固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量

サマリー

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。

要約

固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラムから浸出した金属を含む酵素の汚染は、IMAC樹脂に使用される一般的な二価陽イオンの多くが酵素に対する阻害効果を有するので、酵素学者にとって大きな懸念事項です。しかし、金属浸出の程度と種々の溶出および還元試薬の影響は、一般的に利用可能な機器を使用するシンプルで実用的な遷移金属定量プロトコルがないため、大部分は十分に理解されていません。生化学研究室この問題に対処するために、精製工程としてIMACを用いて調製したサンプル中の金属汚染量を迅速に定量化するプロトコルを開発しました。この方法は、647nmにおけるHNBスペクトルの変化に基づいて、サンプル溶液中の金属カチオン含有量の比色指標としてヒドロキシナフトールブルー(HNB)を使用し、UV-Vis分光法を使用して、存在する金属の量を定量する手段として、ナノモル範囲に含まれる。溶液中の金属含有量は、原子吸光分光法または誘導結合プラズマ技術を使用して歴史的に決定されてきましたが、これらの方法は、典型的な生化学研究所の範囲外の特殊な機器とトレーニングを必要とします。ここで提案される方法は、生化学者が正確性を犠牲にすることなく、既存の装置と知識を使用してサンプルの金属含有量を決定するための簡単かつ迅速な方法を提供します。

概要

ポラスと同僚¹による創業以来、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+などの遷移金属イオンと結合する能力に基づいてタンパク質を迅速に分離する方法となっています。これは、最も一般的に設計されたポリヒスチジンタグを介して行われ、現在、組換えタンパク質²の分離のための最も一般的なクロマトグラフィー精製技術の一つです。IMACはまた、食品サンプル分析³のためのキノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、およびβラクタムを単離する方法として組換えタンパク質精製を超えるアプリケーションを発見し、肝臓および膵臓癌^のための血清タンパク質マーカーを同定するステップとして^4、5.当然のことながら、IMACはまた、多くの天然生物エネルギー酵素^{6、7、8、9、10}<....

プロトコル

1. アッセイ成分の準備

1. 280 nmの光吸光度またはタンパク質定量の代替方法を使用してアッセイするクロマトグラフィー画分を決定し、タンパク質濃縮画分を同定します。
   注:この作業では、ダイオードアレイUV-Vis分光度計を使用しました。スループットを高めるために、UV-Vis吸光度を測定できるプレートリーダーを使用できます。
2. 必要なアッセイ成分の調製
   1. 7 ~ 12 の pH を使用して、10 ~ 100 mM バッファー (「サンプル バッファー」) を準備または取得します。
      注:中性または塩基性pHにおけるトリス、HEPES、MOPS、リン酸塩などの一般的な生化学的緩衝液はすべてアッセイに適しています。トリシンとヒスチジンは使用できますが、両方とも実質的に金属イオンをキレートするので、較正曲線が必要になります。ヒスチジンのキャリブレーションの例を参照²⁰に示す。
   2. 調製した原液1ミリリットル当てに対して120mgのHNB試薬を用いて、サンプルバッファー中にヒドロキシナフトールブルー(HNB)分散液の12%w/v(20倍濃縮)溶液を調製します。
      注意:眼にHNBの暴露は深刻な損傷と刺激を引き起こす可能性があります。目の保護は、HNBを扱うときに使用する必要があり、ハンドリング後に手を十分に洗浄する必要があります。
      注:HNBは、科学試薬の主要サプライヤーによってKCl上の分散として販売....

結果

中性pH(黒線)における遊離HNBのスペクトルと、MSP1E3D1²⁹の単離から^Ni2+に対してアッセイされた分画の代表的なスペクトルを図2に示す。成功したアッセイシリーズは、遷移金属の存在下でHNB複合体の形成に対応するHNB制御と比較して647nmでの吸光度の低下を実証すべきである。失敗したアッセイは、647 nmでの吸光度の増加によって示されるであろう。あるいは、647nmでの初期吸光度から90%以上減少すると、金属含有量が高すぎること、さらに希釈された画分をアッセイする必要があることを示す。フリーHNBコントロールからの吸光度変化のないアッセイは、必ずしも故障を示すものではありません。サンプルには本質的に浸出金属が含まれていない可能性があります。しかしながら、これは可能性が低く、吸光度変化を示さない任意のサンプルを調製し、再び測定し、好ましくは希釈を少なくして、結果を確認する。合計で、予想される吸光度変化を観察するほとんどの失敗は、サンプル調製中の不適切なピペット、測定前の不十分なインキュベーション時.......

ディスカッション

HNBを用いた金属の比色検出は、IMAC樹脂からの金属イオンの遷移によるタンパク質汚染の程度を定量化する簡単な方法を提供します。Ref. 20で確立したように、Ni²⁺は1:1のストイチオメトリーとpHによるNi-HNB複合体の解離定数を用いてHNBに結合します。ただし、複素 K_dは、すべての推奨 (7-12) pH 値に対してサブ nM 範囲内にあります。実用的には、EDTAのような他の強力なキレート試薬が存在しない限り、任意の試験画分のすべての^Ni2+がHNBに結合することを意味します。これらすべての特性を組み合わせることで、線形Ni²⁺滴定曲線が得られるため、実験的に観察しました。その報告書²⁰では、金属色素複合体形成によるスペクトル変化が7-12pH範囲全体で同じになることを確立した。検出は、2.7-27 nM Ni²⁺に対応する最小の信頼性の高い吸光度変化測定(使用する分光光度計に応じて^10-4~10-3 OD)によって制限されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
		大腸菌増殖
HEPES、遊離酸	BioBasic	HB0264	代替
バッファーHisPur Ni-NTA樹脂Thermo	Scientific	88222、
ヒドロキシナフトール、青色ジソイダム塩	、Sigma-Aldrich	219916-5g
、イミダゾール	フィッシャーサイエンティフィック	O3196-500
イミダゾール	BioBasic	IB0277
MOPS、遊離酸	BioBasic	MB0360	代替バッファー
塩化ナトリウム	ッシャー・サイエンティフィック	S271-500
リン酸ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S369-500	代替バッファー
トリシン	ゴールド バイオ	T870-100
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500
トリトンX-100	シグマアルドリッチ	T9284-500

、 フィ