固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量

サマリー

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。

要約

固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラムから浸出した金属を含む酵素の汚染は、IMAC樹脂に使用される一般的な二価陽イオンの多くが酵素に対する阻害効果を有するので、酵素学者にとって大きな懸念事項です。しかし、金属浸出の程度と種々の溶出および還元試薬の影響は、一般的に利用可能な機器を使用するシンプルで実用的な遷移金属定量プロトコルがないため、大部分は十分に理解されていません。生化学研究室この問題に対処するために、精製工程としてIMACを用いて調製したサンプル中の金属汚染量を迅速に定量化するプロトコルを開発しました。この方法は、647nmにおけるHNBスペクトルの変化に基づいて、サンプル溶液中の金属カチオン含有量の比色指標としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)を使用し、UV-Vis分光法を使用して、存在する金属の量を定量する手段として、ナノモル範囲に含まれる。溶液中の金属含有量は、原子吸光分光法または誘導結合プラズマ技術を使用して歴史的に決定されてきましたが、これらの方法は、典型的な生化学研究所の範囲外の特殊な機器とトレーニングを必要とします。ここで提案される方法は、生化学者が正確性を犠牲にすることなく、既存の装置と知識を使用してサンプルの金属含有量を決定するための簡単かつ迅速な方法を提供します。

概要

ポラスと同僚¹による創業以来、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+などの遷移金属イオンと結合する能力に基づいてタンパク質を迅速に分離する方法となっています。これは、最も一般的に設計されたポリヒスチジンタグを介して行われ、現在、組換えタンパク質²の分離のための最も一般的なクロマトグラフィー精製技術の一つです。IMACはまた、食品サンプル分析³のためのキノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、およびβラクタムを単離する方法として組換えタンパク質精製を超えるアプリケーションを発見し、肝臓および膵臓癌^のための血清タンパク質マーカーを同定するステップとして^4、5.当然のことながら、IMACはまた、多くの天然生物エネルギー酵素^{6、7、8、9、10}の単離のための選択の方法となっている。しかしながら、酵素活性バイオエネルギータンパク質に関する研究のためのこれらの精製方法の成功した実施は、カラムマトリックスから溶出物に浸出した金属カチオンのごくわずかなレベルの存在に依存する。IMACで一般的に使用される二価金属陽イオンは、低濃度^11、12であっても病理学的生物学的意義を知っている。これらの金属の生理学的効果は、細胞呼吸または光合成^13、14、15の阻害剤として致死性を証明することができる生物エネルギー系で最も顕著である。同様の問題は、残留汚染物質金属がタンパク質の生物学的機能や生化学的および生物物理学的手法による特徴付けを妨げる可能性のあるタンパク質クラスの大半では避けられない。

酸化条件下での金属汚染のレベルとイミダゾールを溶出剤として使用することは一般的に低い¹⁶ですが、システイン還元剤(DTT、β-メルカプトエタノールなど)の存在下で行われるタンパク質分離、またはヒスチジン^17、18またはエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)のようなより強いキレート剤を用いて行われるタンパク質分離は^{、金属汚染の}はるかに高いレベル^{をもたらす。}同様に、IMAC樹脂中の金属イオンはカルボン酸基によって頻繁に協調するため、酸性条件下で行われるタンパク質溶離物も、はるかに高いレベルの金属汚染を有する可能性が高い。溶液中の金属含有量は、ppb-ppt範囲21、22、23、24における検出限界まで原子吸光分析(AAS)および誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)を用いて評価することができる。残念ながら、AASとICP-MSは、これらの方法は、特殊な機器やトレーニングへのアクセスを必要とするので、従来の生化学ラボで検出するための現実的な手段ではありません。

Brittain^25,26による以前の研究は、溶液中の遷移金属の存在を同定する方法としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)の使用を調査した。しかし、データ²⁰にはいくつかの内部矛盾があり、それらの作品は適切なプロトコルを提供できませんでした。Temel et al.²⁷および Ferreiraら²⁸による研究は、潜在的な金属指標として HNB とのブリタインの研究に拡大しました。.しかし、Temel は、HNB をキレート剤としてのみ使用して、サンプル分析に AAS を使用するプロトコルを開発しました。フェレイラの研究は、563nmにおけるHNB吸光度スペクトルの変化を用いて、pH5.7におけるHNB金属錯体のスペクトルと重なり合う自由色素HNBスペクトルの領域であり、アッセイ感受性をかなり低くし、比較的弱い金属結合親和性²⁰をもたらした。IMACからNi 2+浸出を行うNi²⁺のラボの問題に対処するために、我々はブリタイン^25、26、フェレリア²⁸によって行われた作業を拡大し、いくつかの遷移金属のナノモルレベルを検出することができる簡単なアッセイを開発しました。HNBは、IMAC金属に対してニッケルおよびその他の一般的な結合を亜ナノモル結合親和性と結合し、pH値²⁰の広い範囲にわたって1:1複合体を形成することを示した。ここで報告されるアッセイは、これらの知見に基づいており、金属定量のために647nmのHNBスペクトルの吸光度変化を利用する。このアッセイは、金属色素錯体の比色検出と定量、および金属に結合する際の遊離色素の吸光度の変化を用いて、典型的な生化学ラボで見られる一般的な緩衝液および計装を用いて生理学的pH範囲で行うことができる。

プロトコル

1. アッセイ成分の準備

1. 280 nmの光吸光度またはタンパク質定量の代替方法を使用してアッセイするクロマトグラフィー画分を決定し、タンパク質濃縮画分を同定します。
   注:この作業では、ダイオードアレイUV-Vis分光度計を使用しました。スループットを高めるために、UV-Vis吸光度を測定できるプレートリーダーを使用できます。
2. 必要なアッセイ成分の調製
   1. 7 ~ 12 の pH を使用して、10 ~ 100 mM バッファー (「サンプル バッファー」) を準備または取得します。
      注:中性または塩基性pHにおけるトリス、HEPES、MOPS、リン酸塩などの一般的な生化学的緩衝液はすべてアッセイに適しています。トリシンとヒスチジンは使用できますが、両方とも実質的に金属イオンをキレートするので、較正曲線が必要になります。ヒスチジンのキャリブレーションの例を参照²⁰に示す。
   2. 調製した原液1ミリリットル当てに対して120mgのHNB試薬を用いて、サンプルバッファー中にヒドロキシナフトールブルー(HNB)分散液の12%w/v(20倍濃縮)溶液を調製します。
      注意:眼にHNBの暴露は深刻な損傷と刺激を引き起こす可能性があります。目の保護は、HNBを扱うときに使用する必要があり、ハンドリング後に手を十分に洗浄する必要があります。
      注:HNBは、科学試薬の主要サプライヤーによってKCl上の分散として販売されています。そのため、溶液中の実際の濃度は、異なる製造業者、バッチ、およびボトル内のHNB分散液がどこから取られるかによって異なります。理想的には、ストックの20倍希釈後の647 nmで0.5〜0.8の間の吸光度を達成する必要があります。

2. サンプル調製と測定

1. データ収集のための分光光度計の作成
   1. UV-Vis分光光度計をオンにしてウォームアップします。分光光度計を設定して、647 nmでデータを収集します。
      注:分光光度計で、さらに850nmでデータを収集したり、色素や色素スペクトルに関する大きな変化を伴わずに他の波長を収集したりして、ベースライン補正に使用することができます。
   2. サンプルバッファを使用して分光光度計を空白にします。
      メモ:石英または使い捨てプラスチックキュベットを使用することができます。クォーツキュベットは、使い捨てプラスチックキュベットよりも高い精度と精度を可能にするため、定量分析に適しています。しかし、プラスチックキュベットはUV光を遮断し、一部のダイオードアレイ分光光計の測定ビームに存在し得る。強烈な紫外線へのHNBの暴露は、顕著な色素の劣化と、低速金属結合と混同することができる望ましくない遅い吸光度の低下を引き起こす(例えば、参照20のサポート情報の図1を参照してください)。
2. 制御の準備と吸光度測定
   1. 総アッセイ量の1ミリリットル当たり50μLのHNBストックを含む制御溶液を調製します。すべてのサンプルの良好な混合を確保するために、最初に小さなボリュームをピペットし、次にサンプルバッファを追加し、ピペットで混合します。希釈されたHNB溶液は新鮮に調製する必要がありますが、HNBストックは4°Cで保存し、大幅な劣化なしに数週間光から保護することができます。
   2. コントロールが室温で最低3分間インキュベートできるようにします。
      注:アルカリ性pHのサンプルや、難溶性金属錯体の形成によるリン酸塩の存在下で、より長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。
   3. 制御試料の吸光度を647nmで測定し、記録する。
3. 試料の調製・吸光度測定
   1. 50 μLのHNBストックと950μLの適切に希釈されたタンパク質画分をサンプルバッファと混合してアッセイサンプルを調製します。
      注:文献で報告される金属汚染レベルは溶出条件^16、20に応じて1000以上の係数によって異なるため、アッセイのダイナミックレンジ内の吸光度変化を達成するために、サンプルバッファ(上記のステップ1.2.1を参照)を使用してアッセイタンパク質画分の希釈を数回試す必要がある場合があります。
      注意:IMACで使用されるニッケルおよび他の金属は、発癌性の疑いがある皮膚刺激性が知られており、長期暴露後に腎臓および血液に損傷を与える可能性がある。IMACで調製したタンパク質サンプルを取り扱う際には、手袋と目の保護を使用する必要があります。
   2. サンプルが室温で最低3分間インキュベートし、647 nmで吸光度を測定できるようにします。
      注:投資時間の観点からアッセイの制限ステップは、インキュベーションステップです。この論文のデータは、各サンプルの間に慎重に洗浄された単一の石英キュベットを使用して収集された。HNBストックの洗浄時間と準備を追加しても、14サンプルのデータ収集と制御に約1時間半かかり、プロトコルを中断することなく簡単に完了できます。
   3. 測定する分数ごとに手順 2.3.1 と 2.3.2 を繰り返します。
      注:複数のクベットを複数のサンプルに使用する場合は、サンプルを同等のインキュベーション時間と周囲光への暴露を可能にする方法で調製する必要があります。

3. 金属定量

1. 各サンプル中の金属濃度の決定
   1. HNBコントロールから647nmで各サンプル吸光度の差を見つけます。
   2. 以下の式を使用して、金属濃度(μM単位)を決定します。
      
      
      
      ここで、DFはアッセイ分数の希釈係数、ΔAbs₆₄₇は647nmでの吸光度変化、3.65x10-2はHNBの消滅係数を表し(ε=36.5 mM^-1・cm-1詳細は参考²⁰参照)、lはcmにおけるキュベットの光経路である。

結果

中性pH(黒線)における遊離HNBのスペクトルと、MSP1E3D1²⁹の単離から^Ni2+に対してアッセイされた分画の代表的なスペクトルを図2に示す。成功したアッセイシリーズは、遷移金属の存在下でHNB複合体の形成に対応するHNB制御と比較して647nmでの吸光度の低下を実証すべきである。失敗したアッセイは、647 nmでの吸光度の増加によって示されるであろう。あるいは、647nmでの初期吸光度から90%以上減少すると、金属含有量が高すぎること、さらに希釈された画分をアッセイする必要があることを示す。フリーHNBコントロールからの吸光度変化のないアッセイは、必ずしも故障を示すものではありません。サンプルには本質的に浸出金属が含まれていない可能性があります。しかしながら、これは可能性が低く、吸光度変化を示さない任意のサンプルを調製し、再び測定し、好ましくは希釈を少なくして、結果を確認する。合計で、予想される吸光度変化を観察するほとんどの失敗は、サンプル調製中の不適切なピペット、測定前の不十分なインキュベーション時...

ディスカッション

HNBを用いた金属の比色検出は、IMAC樹脂からの金属イオンの遷移によるタンパク質汚染の程度を定量化する簡単な方法を提供します。Ref. 20で確立したように、Ni²⁺は1:1のストイチオメトリーとpHによるNi-HNB複合体の解離定数を用いてHNBに結合します。ただし、複素 K_dは、すべての推奨 (7-12) pH 値に対してサブ nM 範囲内にあります。実用的には、EDTAのような他の強力なキレート試薬が存在しない限り、任意の試験画分のすべての^Ni2+がHNBに結合することを意味します。これらすべての特性を組み合わせることで、線形Ni²⁺滴定曲線が得られるため、実験的に観察しました。その報告書²⁰では、金属色素複合体形成によるスペクトル変化が7-12pH範囲全体で同じになることを確立した。検出は、2.7-27 nM Ni²⁺に対応する最小の信頼性の高い吸光度変化測定(使用する分光光度計に応じて^10-4~10-3 OD)によって制限されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
		大腸菌増殖
HEPES、遊離酸	BioBasic	HB0264	代替
バッファーHisPur Ni-NTA樹脂Thermo	Scientific	88222、
ヒドロキシナフトール、青色ジソイダム塩	、Sigma-Aldrich	219916-5g
、イミダゾール	フィッシャーサイエンティフィック	O3196-500
イミダゾール	BioBasic	IB0277
MOPS、遊離酸	BioBasic	MB0360	代替バッファー
塩化ナトリウム	ッシャー・サイエンティフィック	S271-500
リン酸ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S369-500	代替バッファー
トリシン	ゴールド バイオ	T870-100
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500
トリトンX-100	シグマアルドリッチ	T9284-500