む様々な悪性腫瘍に存在することが確認されている。これらの腫瘍におけるCSCの同定は、主にCD44、CD24、CD133、およびSca-19、10の高低発現などの表面マーカータンパク質の存在に基づいているが、CSCと非CSCを区別できるユニークなマーカーは、これまで報告されていない。現在、腫瘍組織または腫瘍細胞株のCSCを同定し、精製するためにいくつかの技術が使用されている。これらの手法は、CSC の特定のプロパティに基づいて設計されています。中でも、アッセイおよびサイド集団(SP)細胞の並べ替えは、一般的に使用される方法の2つである。

SP細胞は、マウス骨髄細胞の造血幹細胞を特徴としたグッデルら11によって発見された。マウス骨髄細胞を蛍光色素Hoechst 33342で標識すると、フローサイトメトリーアッセイの2次元ドットプロットに、微暗い染色された細胞の小群が現れた。Hoechst 33342は、DNA結合色素であり、異なるスペクトル特性につながる少なくとも2つの結合モードを有する。2つの波長で蛍光発光を同時に見ると、複数の集団が12を明らかにすることができる。そのアッセイでは、Hoechst 33342は350nmで励起し、蛍光は450/20 nmバンドパス(BP)フィルタおよび675 nmエッジフィルタロングパス(EFLP)11を用いて測定した。骨髄細胞の全集団と比較して、このグループの細胞は、SP細胞11と呼ばれる造血幹細胞で濃縮された。SP細胞は、Hoechst 33342を迅速に排出することができる。この染料の流出は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーター13に関連しており、これはフミトレモルジンC14、ベラパミルおよびレセルピン15、16などの一部の薬剤によって阻害され得る。その後、様々な組織、臓器、腫瘍組織、および腫瘍細胞株17、18、19において異なる割合のSP細胞が検出された。これらのSP細胞は、幹細胞17,19の多くの特徴を有する。

本稿では、培養腫瘍細胞のHoechst 33342の標識と染色、およびフローサイトメトリーによるSP細胞の分析について説明する。また、このアプローチを用いて、特定の腫瘍細胞株に対するHoechst 33342濃度および適切なブロッカー選択の最適化が示される。最後に、腫瘍細胞におけるSPの割合に対するステム促進または阻害シグナルの効果が実証される。実験例では、SPの分析が、遺伝子発現、小インヒビター、活性化剤、サイトカイン、ケモカインなどの様々なシグナルが腫瘍の幹に及ぼす影響を探究できることを実証しています。CD44+ /CD24の選別、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)分析、腫瘍球形成アッセイなど、CSCの分離精製のための他の方法と比較すると、この方法は操作が容易で、費用対効果が高い。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 細胞の調製

  1. 細胞の消化と中和
    1. 6ウェルプレート中の腫瘍細胞(MDA-MB-231細胞など)を種子化し、5%CO2を供給する37°Cインキュベーターで培養した。
    2. その密度が約90%に達したときに細胞を収穫します。培養液を十分に吸引し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)の3mLで細胞2xを洗浄する。
      注:シグナル経路阻害剤(例えば、FRA1阻害剤)、または活性化因子(例えば、STAT3活性化剤)が腫瘍細胞の幹細胞に及ぼす影響を調べるために、腫瘍細胞は6ウェルプレートに播種され、収穫前の一定時間、阻害剤または活性化剤で前処理される。
    3. 6ウェルプレートの各ウェルに0.25%のトリプシンEDTAの500 μLを加え、37°Cのインキュベーターにプレートを1〜3分間(分)、プレートを軽くタップして細胞を取り外します。
      注:長期消化は細胞の生存率の変化によるSPプロファイルに影響を与えます。
    4. 6ウェルプレートのウェルに2%の牛血清(FBS)を加えた3mLのPBSを加えて消化を終了し、細胞を上下に静かにピペットして細胞塊を分散させます。
    5. 新しい6ウェルプレートの1つの井戸に0.5mLの細胞懸濁液を加え、顕微鏡で調べます。細胞の塊が観察された場合は、70 μMの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を通過させます。
      注: これはオプションの手順です。
    6. 細胞を15 mL遠心分離チューブに移します。遠心分離細胞は200xgで5分間ペレット細胞に対する。上清を取り除き、2%FBSを補充したPBSの3mLでそれらを再中断します。細胞を上下にピペット3~5倍にして完全に混合します。
  2. セル数
    1. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに50μLのセルサスペンションを加え、50 μLのトリパンブルー溶液と混合します。混合物のピペット10μLは、ヘモサイトメーターなどの標準的な方法を用いて生細胞の数をカウントする。
    2. 2%FBSを補ったPBS中の細胞を1 x 106 細胞/mLの最終濃度に希釈します。5 mL のポリスチレン丸底試験管に細胞懸濁液1 mL を加え、2本のサンプルチューブを作製します。

2. Hoechst 33342での細胞染色

  1. 1本のチューブにHoechst 33342を加える。
    注:例えば、HOEchst 33342の適切な濃度はMDA-MB-231細胞の3 μg/mLです。
  2. ブロッカー(例えば、フミトレモルジンC、ベラパミル、またはレセルパイン)を別のチューブに適切な最終濃度に加え、37°Cで30分間インキュベートしてから、ステップ2.1に記載されているようにHoechst 33342の同じ濃度を加えます。
    メモ:MDA-MB-231セルの場合、適切なブロッカーはレセルピン(40 μM)です。レセルピンは、ゲートSP領域内の細胞の存在を確認するためのブロッキング制御として使用されます。
  3. 細胞を含むいくつかのチューブを準備し、異なる濃度勾配にHoechst 33342を追加します。フローサイトメトリーアッセイの後、SPのプロファイルと割合に応じて適切な濃度を選択します。
    注: これは、Hoechst 33342 の適切な濃度を定義するために使用されるオプションのステップです。
  4. 細胞を含む複数のチューブを準備し、異なる濃度勾配にブロッカーを加え、37°Cで30分間チューブをインキュベートし、次にHoechst 33342を適切な濃度に加えます。フローサイトメトリーアッセイの後、ゲートSP領域内の細胞の不在に応じて適切な濃度を選択する。
    注: これは、ブロッカーの適切な濃度を定義するために使用されるオプションのステップです。
  5. 37°Cインキュベーターにチューブを入れ、60分間インキュベートし、10分ごとにチューブを振ります。
    注:チューブを徹底的に振ることは、より良い染色結果のために細胞と染料の間の完全な接触を保証するので、染色のために重要です。
  6. インキュベーション後、細胞を200xgで遠心分離し、4°Cで5分間、上清を吸引して、細胞が非常に緩く不安定なペレットを形成するため、慎重に吸引する。
  7. 2%FBSを補う1mLの氷冷PBSで各チューブの細胞を再懸濁し、細胞を上下3〜5倍にピペットして完全に混合します。各チューブの懸濁液に1mg/mLヨウ化プロピジウム(PI)を1μL加え、死んだ細胞を同定します。
    注:このステップのすべての手順は、腫瘍細胞からのHoechst 33342の流出を阻害するために4°Cで行われるべきです。チューブは光への直接暴露から保護する必要があります。

3. フローサイトメトリーによる分析

注: フローサイトメーターソフトウェアの使用方法( 資料表を参照)については、このセクションと 補足図1~10で説明します。

  1. フローサイトメーターソフトウェアで、フォルダボタンをクリックします。[実験] ボタンをクリックし、[新しい実験] (図 1A、B を追加) をクリックします。
  2. [OK]ボタンをクリックします。「Experiment_001」は、フォルダの下に表示されます (補足図 2A、B)。
  3. Experiment_001ボタンをクリックして、フォルダ名を特定の名前に変更します(例:"20191118-SP")。[入力] をクリックします。新しい名前 (「20191118-SP」) がフォルダの下に表示されます (補助図 3A,B)。
  4. [新しい標本]ボタンをクリックして、新しい実験フォルダ(「20191118-SP」)に標本を追加します。「新規チューブ」ボタンをクリックして、試料にチューブを追加します。矢印ボタン(補助図4A-C)をクリックします。
  5. [パラメータ]ボタンをクリックし、フローサイトメーターのパラメータを設定します(補足図5)。
    1. 610 nmの二色性鏡ショートパス(DMSP)を使用して、発光波長を分離します。450/20 nm BPフィルターを使用して青色蛍光を採取し、675 nm EFLPを使用して赤色蛍光を収集します。
      注:Hoechst 33342は355 nmの紫外線レーザーと励起され、PIは488 nmで励起される。
  6. フローサイトメーターでセルサンプルを実行します。
    注:SP細胞は、無菌条件下で蛍光活性化細胞選別(FACS)によってソートすることができます。フォローアップ実験のために、合計100,000~50万個の細胞を収集する必要があります。
    1. フローサイトメーター上でHoechst 33342で染色された細胞を実行する。
      1. 細胞計上にHoechst 33342で染色した細胞を含むチューブを置きます。
      2. ドットプロットボタンをクリックしてドット プロットを表示し、X 軸をクリックして"FSC-A"に設定します。Y軸をクリックし、PI-Aに設定します。前方散乱パルス領域(FSC-A、X軸をリニアモードに設定)とPI蛍光(Y軸は対数スケールに設定)のドットプロットを表示します。右側に生きている細胞を表示するように電圧を調整し、左上隅にPIで明るく染色された非生細胞を表示します。次に、ポリゴンゲートを設定し、死細胞と細胞デブリを除外するポリゴンゲートを確立する(図1A)、P1サブセットをゲートするポリゴンゲートボタンをクリックして、FSC-A、PI-Aサブセットとも呼ばれる(補助図6A、B)。
      3. ドットプロットボタンをクリックしてドット プロットを表示し、X 軸をクリックして"FSC-A"に設定します。Y 軸をクリックし、"FSC-W"に設定します。FSC-A(X軸)と前方散乱パルス幅(FSC-W、Y軸)のドットプロットを表示します。ドット プロットを右クリックし、[人口を表示]ボタンの下にある[P1]ボタンをクリックします。[矩形ゲート]ボタンをクリックして、P2 サブセット(FSC-A、FSC-W サブセットとも呼ばれる)をゲートする矩形ゲートを作成します。これは、大容量のセルを除外します (補助図 7A-Cおよび図 1A)。
      4. ドットプロットボタンをクリックしてドット プロットを表示し、X 軸をクリックして"SSC-A"に設定します。Y軸をクリックし、"SSC-W"に設定します。側面散乱パルス領域(SSC-A、X軸)対側散乱パルス幅(SSC-W、Y軸)のドットプロットを表示します。ドット プロットを右クリックし、[母集団を表示]ボタンの下の[P2]ボタンをクリックします。次に、[矩形ゲート]ボタンをクリックして、P3 サブセット(SSC-A、SSC-W サブセットとも呼ばれる)をゲートする矩形ゲートを作成します。これにより、均一な粒度で細胞集団を得る(補助図8A-Cおよび図1A)。
      5. ドットプロットボタンをクリックしてドットプロットを表示し、X軸をクリックして「Hoechst Red-A」に設定します。Y軸をクリックし、それを"Hoechst Blue-A"に設定します。Hoechst レッド A (X 軸) と Hoechst Blue-A (Y 軸) のドット プロットを表示します。ドット プロットを右クリックし、[人口を表示]ボタンの下にある[P3]ボタンをクリックします。[ポリゴン ゲート]ボタンをクリックして、P4 サブセット(Hoechst Red-A、Hoechst Blue-A サブセットとも呼ばれる)をゲートするポリゴン ゲートを作成します。ドット プロットを右クリックし、[人口階層の表示] ボタンをクリックして、人口階層を表示します。
        注: ドット プロットには、3 つの異なる母集団が表示されます: 1) グラフの中心付近の G0-G1 位相母集団;2) 右上隅付近のS-G2/M相集団;3)SP。SPはさらなる分析のためにゲートされます(補助図9A-D および 図1A)。Hoechst Red-AとHoechst Blue-Aのドットプロットが 図1Aに示すようなSPプロファイルを示さない場合、同様のプロファイルが見られるまで電圧を調整する必要があります。一方、それに応じて上記のゲートのすべてを調整します。
      6. SPセルのゲート領域を決定した後、[データの取得]をクリックして各サンプルから20,000~100,000個のイベントを収集し、SPセルの割合を分析します(図10)。
    2. フローサイトメーター上でブロッカーで処理されたHoechst 33342染色された細胞を実行します。
      1. ブロッカーを含むチューブをサイトメーターに配置し、同じ電圧とゲートを使用してセルを実行し、電圧とゲートが適切に選択されているかどうかをさらに確認します。
        メモ: Hoechst 33342 単独で染色する場合と比べると、ごく一部のセルが SP のゲート領域に表示される必要があります (図 1B)。
      2. 各サンプルから20,000~100,000個のイベントを収集し、SPセルの割合を分析します。

4. データ分析

注: フローサイトメトリー解析ソフトウェアの使用方法 ( 表を参照) は、このセクションと 補足図 11~ 16 で説明されています(

  1. fcs形式のファイルをコンピュータにコピーし、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、1つのサンプルファイルをソフトウェアにドラッグします(補足図11A、B)。
  2. ゲートセルとSP細胞の割合を取得します。
    1. このサンプルファイルをダブルクリックし、X 軸をクリックして "FSC-A" に設定します。Y軸をクリックし、PI-Aに設定します。次に、ポリゴン ゲートを作成し、[OK]ボタンをクリックして FSC-A、PI-A サブセットを取得します(補助図 12A-E)。
    2. FSC-A、PI-A サブセットファイルをダブルクリックし、X軸をクリックして「FSC-A」に設定します。Y軸をクリックし、"FSC-W" に設定します。次に、長方形ゲートを作成し、[OK]ボタンをクリックして FSC-A、FSC-W サブセット(補足図13A-E)を取得します。
    3. FSC-A、FSC-W サブセットファイルをダブルクリックし、X軸をクリックして、それを「SSC-A」に設定します。Y軸をクリックし、"SSC-W"に設定します。次に、長方形ゲートを作成し、[OK]ボタンをクリックして SSC-A、SSC-W サブセットを取得します(補助図 14A-E)。
    4. SSC-A、SSC-W サブセットファイルをダブルクリックし、X軸をクリックして「Hoechst Red-A」に設定します。Y軸をクリックし、それを"Hoechst Blue-A"に設定します。次に、ポリゴン ゲートを作成し、[OK]ボタンをクリックして、Hoechst Red-A、Hoechst Blue-A サブセットを取得します (補助図 15A-E)。
    5. [レイアウト エディタを開く] ボタンをクリックして、レイアウト エディタを開きます。SSC-A、SSC-W サブセットファイルをレイアウトエディタにドラッグし、「クリックしてレイアウトをファイルに保存」ボタンをクリックして画像結果を保存します(補足図16A-C)。
  3. ソフトウェアを閉じるときに、ギャティング情報を保持するためにワークスペースを保存します。
  4. 統計解析ソフトウェアを使用してt検定分析を行い、2つのグループの差を比較します。P < 0.05 の値は統計的に有意であると定義されました。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法に従って4つの実験的SP分析を行った。最初の1つでは、ヒト乳癌細胞株であるMDA-MB-231のSP細胞の割合を正常な条件下で検出した。細胞計数後、Hoechst 33342を1 x106細胞を含む1つのチューブに加えて、3μg/mLの最終濃度を測定した。レセルピンとHoechst 33342は、それぞれ40 μMおよび3 μg/mLの最終濃度に別のチューブに加えられた。PIを両管に加えた。FSC-A(X軸)対PI-A(Y軸)のドットプロットは、3つの集団を示した:1)死んだ細胞を表すPI陽性細胞集団。2)細胞デブリ;3)主母集団はPI陰性細胞であり、これを更なる分析を行った(図1A、B)。FSC-A(X軸)対FSC-W(Y軸)のドットプロットとSSC-A(X軸)対SSC-W(Y軸)のドットプロットからゲートされた単一細胞集団を使用して、SP細胞の割合を分析した(図1A、B)。SP細胞は、Hoechst Red-A(X軸)...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SPアッセイには、いくつかの重要な点があります。1つ目は、細胞株ごとにベラパミルやレセルピンなどの適切なブロッカーの選択であり、SP細胞の「ゲート」位置は、ブロッカーの添加後に多数のSP細胞が消失する位置に応じて決定される。MDA-MB-231細胞株の場合、レセルピンはうまく機能します。ただし、他のセルラインでは、異なるブロッカーの方がうまく機能する場合があります。

2つ目は、Hoechst 33342の濃度です。代表データが示すように、Hoechst 33342の染色濃度が低下するにつれてSP細胞の割合が増加した。この現象は、色素取り込み速度論24によって説明することができる。色素濃度の変化は細胞内のHoechst 33342の濃縮に影響を与える。従って、Hoechst 33342染色濃度は、SPアッセイの結果と密接に関連している。さらに、Hoechst 33342の取り込みおよび追放は細胞タイプによって異なる。したがって、SP分析の前に、異なる細胞株について適切な濃度のHoechst 33342を探索する必要があります。

...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国81572599、81773124、81972787の自然科学財団によって資金提供されました。天津市自然科学財団(中国) 19JCYBJC27300;天津人民病院・南海大学共同研究助成 2016rmnk005;南海大学中央大学基礎研究63191153

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェル細胞培養プレートCORNING35169.5 cm2 (約)
ColivelinMCE HY-P1061ASer-ala-leu-leu-arg-ser-ile-pro-ala-gly-ala-ser-arg-leu-leu-leu-thr-glu-ile-asp-leu-pro
ウシ胎児血清 (FBS)Biological Industries (BIOIND)04-001-1ACS
Flow cytometerBD BiosciencesBD LSRFortessa
フローサイトメーターソフトウェアBD BiosciencesFACSDiva
フローサイトメトリー解析ソフトウェアBD BiosciencesFlowJo
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261bisBenzimide H 33342 三塩酸塩
チレン丸底試験管CORNING35205412 x 75 mm, 5 mL
Propidiumヨウ化物 (PI)Sigma-AldrichP41703,8-ジアミノ-5-[3-(ジエチルメチルアンモニオ)プロピル]-6-フェニルフェナントリジニウム ジヨウ化物
ReserpineSigma-Aldrich83580(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-ジメトキシ-18-[(3,4,5-トリメトキシベンゾイル)オキシ]ヨヒンバン-16-カルボン酸メチルエステル
SKLB816四川大学
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッドGibco25200072
ベラパミル塩酸塩Sigma-AldrichV46295-[N-(3,4-ジメトキシフェニルエチル)メチルアミノ] -2-(3,4-ジメトキシフェニル)-2-イソプロピルバレロニトリル塩酸塩
ポリスShengyong Yang博士提供

参考文献

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