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方法論記事

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

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DOI:

10.3791/60744

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2020年2月2日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。

要約

肝細胞癌(HCC)のいくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュモデルでは、肝腫は幼虫初期段階で観察することができる。ゼブラフィッシュHCCモデルにおける幼虫の肝臓のサイズを定量化することは、腫瘍遺伝子関連の表現型に対する薬物および他の操作の影響を迅速に評価する手段を提供する。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫を固定し、肝臓を取り巻く組織を解剖し、明視野顕微鏡を用いて肝臓を撮影し、肝臓面積を測定し、結果を分析する方法を示します。このプロトコルは、肝臓のサイズの迅速かつ正確な定量化を可能にします。この方法は、肝領域を測定することを含む, それは肝臓の体積の違いを過小評価可能性があります, そして、補完的な方法論は、細胞のサイズの変化と細胞数の変化を区別するために必要とされます.本明細書に記載される解剖技術は、免疫蛍光染色およびin situハイブリダイゼーションを含む無数の下流アプリケーションのための自然な位置で肝臓、腸、膵臓を視覚化するための優れたツールです。幼虫の肝臓のサイズを定量化するための説明された戦略は、肝臓の発達と再生の多くの側面に適用可能です。

概要

肝細胞癌(HCC)は、肝臓1の最も一般的な原発性悪性腫瘍であり、癌関連死亡率2の第3の主要な原因である。肝癌のメカニズムを理解し、潜在的なHCC治療薬を同定するために、我々および他の人々は、β-カテニン3、4、Kras(V12)5、6、Myc7、またはYap18のような腫瘍遺伝子の肝細胞特異的発現が成人動物のHCCにつながるトランスジェニックゼブラフィッシュを開発しました。これらのゼブラフィッシュでは、肝臓の拡大は受精後6日(dpf)に早くも注目され、腫瘍遺伝子駆動の肝臓過剰増殖に対する薬物および遺伝的変化の効果をテストするためのファシリティプラットフォームを提供する。幼虫の肝臓のサイズの正確かつ正確な測定は、これらの操作の効果を決定するために不可欠です。

肝臓の大きさと形状は、CY3-SA標識9または肝細胞特異的蛍光レポーターおよび蛍光分光顕微鏡顕微鏡法を用いた生きたゼブラフィッシュ幼虫で固定ゼブラフィッシュ幼虫で半定量的に評価することができる5,6。後者の方法は比較的速く、その精度の欠如は、画像処理ソフトウェア7、10を使用して各肝臓の面積を撮影して測定することによって対処することができる。しかし、2次元の肝臓領域が肝臓の大きさを正確に表すような実験で、すべての生きた幼虫を均一に配置することは技術的に困難である可能性があります。肝臓のサイズを定量する同様の技術は、幼虫肝容積8を定量するために光シート蛍光顕微鏡を使用することを含むが、これは肝臓が異なる次元で不均一に拡大された場合のサイズの違いを検出するためのより正確であるかもしれない。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、幼虫肝臓における蛍光標識肝細胞および他の肝細胞タイプの数を数えるために使用することができる8、11。この方法では、幼虫の肝臓がプールされ、解き分け、個々の肝臓のサイズと形状に関する情報が失われます。他の肝サイズ決定方法と組み合わせて、FACSは増加した細胞数(過形成)と増加した細胞サイズ(肥大)との間の分化を可能にする。これらの方法はすべて高価な蛍光技術(顕微鏡または細胞選別器)を採用し、CY3-SA標識を除いて、蛍光レポーターによる肝細胞の標識を必要とする。

ここでは、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェア3、12、13、14を用いてゼブラフィッシュ幼虫の肝臓領域を定量する方法について詳細に説明する。このプロトコルは、蛍光顕微鏡を使用せずに、その場で個々の肝臓の面積を正確に定量化することができます。肝臓のサイズを分析しながら、我々は、研究者の偏見を低減し、科学的な厳しさを向上させるために画像のアイデンティティを盲目に15.

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プロトコル

動物研究は、ユタ大学の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された以下の手順を実施しています。

1. 幼虫の固定

  1. 受精後3~7日(dpf)で、幼虫をトリカインメタンスルホン酸で安楽死させる(0.03%)ガラスピペットとピペットポンプを使用して2 mLチューブに最大15個の幼虫を集めなさい。
  2. 幼虫を1mLの冷たい(4 °C)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を氷上で2回洗浄する。洗浄ごとに、ガラスピペットとピペットポンプでチューブからできるだけ多くの液体を取り出し、冷たいPBSをチューブに1 mL加えます。
  3. ガラスピペットとピペットポンプを用いてできるだけ多くのPBSを取り出し、1 mLの低温(4°C)4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに加えます。
    注意:PFAは刺激性であり、発がん性物質の疑いがあります。PFAを扱う際は手袋を着用し、濃縮溶液は化学ヒュームフードで取り扱う必要があります。
  4. 穏やかな揺れと4°Cで少なくとも一晩(しかし数ヶ月まで)インキュベートします。

2. 肝臓を取り巻く組織を解剖する

  1. 1 mLの冷たい(4 °C)PBSで3倍をすすい、リンスの間に5分間揺らすことでPFAから幼虫を取り除きます。
    注:4°Cで1日か2日PBSですすい幼虫を保ちてもいいです。
  2. PBSのいくつかの幼虫を9ウェルの丸底ガラス皿の1つの井戸にピペット。
  3. 肝臓を取り巻く皮膚を取り除きます。
    1. 細かい鉗子を使って幼虫を背中に持ち(腹を上げ)、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、心臓の上に皮膚をつかむために、もう一方の手で非常に細かい鉗子を使用してください。
    2. 魚の尾に向かって斜めに皮を引き下げ、魚の左側または右側の皿の底に向かって、皮膚を斜めに引き下げます。反対側(右側または左側)に対して繰り返します。
    3. 皮膚のフラップをつかみ、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで、引き下がったり後退したりします。
  4. もしあれば、黄身を取り除きます。
    1. 5~6dpf幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で持ち、非常に細かい鉗子を使って黄身を優しく突き出して黄身を一枚に持ち上げます。
    2. 3~4dpf幼虫の場合は、黄身を粉々に削り取ります。背中に細かい鉗子を持って魚を保持し、腹側から始めて黄身をなでるのに非常に細かい鉗子を使用します。
  5. ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖された幼虫を新鮮な冷たいPBSに入れます。

3. イメージング

  1. 幼虫を取り付けるには、きれいなプラスチックペトリ皿の蓋に3%メチルセルロースのいくつかのmLを注ぎます。
  2. ガラスピペットとピペットポンプを使用して、メチルセルロースに幼虫を加え、幼虫をできるだけ少なくPBSを加えます。
  3. 低倍率の解剖顕微鏡の下で、彼らは左を向いて、彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを細かい鉗子を使用します。
    注:魚が彼らの側に完全に向かっていることを確認するか、肝臓の測定値が正確でない可能性があります。
  4. 各魚の写真を撮ります。
    1. 撮影する魚が、片方の目をもう一方の目の上に直接置いて、完全に整列していることを確認します。必要に応じて、魚の頭や尾を軽くタップして方向を調整するために細かい鉗子を使用してください。魚の尻尾が曲がった場合は、魚が平らに横たわるように取り除くために鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。
    2. 高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当て,肝臓の輪郭がはっきりと見えるようにします。
    3. 画像をスナップしてファイルを保存します。
    4. すべての魚について繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。
    5. 同じ倍率でマイクロメータの写真を撮ります(図2Hを参照)。

4. 画像解析

  1. 画像処理ソフトを使用して、各魚の肝臓の面積を測定します。
    1. 潜在的な研究者の偏見を回避し、科学的な厳しさ15を促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にします。この手順は、他のラボ メンバによって手動で実行することも、コンピュータ プログラム (補足資料) を使用して実行することもできます。ファイルの名前をランダムに変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含む「ランダム化ファイル」を作成します。
    2. ランダム化されたファイルをファイル 1 から順番に開きます。
    3. フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の輪郭を描きます。
    4. Ctrl+M を押して、各肝臓の面積を測定します。
    5. 正確に測定できない肝臓については、プレースホルダの測定値を挿入します (非常に小さいか、非常に大きいので、後で簡単に除外できます)。
    6. 測定値をテキストファイル(「測定ファイル」)に保存します。
  2. データの非ブラインドおよび分析
    1. スプレッドシートプログラムで「計測ファイル」と「ランダム化ファイル」を開きます。
    2. 「計測ファイル」に新しい列を挿入し、「ランダム化ファイル」を使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。このファイルを「ブラインドなし測定ファイル」として保存します。
    3. データを元のファイル名で並べ替えます。
    4. 画像が不十分であった肝臓の測定値は必ず除外してください(図2A-Gを参照)。
    5. 必要に応じて、測定値を目的のスケール(mm2など)に変換します。
      1. 画像処理ソフトウェアでスケールバーを開きます。
      2. 直線ツールを使用して、スケールバー上で 1 mm を測定します。画像処理ソフトウェアは、変換係数を与え、肝臓(ピクセル)と同じ単位で測定します。
      3. 変換係数を使用して、「ブラインドなし測定ファイル」の測定値を変換します。
    6. スプレッドシートプログラムを使用するか、データを科学的なグラフ化および統計ソフトウェアに貼り付け、平均と標準偏差を決定し、p値を計算します。

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結果

肝細胞特異的活性化βカテニン(Tg(fabp10a:pt-β-cat)ゼブラフィッシュ)3および非トランスジェニック対照兄弟を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを6dpfで安楽死させ、肝臓領域を明熱域で明熱分析し、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェアを用いて肝臓領域を定量した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、非トランスジェニック兄弟(0.0004 cm2、p<0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001; 図 1を参照してください。

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ディスカッション

肝臓の発達、再生、および腫瘍形成を理解することを目的とした研究では、肝臓のサイズの定量化は重要です。ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量のための比較的迅速かつ簡単で安価な技術です。プロトコルの特定の側面を実行しながら適切な注意を払うことは、結果の精度を高め、フラストレーションを減らすことに役立ちます。

幼虫の適切な固定は、よく保存された生物学的サンプルを取得し、その崩壊を防ぐために重要です。4%のPFA溶液の希釈は、PBSがリンス幼虫にPFAを添加する前に完全に除去されない場合に起こり得る。適切に作成された PFA ソリューションを使用し、PFA 追加前に PBS ソリューションのすべてまたは大部分をピペット化することは、この問題に対処するのに役立ちます。

速く、多くの練習の後に実行するのは簡単ですが、解剖技術は、かなりの手動の器用さを必要とします。解剖中、肝臓全体が露出するように、肝臓の上から皮膚と黄身を完全に取り除することが重要です。これを行わないと、肝臓の境界のビューが隠れた画像が生じることが...

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開示事項

著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

ユタ大学のマリン・ホッブスと中央集権ゼブラフィッシュ動物資源(CZAR)が、この研究の一部を行うためのゼブラフィッシュの畜産、実験室スペース、および機器を提供することを認めたい。CZARの拡張は、NIH助成金#1G20OD018369-01によって部分的にサポートされています。また、ロドニー・スチュワート、クロエ・リム、ランス・グラハム、コーディ・ジェームズ、ギャレット・ニックム、ハンツマンがん研究所(HCI)ゼブラフィッシュ・ファシリティに感謝したいと思います。R プログラミングの支援を受けてくださったケネス・コンパスに感謝します。この研究は、ハンツマンがん財団(ハンツマンがん研究所に授与された助成金P30 CA042014)(KJE)とNIH / NCI R01CA222570(KJE)からの助成金の一部によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
解剖するためのカメラ、例えば
顕微鏡ライカを
ファイン(デュモン#5)鉗子ファインサイエンスツール11254-20
ガラスピペットVWR14672-608
画像解析ソフト画像J/FIJIImageJ / FIJIは無料でダウンロードできます:https://imagej.net/Welcome< / a>
メチルセルロースシグマM0387
パラホルムアルデヒドシグマアルドリッチP6148
リン酸緩衝生理食塩水さまざまなサプライヤー
ピペットポンプVWR53502-233
プラスチックペトリ皿USA Scientific Inc2906
Pyrex 9 ウェル丸底ガラス皿VWR89090-482
ファイルを見失うためのソフトウェアR プロジェクトR は無料でダウンロードできます: https://www.r-project.org/
>Scientific グラフ作成および統計ソフトウェアGraphPad プリズム
スプレッドシート プログラムMicrosoft Excel
トリカイン メタンスルホン酸 (Tricaine-S)Western Chemical200-226
非常に細かい (Dumont #55) 鉗子Fine Science Tools11255-20
顕微鏡ライカを解剖する、例えば

参考文献

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