ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

Summary

この研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。

Abstract

胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、顔面変形および神経障害を含むエタノール誘発発達欠陥の非常に可変的な連続体を記述する。複雑な病理を持つFASDは、毎年米国で生まれた約100人に1人の子供に影響を与えます。FASDの非常に可変的な性質のために、動物モデルはエタノール誘発開発欠陥の私達の現在の機械論的理解の重大な証明された。ゼブラフィッシュを使ってエタノールによる発達欠陥を調べることに焦点を当てた研究室が増えています。ゼブラフィッシュは、外部受精、遺伝的に引っ張り可能な半透明の胚を多数産生する。これにより、研究者は複数の遺伝的文脈でエタノール暴露のタイミングと投与量を正確に制御し、ライブイメージング技術を通じて胚性エタノール暴露の影響を定量化することができます。これは、遺伝学とヒトとの発達の両方の高度な保全と相まって、ゼブラフィッシュがエタノール催奇性の機械学的基礎を研究する強力なモデルであることが証明されている。しかし、エタノール暴露レジメンは、これらの研究全体でゼブラフィッシュデータの解釈を混乱させている異なるゼブラフィッシュ研究の間で変化している。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を定量するプロトコルを示します。

Introduction

胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、胚性エタノール暴露¹に関連する幅広い神経障害および頭蓋顔面異形について説明する。エタノール暴露および遺伝的背景のタイミングと投与量を含む複数の要因は、FASD^2、3の変動に寄与する。人間では、これらの変数の複雑な関係は、FASDの病因を研究し、理解することは困難です。動物モデルは、エタノール催奇形性の機械論的基礎に関する我々の理解を深める上で極めて重要であることが証明されている。多種多様な動物モデルシステムがFASDの複数の側面を研究するために使用されており、結果はヒト⁴の暴露に見られるものと著しく一致している。げっ歯類モデルシステムは、マウスが最も一般的な^5、6、7である、FASDの多くの側面を調べるために使用されます。この研究の大半は、初期エタノール暴露⁸に対する発達欠陥に焦点を当てているが、エタノールへの後の暴露は、同様に9の発達異常を引き起こすことが示^{されている。}さらに、マウスの遺伝的能力は....

Protocol

この手順で使用されるすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル²⁷に従って飼育および飼育された。これらのプロトコルは、テキサス大学オースティン校とルイビル大学によって承認されました。

注:ゼブラフィッシュラインTg(fli1:EGFP)y1は、この研究で使用されました²⁸.この手順で使用されるすべての水は、滅菌逆浸透水である。すべての統計分析はグラフパッドプリズムv8.2.1を使用して行われました。

1. 胚培地の作成

1. 20xの胚培地を作るためには、NaClの17.5 g、KClの0.75g、CaCl₂の2.9g、K₂HPO 4の0.41g、NA₂HPO₄の0.142g、およびMgSO4·7H2 Oの4.9gを1Lの水に溶解させる。形成される白色の沈殿物は無視してください。これはメディアに影響しません。ストック液をフィルター殺菌し、4°Cで保管します。
2. 働く胚培地溶液を作成するには、NaHCO₃の1.2 gを20倍の胚培地ストックの1 Lに溶解し、19 Lの....

Results

血中エタノール濃度は、完全に形成された循環系を欠いているため、初期の胚ゼブラフィッシュでは決定できません。ゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度のレベルを決定するために、エタノールレベルは均質化された胚組織から直接測定される。胚性エタノール濃度を適切に測定するには、胚量を考慮する必要があります。胚(卵黄付)は、胎児の体液で囲まれた絨毛膜(卵殻)の中に位置しています(図1)。胚の体積測定は、胚のサイズが大きくなるにつれて発生時間にわたって胚の体積が変化するため、暴露時に胚に対して行われなけである。さらに、これらの要素の両方が胚性エタノールレベルを計算するために使用される希釈因子を作成するので、胚の処理方法は、胚量と同様に考慮する必要があります。

胚は完全な球体ではないので、特に10hpfの後、水の変位は胚の体積を評価するために使用された。この研究は、24 hpfで胚を使用しました。絨毛膜の胚量と絨毛膜から取り出された胚の体積を測定した。これらの体積は、胚外液を有する胚に対して1.97(±0.4SD)μL、胚単独で1.1(±0........

Discussion

開発モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは環境要因が開発に及ぼす影響を研究するのに理想的です。彼らは、エタノール研究で正確なタイミングと投与パラダイムを可能にする外部受精胚の多数を生成します。これは、ライブイメージング能力と人間との遺伝的および発達的保全と組み合わせることで、ゼブラフィッシュを気象学研究のための強力なモデルシステムにします。記載されているは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚を開発する際の胚性エタノール濃度を測定するためのプロトコルである。

胚性エタノール濃度を決定することは、エタノールが発達中の胚に及ぼす影響を理解する上で重要です。げっ歯類モデルでは、血中エタノール濃度は組織濃度²⁶に相関する。しかし、ゼブラフィッシュの初期胚発生における血中エタノール濃度を評価することは不可能である。ヘッドスペースガスクロマトグラフィーは、ゼブラフィッシュ25、30、3.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
大学への契約により供給	空気
分析天びん	VWR	10204-962
オートサンプラー、CP-8400	バリアン		ガスクロマトグラフ オートサンプラー
塩化カルシウム	VWR	97062-590
エタノール	デコンラボ	2701
ポリテトラフルオロエチレン/シリコンセプタムとプラスチックキャップ付きガスクロマトグラフバイアル 2mL	Agilent	8010-0198	洗浄後にバイアルを再利用できますが、キャップ/セプタムは再利用できません
ガスクロマトグラフ、CP-3800	バリアン
ヘリウム			大学
HP Innowaxキャピラリーカラム	Agilent	19095N-123I	30 m x 0.53 mm x 1.0 &mフィルム厚
ヒュルドゲン			大学への契約により提供
硫酸マグネシウム(七水和物)	フィッシャーサイエンティフィック	M63-500
マイクロ遠心チューブ 1.5 mL	フィッシャーサイエンティフィ	2682002
マイクロピペットチップ 10 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611106
マイクロピペットチップ 1000 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611127
マイクロピペットチップ 200 μL	フィッシャーサイエンティフィ	13611112
ペトリ皿 100 mm	フィッシャーサイエンティフィ	FB012924
ピペットマン L p1000L マイクロピペット	ギルソン	FA10006M
ピペットマン L p200L マイクロピペット	ギルソン	FA10005M
ピペットマン L p2L マイクロピペット	ギルソン	FA10001M
ポリテトラフルオロエチレン/シリコンセプタムプラスチックキャップ	Agilent	5190-7021	ガスクロマトグラフバイアルの交換用キャップ/セプタム
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	P217-500
リン酸カリウム (二塩基性)	VWR	BDH9266-500G
Pronase	VWR	97062-916
シリカビーズ .5 mm	Biospec 製品	11079105z
シリカビーズ1.0 mm	Biospec 製品	11079110z
重炭酸	VWR	BDH9280-500G
塩化ナトリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	S271-500
リン酸ナトリウム (二塩基性)	フィッシャー・サイエンティフィ	S374-500
固相マイクロ抽出繊維アセンブリ カルボクセン/ポリジメチルシロキサン	ミリポア・シグマ	57343-U	交換用ファイバー
スタークロマトグラフィーワークステーション	バリアン		クロマトグラフィーソフトウェア
サーモグリーン ローブリード (LB-2) セプタム	ミリポア シグマ	23154	交換用インレットセプタム