チャネルロドプシン支援回路マッピング(CRACM)は、解剖学的および/または遺伝的に同定されたニューロン群間の長距離神経細胞突起の機能的マッピングのための精密技術である。ここでは、CRACMを利用して、赤ずれたオプシンChrimsonRの使用を含む聴覚脳幹接続をマッピングする方法について説明する。
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この記事について
サマリー
要約
神経回路を調査する際、in vitroパッチクランプアプローチの標準的な制限は、複数のソースからの軸索がしばしば混合され、電気刺激で個々のソースからの入力を分離することが困難になることである。しかし、チャネルロドプシンアシスト回路マッピング(CRACM)を使用することで、この制限を克服することができます。ここでは、CRACMを使用して、聴覚系の中脳核である下級神経核(IC)の同定されたクラスのニューロンへの下聴覚脳幹核からの昇順入力とコミュニキュラス入力をマッピングする方法を報告する。ICでは、局所的、コミュニシャル、昇順、降順の軸索が大きく絡み合っているので、電気刺激と区別がつかない。シナプス前核にチャネルロドプシンの発現を駆動するウイルス構築物を注入し、続いてパッチクランプ記録を用いてチャネルロドプシン発現シナプス入力の存在および生理学を特徴付け、特定のソースからの突起特定のICニューロン集団に細胞型特異的な精度でマッピングすることができる。このアプローチは、青色の光活性化チャネルロドプシンであるクロノスと、赤くシフトしたチャネルロドプシンであるChrimsonRの両方で機能することを示しています。前脳からの以前の報告とは対照的に、ChrimsonRは高部人工内核主体ニューロンの軸索を強く人身売買し、ChrimsonRが脳幹におけるCRACM実験に有用なツールである可能性があることを示している。ここで提示されるプロトコルには、頭蓋内ウイルス注射手術の詳細な説明が含まれており、後部人工内核への注射とマウスのICを標的化するための立体質座標、および細胞全体のパッチクランプ記録を組み合わせる方法チャネルロドプシンの活性化を用いて、ICニューロンへの長距離突起を調査する。このプロトコルは、ICへの聴覚入力を特徴付けるために調整されていますが、聴覚脳幹およびそれ以降の他の長距離予測を調査するために容易に適応することができます。
概要
シナプス接続は神経回路機能にとって重要ですが、神経回路内のシナプスの正確なトポロジーと生理学は、実験的に探査することはしばしば困難です。これは、細胞電気生理学の伝統的なツールである電気刺激が、刺激部位の近くで軸索を無差別に活性化し、ほとんどの脳領域において、異なる供給源(局所的、上昇的、および/または降順)からの軸索が絡み合うからです。しかし、チャネルロドプシンアシスト回路マッピング(CRACM)1、2を使用することで、この制限を克服することができます3.チャネルロドプシン(ChR2)は、緑色藻クラウィドマス・ラインハルティに本来見られる活性化された、カチオン選択性イオンチャネルである。ChR2は、450〜490nmの波長の青色光によって活性化され、カチオン流入を介して細胞を脱分極することができる。ChR2は、まず、ナーゲルおよび同僚4によってゼノプス卵母細胞で記述および発現した。その直後、Boydenたちは5人が哺乳類のニューロンでChR2を発現し、光パルスを使用してミリ秒のタイムスケールでスパイクを確実に制御できることを示し、青色光でChR2を活性化した後、作用電位〜10msを誘発した。さらに速い運動学を持つ光遺伝学的チャネルが最近発....
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プロトコル
地域の機関動物管理利用委員会(IACUC)の承認を得て、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドラインを遵守する。このプロトコルのすべての手順は、ミシガン大学IACUCによって承認され、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドラインに従っていました。
1. 手術の準備
- 無菌状態で手術を行う。オートクレーブ/手術前に全ての手術用具および材料を殺菌する。手術用のガウンとマスクを着用してください。
- 手術領域を消毒し(70%エタノールでスプレーして拭き取る)、手術領域をカバーするために無菌タオルドレープを置きます。
- 回復ケージを準備します。窒息の危険を制限するためにケージの寝具を取り外す。ケージの下にヒーティングパッドを置きます。食料と水源を提供する。
- ピペットプーラーのナノインジェクター用のガラス毛細管を引っ張ります。引っ張りプロセス中の加熱フィラメントの強熱は、ガラス毛細血管を殺菌します。先端を切るか、または切り落とし、直径約5μmの開口部を得る。
- 約30°の角度に毛細血管の先端をベベルし、組織の浸透を改善し、詰まりを減らします。毛細血管を鉱物油でバックフィルし、ナノリットルのインジェクターに挿入します。
- 所望のチャネルロドプシンコードrAAVのアリコートを得て、滅菌PBSを用いて所望の力剤に希釈する。
注:セロタイプ1 rAAVは、聴覚脳幹核のトランスフ....
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結果
VIP-IRES-Creマウス(Viptm1(cre)Zjh/J)とAi14クレレポーターマウス(B6)を横断しました。CG-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)は、VIPニューロンが蛍光タンパク質tdTomatoを発現するF1子孫を生成する。いずれかの性のF1子孫を使用し、出生後日(P)21〜P70を老化させた。この研究では合計22匹の動物が使用された。
AAV1の立体性注入。表1に示す座標を用いてVIP-IRES-Cre x Ai14マウスの右ICにSyn.Chronos-GFP.WPRE.bGHを行い、右ICにおいて強いクロノス-EGFP発現を生じる(図2A)。クロノス-EGFP蛍光の目視検査は、右ICで.......
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ディスカッション
我々は、CRACMがマウスICのニューロンに対する長距離シナプス入力を同定し、特徴付けるための強力な技術であることを発見した。ここで詳述したプロトコルに従って、DCNおよびICのニューロンの堅牢なトランスフェクションと、クロノスおよびChrimsonRのICにおけるシナプス末端への信頼性の高い軸索密転写を達成した。さらに、この技術により、PSP振幅、半角、減衰時間、受容体薬理学などの後起事象の測定と解析が可能であることを実証した。我々の経験は、このアプローチが聴覚脳幹およびそれ以降の機能回路マッピング実験を行うために容易に適応できることを示唆している。
全体として、光遺伝学的回路マッピングの特異性は、軸索の電気刺激に対して明確な利点を提供する。ウイルストランスフェクションは、シナプス前ニューロンの標的集団に対するチャネルロドプシンの発現を空間的および分子的に制限する能力を提供する。対照的に、電気刺激は、ほとんどの脳領域の場合と同様に、それらの軸索が混ざっているときに、異なるシナプス前核から生じる軸索を区別することはできません。電気刺激はまた、オルソドローミックおよび抗ドロミックスパ.......
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開示事項
著者たちは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、ドイツフォルシュングスゲインシャフトリサーチフェローシップ(GO 3060/1-1、プロジェクト番号401540516、DG)と国立衛生研究所補助金R56 DC016880(MTR)によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AAV1です。Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14レポーターマウス(B6.CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | ジャクソン研究所 | 在庫#007914 | |
| 琥珀色(590nm)LUXEON反逆型LED | LuxeonスターLED | SP-01-A8 | |
| 青色(470nm)LUXEON反逆型LED | LuxeonスターLED | SP-01-B4 | |
| Carproject(carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glasキャピラリー | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| ドラモンド ナノジェクト 3 | ドラモンド サイエンティフィック | カンパニー 3-300-207 | |
| 電極ベベラー | サッター器具 | FG-BV10-D | |
| エチロン 6-0 (0.8 メートル法) ナイロン縫合糸 | エチコン | 地元の薬局 | |
| 固定ステージ顕微鏡 | 任意の | n/a | |
| ガス麻酔ヘッドホルダー | デビッド・コップフ器械 | 933-B | |
| 一般外科用具 | ファイン サイエンス ツール | N/A | |
| ゴールデン A5 ペット クリッパー | オスター | 078005-010-003 | |
| ヒーティングパッド | カスタムビルド | N/A | |
| フード付き誘導チャンバー 真空システム付き | パターソン サイエンティフィック | 78917760 | |
| ホットビーズ滅菌器 Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| ヨウ素溶液10% | MedChoice | 地元の薬局 | |
| イソフルラン気化器 | パターソンサイエンティフィック | 07-8703592 | |
| ドカイン局所ゼリー2% | Akorn | 地元の薬局 | |
| マイクロモータードリル1050 | リーシャインアニマルヘルス | 7094351 | |
| マイクロモータードリルビット0.5ミリメートル | ファインサイエンスツール | 19007-05 | |
| 電動マイクロマニピュレーター | サッターインスツルメント | MP-285/R | |
| 眼科用軟膏 人工涙液 | アコーン | 地元の薬局 | |
| P-1000 電極プーラー | サッターインスツルメント | P-1000 | |
| パッチクランプアンプ データ収集ソフトウェアを含む | 任意の | n/a | |
| ポータブル麻酔器 | パターソン科学 | 07-8914724 | |
| 小動物steroetaxicフレーム | デビッドKopf Instruments | 930-B | |
| 標準的な化学物質 | 地元のベンダー | N / A | |
| 標準イメージングソリューション | |||
| 滅菌タオル | drapes Dynarex | 4410 | |
| サージカルマーカー | ファインサイエンスツール | 18000-30 | |
| 温度調節器 | カスタムビルド | N/A | |
| ビブラトーム | 任意の | n/a | |
| VIP-IRES-Cre マウス (Viptm1(cre)Zjh/J) | ジャクソン研究所 | 在庫 #010908 | |
| ウォーターバス | 任意の | n/a |
参考文献
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M.
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再版と許可
