方法論記事

青色および赤色シフトチャネル性肝炎を伴う下コリキュラスニューロンの長距離チャネル性チャネル化補助回路マッピング

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DOI：

10.3791/60760

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2020年2月7日

 , 
1Kresge Hearing Research Institute, Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Michigan

この記事について

サマリー

チャネルロドプシン支援回路マッピング(CRACM)は、解剖学的および/または遺伝的に同定されたニューロン群間の長距離神経細胞突起の機能的マッピングのための精密技術である。ここでは、CRACMを利用して、赤ずれたオプシンChrimsonRの使用を含む聴覚脳幹接続をマッピングする方法について説明する。

要約

神経回路を調査する際、in vitroパッチクランプアプローチの標準的な制限は、複数のソースからの軸索がしばしば混合され、電気刺激で個々のソースからの入力を分離することが困難になることである。しかし、チャネルロドプシンアシスト回路マッピング(CRACM)を使用することで、この制限を克服することができます。ここでは、CRACMを使用して、聴覚系の中脳核である下級神経核(IC)の同定されたクラスのニューロンへの下聴覚脳幹核からの昇順入力とコミュニキュラス入力をマッピングする方法を報告する。ICでは、局所的、コミュニシャル、昇順、降順の軸索が大きく絡み合っているので、電気刺激と区別がつかない。シナプス前核にチャネルロドプシンの発現を駆動するウイルス構築物を注入し、続いてパッチクランプ記録を用いてチャネルロドプシン発現シナプス入力の存在および生理学を特徴付け、特定のソースからの突起特定のICニューロン集団に細胞型特異的な精度でマッピングすることができる。このアプローチは、青色の光活性化チャネルロドプシンであるクロノスと、赤くシフトしたチャネルロドプシンであるChrimsonRの両方で機能することを示しています。前脳からの以前の報告とは対照的に、ChrimsonRは高部人工内核主体ニューロンの軸索を強く人身売買し、ChrimsonRが脳幹におけるCRACM実験に有用なツールである可能性があることを示している。ここで提示されるプロトコルには、頭蓋内ウイルス注射手術の詳細な説明が含まれており、後部人工内核への注射とマウスのICを標的化するための立体質座標、および細胞全体のパッチクランプ記録を組み合わせる方法チャネルロドプシンの活性化を用いて、ICニューロンへの長距離突起を調査する。このプロトコルは、ICへの聴覚入力を特徴付けるために調整されていますが、聴覚脳幹およびそれ以降の他の長距離予測を調査するために容易に適応することができます。

概要

シナプス接続は神経回路機能にとって重要ですが、神経回路内のシナプスの正確なトポロジーと生理学は、実験的に探査することはしばしば困難です。これは、細胞電気生理学の伝統的なツールである電気刺激が、刺激部位の近くで軸索を無差別に活性化し、ほとんどの脳領域において、異なる供給源(局所的、上昇的、および/または降順)からの軸索が絡み合うからです。しかし、チャネルロドプシンアシスト回路マッピング(CRACM)1、2を使用することで、この制限を克服することができます3.チャネルロドプシン(ChR2)は、緑色藻クラウィドマス・ラインハルティに本来見られる活性化された、カチオン選択性イオンチャネルである。ChR2は、450〜490nmの波長の青色光によって活性化され、カチオン流入を介して細胞を脱分極することができる。ChR2は、まず、ナーゲルおよび同僚4によってゼノプス卵母細胞で記述および発現した。その直後、Boydenたちは5人が哺乳類のニューロンでChR2を発現し、光パルスを使用してミリ秒のタイムスケールでスパイクを確実に制御できることを示し、青色光でChR2を活性化した後、作用電位〜10msを誘発した。さらに速い運動学を持つ光遺伝学的チャネルが最近発見されました(例えば、クロノス6)。

CRACM実験の基本的なアプローチは、チャネルロドプシンの遺伝情報を運ぶ組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)を用いて推定シナプス前ニューロンの集団をトランスフェクトすることです。rAAVを伴うニューロンのトランスフェクションは、コード化されたチャネルロドプシンの発現をもたらす。典型的には、チャネロドプシンはGFP(緑色蛍光タンパク質)またはtdTomato(赤色蛍光タンパク質)のような蛍光タンパク質でタグ付けされ、標的領域におけるニューロンのトランスフェクションが蛍光イメージングで容易に確認できるようになる。rAAVは非病原性であるため、炎症性の可能性が低く、長持ちする遺伝子発現7,8は、チャネルロドプシンをニューロンに送達する標準的な技術となっている。推定シナプス前集団のニューロンのトランスフェクション後、光を介したチャレロドプシンの活性化が標的ニューロン内の後摘出電位または電流を引き起こす場合、これはトランスフェクトされた核から記録された細胞への軸索接続の証拠である。脳スライス実験で切断された軸索は、チャネロドプシン活性化を通じて神経伝達物質を放出するために駆動することができるので、急性スライスの外側にあるが、後起腺脳領域に軸索を送る核はCRACMで同定することができる。この技術の力は、同定された長距離シナプス入力の接続性および生理学を直接調査することができるということです。

青色光によって興奮性であるチャネルロドプシンに加えて、研究者は最近、Chrimsonとその高速アナログChrimsonRを含むいくつかの赤ずれたチャネルロドプシン9、10を同定しました。赤い光が青色光よりも組織に浸透し、赤色光が青色光10、11、12よりも低い細胞毒性を有することがあるため、赤ずれたオプシンは関心がある。赤ずされたチャネルロドプシンはまた、同じニューロン上の異なる核からの軸索の収束を1つの実験6、13、14でテストすることができる二重色CRACM実験の可能性を開く。しかし、現在の赤ずれたオプシンは、青色光15,16,17で不要な交差活性化を示すことが多く、2つの色の実験が困難である。さらに、いくつかの報告は、ChrimsonRが限られた軸索密売を受けることを示しており、CRACM実験16、17にChrimsonRを使用することは困難である可能性があります。

下聴覚脳幹核からのほぼすべての上昇予測は、中央聴覚経路の中脳ハブである下眼コリキュラス(IC)に収束する。これには、人工内核(CN)18,19、大部分の優れたオリバリー複合体(SOC)20、側方レムニスカス21の後側(DNLL)および腹側(VNLL)核からの突起が含まれる。さらに、聴覚皮質からの大きな下降投影は、IC18、19、20、21、22で終了し、ICニューロン自体はIC23の局所および逆側葉内に広くシナプスを行う。多くのソースからの軸索の混ざり合いは、電気刺激24を使用してIC回路を探査することが困難になっている。その結果、ICのニューロンは音声局在化や音声などの通信音の同定に重要な計算を行っても、ICにおける神経回路の構成はほとんど知られていない。我々は最近、IC27における最初の分子的同定可能なニューロンクラスとしてVIPニューロンを同定した。VIPニューロンは、聴覚視床や優れたコリキュラスを含むいくつかの長距離標的に投影するグルタミン酸星状ニューロンである。VIPニューロンへの局所および長距離入力のソースと機能を決定し、これらの回路接続が音処理にどのように寄与するかを判断できるようになりました。

ここで提示されたプロトコルは、マウスのIC、特にコントラテータICとDCN(図1)のVIPニューロンへのシナプス入力を調査するために調整されています。プロトコルは、入力の異なるソース、異なるニューロンタイプまたはまったく異なる脳領域に簡単に適応することができます。また、ChrimsonRは、聴覚脳幹における長距離回路マッピングに有効な赤シフトチャネルロドプシンであることを示す。しかし、ChrimsonRは低強度でも青色光によって強く活性化され、したがって、2色CRACM実験でChrimsonRとクロノスを組み合わせるには、ChrimsonRのクロス活性化を防ぐために慎重な制御を使用する必要があることを実証する。

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プロトコル

地域の機関動物管理利用委員会(IACUC)の承認を得て、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドラインを遵守する。このプロトコルのすべての手順は、ミシガン大学IACUCによって承認され、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドラインに従っていました。

1. 手術の準備

  1. 無菌状態で手術を行う。オートクレーブ/手術前に全ての手術用具および材料を殺菌する。手術用のガウンとマスクを着用してください。
  2. 手術領域を消毒し(70%エタノールでスプレーして拭き取る)、手術領域をカバーするために無菌タオルドレープを置きます。
  3. 回復ケージを準備します。窒息の危険を制限するためにケージの寝具を取り外す。ケージの下にヒーティングパッドを置きます。食料と水源を提供する。
  4. ピペットプーラーのナノインジェクター用のガラス毛細管を引っ張ります。引っ張りプロセス中の加熱フィラメントの強熱は、ガラス毛細血管を殺菌します。先端を切るか、または切り落とし、直径約5μmの開口部を得る。
  5. 約30°の角度に毛細血管の先端をベベルし、組織の浸透を改善し、詰まりを減らします。毛細血管を鉱物油でバックフィルし、ナノリットルのインジェクターに挿入します。
  6. 所望のチャネルロドプシンコードrAAVのアリコートを得て、滅菌PBSを用いて所望の力剤に希釈する。
    注:セロタイプ1 rAAVは、聴覚脳幹核のトランスフェクションに適していることがわかりました。具体的には、公的にアクセス可能なリポジトリおよびベクターコアから入手可能なrAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH(青色光活性化チャネルロドプシン)およびrAAV1.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH(赤シフトチャネルロドプシン)、およびrAAV1.Syn.CONOs-WPRE.bGH、CRACM実験に必要な高発現レベルと良好な長距離軸索密売を一貫して生み出す。
  7. インジェクタの指示に従って、滅菌PBSのrAAVを1〜3μLで前面充填します。

2. 手術

  1. 誘導室に動物を入れ、較正されたイソファフルラン気化器を介して送達された酸素中の3%イソファフルランで麻酔を誘発する。呼吸が深く遅くなり、つま先のピンチ反射が存在しないまで、マウスを観察します, 約 3-5 分.
  2. 動物を立体性フレームに移します。ガス麻酔マスクで口蓋バーに口を置き、両方の外耳道に非穿水耳バーを配置することによって、動物の頭を固定します。
  3. 直腸温度プローブを挿入し、恒温温度コントローラに切り替えます。
  4. 眼の軟膏を塗布して、眼が乾燥するのを防ぎます。
  5. 先制性鎮痛(例えば、5mg/kgカルプロフェンの皮下注射)を投与する。
  6. 麻酔状態の深さに応じて、イソファフルランを1〜2.5%に調整します。処置の間少なくとも15分ごとに粘膜の温度、呼吸および色を監視する。
  7. 電気切りこで頭皮を剃ります。無菌的にポビドネヨウ素と70%エタノールの3つの交互の綿棒で頭皮を準備します。
  8. 耳の間から始まり、目にロストラルを続ける正中線に沿って頭皮に切開し、ラムダとブレグマの縫合糸を露出させる。皮膚を横に押し出し、必要に応じて露出した骨から骨膜を取り除きます。
  9. 無菌手術マーカーでラムダ縫合糸をマークし、ナノインジェクターの先端をラムダに触れるだけになるように配置し、マイクロマニピュレータ座標をゼロにします。ナノインジェクターチップとマイクロマニピュレータを使用して、ラムダとブレグマの縫合糸の標高差を測定します。ラムダとブレグマを±100μmの高さの差に合わせるには、口蓋バーの高さを調整します。
  10. ナノインジェクター先端とマイクロマニピュレータ座標系を使用して注射部位をマッピングし、滅菌手術マーカーでサイトをマークします。P21-P30マウスのICまたはDCNを注入するには、表1に示すように、ラムダ縫合糸に対する座標を使用する。座標の Z 深さは、ラムダの頭蓋骨の表面から測定されます。
  11. 無菌の0.5mmドリルバリを備えたマイクロモータードリルを使用して、注射部位に対して開頭術を行います。
  12. 標的核内のニューロンの広いトランスフェクションを確実にするために、組織に様々な深さで注射を行い(表1、Z座標)、そして、ICのような大きな脳領域の場合には、異なるXおよびY座標で2つ以上の貫入の過程で注射を行う(表1、右IC浸透1および右IC貫入2)。
  13. 注射を実行します。IC注射の場合、2,250 μm から 1750 μm の深さの Z 軸(注入深度)に沿って 250 μm の間隔で 20 nL のウイルスを沈着させます。DCN注射の場合、それぞれ4,750μmと4,550μmの深さで20 nLのウイルスを堆積させます。
  14. 各Z座標で注入した後、2〜3分待ってから、インジェクタを次のZ座標に移動します。これにより、ウイルスが注射部位から拡散する時間が与えられるため、ナノインジェクターの位置が変わったときにウイルスが注射管を吸い上げられる可能性が低下します。
  15. 浸透で最後の注入の後、脳からナノインジェクターを引き込む前に3〜5分待ちます。
  16. ナノインジェクターが脳から侵入と動物の間で取り除かれたら、チップから少量のウイルスを排出して、先端が詰まっていないかどうかを確認します。
  17. 注射後、滅菌PBSを使用して頭皮の切り取った縁を濡らし、皮膚を正中線に向かってゆっくりと戻します。6-0(0.7メートル)ナイロン縫合を使用して、単純な中断縫合糸で創傷を閉じます。
  18. 創傷に0.5~1 mLのリドカインゲルを塗布します。
  19. イヤーバーと温度プローブを取り外し、イソファフルランをオフにし、マウスを口蓋バーから取り出し、回復ケージに移します。
  20. 回復を注意深く監視します。動物が完全に目を覚まし、動き回り、痛みや苦痛の兆候を示さないと、ケージに戻し、ケージをビバリウムに戻します。
  21. 手術が1日で複数の動物に対して行われる場合は、ホットビーズ滅菌装置を使用して手術ツールを消毒し、次の手術前にバリを掘削してください。

3. 外科的フォローアップ

  1. 今後10日間の創傷閉鎖、感染、または痛みや苦痛の兆候がないか毎日動物をチェックし、施設の動物ケアガイドラインに準拠しています。
  2. 実験で動物を使用して、チャネロドプシンの最適な発現を可能にする前に3〜4週間待つ。

4. 脳スライスの準備と注射ターゲットの確認

  1. CRACMに関しては、トランスフェクト動物由来の鋭発性脳スライスを標準のin vitro電気生理学実験で使用し、ここで簡単に説明する(より詳細な説明については2019年Goyer et al. 2019参照)。
  2. (mMで)を含む人工脳脊髄液(ACSF)を調製する:125 NaCl、12.5 D-グルコース、25 NaHCO3、3KCl、1.25 NaH2PO 4、1.5 CaCl2、1MgSO4。95% O2中 5%CO2で 7.4 の pH に ACSF をバブルします。
  3. インビトロ電気生理学を含む以下のすべてのステップを、暗闇または赤色光の中で行い、チャネルロドプシンの活性化を制限します。
  4. イソファフルランでマウスを深く麻酔し、素早く切断します。~34 °CのACSFで脳を素早く解剖する。
  5. 振動マイクロトームでICを~34°CのACSFに含むコロナスライス(200〜250μm)を切り、ACSFを充填した保持室で34°Cで34°Cでスライスをインキュベートし、5%CO2で泡立て、95%O2で。インキュベーション後、スライスは、記録に使用されるまで室温で保存します。
  6. 注射対象がICでない場合は、注入された脳領域の追加のコロナスライスを切断し、蛍光顕微鏡下で標的核のトランスフェクションを確認する。標的核にトランスフェクションが存在しない場合、または異なる脳領域に追加のトランスフェクションがない場合は、実験を続けないでください。

5. インビトロ記録とCRACM実験

注:クロノスとChrimsonRの光学刺激を提供するために、我々は顕微鏡の上蛍光ポートに結合されたLEDを使用しています。ただし、LED の代わりにレーザーを使用できます。レーザーを使用する場合は、機関の安全担当者から事前の承認を得て、安全なレーザー使用のための適切なガイドラインに従ってください。

  1. ホウケイ酸ガラスから3.5-4.5 MΩの抵抗まで電極を引き抜きます。電極内部溶液は(mMで)含むべきである:115 K-グルコン酸塩、 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na2ホスホクレアチン, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, 0.1% バイオサイチン(w/v),pHはKOHで7.3に調整し、オスモラーリティをスクロースで290mOsm/kgに調整した。
  2. 録音を行う場合は、標準のパッチ クランプ方法を使用します。固定ステージ直立顕微鏡下の記録室にスライスを置き、ACSFを約2 mL/minで連続的に浸透させ、生理学的温度(約34〜36°C)近くの記録を行います。
  3. 適切なパッチクランプ増幅器を使用して、視覚制御下のパッチニューロン。シリーズ抵抗、ピペットキャパシタンス、液体接合電位を補正します。
  4. 全細胞記録中に、市販のLEDを通して580nm光の短いパルスによって470 nm光またはChrimsonRの短いパルス(1-5ミリ秒)を送達することによってクロノスを活性化する。オプシン活性化の閾値を決定し、最小刺激プロトコルを使用して後月日電位を惹起する。一般に、PSP を引き出す最短の刺激持続時間を使用し、PSP を引き出すために必要なしきい値電力の 120% に光電力を設定します。
  5. 記録された膜電位の変化が実際にニューロンへのシナプス入力であることを確認するために、興奮性/抑制性後ナップ受容体の標準的なアンタゴニストを実験中に洗浄することができる。PSPに対する異なる受容体寄与(例えばNMDA対AMPA受容体)を調べるには、適切な受容体拮抗薬を洗浄することができる。各受容体拮抗薬について、薬物効果は洗い流した後に逆転する必要があります。
  6. PSPの遅延、ジッター、信頼性を使用して、光活性化シナプス入力が、介在するチャネルロドプシン発現シナプスの活性化とは対照的に、記録されたニューロン上のシナプスの直接的な光学活性化に由来することを確認する記録されたニューロンにシナプスニューロン.一般に、低遅延 (<2 ミリ秒)、低ジッタ (遅延時間の標準偏差は <1 ミリ秒)、高信頼性 (>50%)シナプス前ニューロンを発現するチャネルロドプシンから記録されたニューロンへの直接的なシナプス接続を示す。

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結果

VIP-IRES-Creマウス(Viptm1(cre)Zjh/J)とAi14クレレポーターマウス(B6)を横断しました。CG-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)は、VIPニューロンが蛍光タンパク質tdTomatoを発現するF1子孫を生成する。いずれかの性のF1子孫を使用し、出生後日(P)21〜P70を老化させた。この研究では合計22匹の動物が使用された。

AAV1の立体性注入。表1に示す座標を用いてVIP-IRES-Cre x Ai14マウスの右ICにSyn.Chronos-GFP.WPRE.bGHを行い、右ICにおいて強いクロノス-EGFP発現を生じる(図2A)。クロノス-EGFP蛍光の目視検査は、右ICで...

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ディスカッション

我々は、CRACMがマウスICのニューロンに対する長距離シナプス入力を同定し、特徴付けるための強力な技術であることを発見した。ここで詳述したプロトコルに従って、DCNおよびICのニューロンの堅牢なトランスフェクションと、クロノスおよびChrimsonRのICにおけるシナプス末端への信頼性の高い軸索密転写を達成した。さらに、この技術により、PSP振幅、半角、減衰時間、受容体薬理学などの後起事象の測定と解析が可能であることを実証した。我々の経験は、このアプローチが聴覚脳幹およびそれ以降の機能回路マッピング実験を行うために容易に適応できることを示唆している。

全体として、光遺伝学的回路マッピングの特異性は、軸索の電気刺激に対して明確な利点を提供する。ウイルストランスフェクションは、シナプス前ニューロンの標的集団に対するチャネルロドプシンの発現を空間的および分子的に制限する能力を提供する。対照的に、電気刺激は、ほとんどの脳領域の場合と同様に、それらの軸索が混ざっているときに、異なるシナプス前核から生じる軸索を区別することはできません。電気刺激はまた、オルソドローミックおよび抗ドロミックスパ...

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開示事項

著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、ドイツフォルシュングスゲインシャフトリサーチフェローシップ(GO 3060/1-1、プロジェクト番号401540516、DG)と国立衛生研究所補助金R56 DC016880(MTR)によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AAV1です。Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGHAddgene59171-AAV1
AAV1。Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGHAddgene59170-AAV1
Ai14レポーターマウス(B6.CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)ジャクソン研究所在庫#007914
琥珀色(590nm)LUXEON反逆型LEDLuxeonスターLEDSP-01-A8
青色(470nm)LUXEON反逆型LEDLuxeonスターLEDSP-01-B4
Carproject(carprofen)Henry Schein Animal Health59149
Drummond glasキャピラリーDrummond Scientific Company3-000-203-G/X
ドラモンド ナノジェクト 3ドラモンド サイエンティフィックカンパニー 3-300-207
電極ベベラーサッター器具FG-BV10-D
エチロン 6-0 (0.8 メートル法) ナイロン縫合糸エチコン地元の薬局
固定ステージ顕微鏡任意のn/a
ガス麻酔ヘッドホルダーデビッド・コップフ器械933-B
一般外科用具ファイン サイエンス ツールN/A
ゴールデン A5 ペット クリッパーオスター078005-010-003
ヒーティングパッドカスタムビルドN/A
フード付き誘導チャンバー 真空システム付きパターソン サイエンティフィック78917760
ホットビーズ滅菌器 Steri 250InotechIS-250
ヨウ素溶液10%MedChoice地元の薬局
イソフルラン気化器パターソンサイエンティフィック07-8703592
ドカイン局所ゼリー2%Akorn地元の薬局
マイクロモータードリル1050リーシャインアニマルヘルス7094351
マイクロモータードリルビット0.5ミリメートルファインサイエンスツール19007-05
電動マイクロマニピュレーターサッターインスツルメントMP-285/R
眼科用軟膏 人工涙液アコーン地元の薬局
P-1000 電極プーラーサッターインスツルメントP-1000
パッチクランプアンプ データ収集ソフトウェアを含む任意のn/a
ポータブル麻酔器パターソン科学07-8914724
小動物steroetaxicフレームデビッドKopf Instruments930-B
標準的な化学物質地元のベンダーN / A
標準イメージングソリューション
滅菌タオルdrapes Dynarex4410
サージカルマーカーファインサイエンスツール18000-30
温度調節器カスタムビルドN/A
ビブラトーム任意のn/a
VIP-IRES-Cre マウス (Viptm1(cre)Zjh/J)ジャクソン研究所在庫 #010908
ウォーターバス任意のn/a
リヘン的な

参考文献

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