生きた機能性マウス人工内毛細胞におけるデキストランの標識と取り込み

サマリー

ここでは、機能性メカノトランスダクションチャネルを有する聴覚毛髪細胞における3kDaテキサス赤ラベルデキストランの取り込みを視覚化する方法を提示する。さらに、3〜10kDaのデキトランスは、コルチの器官の毛髪および支持細胞におけるエンドサイトーシスを研究するために使用することができる。

要約

毛細胞メカノトランスダクション(MET)チャネルは、聴覚において重要な役割を果たしている。しかしながら、METの分子同一性と構造情報は不明のままである。毛髪細胞の電気生理学的研究により、METチャネルはコンダクタンスが大きく、スタイリル色素やテキサス赤色のアミノグリコシド系抗生物質を含む比較的大きな蛍光カチオン分子に透過性であることが明らかになった。本プロトコルでは、機能的METチャネルのアッセイに使用できるコルチ外植物の器官の毛細胞における蛍光デックストランスの取り込みを可視化し評価する方法について述べた。3 kDa テキサスレッドラベルデキストランは、1~2時間のインキュベーション後に機能性聴覚毛髪細胞に特異的にラベルを付けることがわかりました。特に、3 kDa dextranは2つの短い立体列にラベルを付け、機能的なMETチャネルが存在する場合に拡散パターンで細胞体に蓄積する。毛髪細胞および周囲の支持細胞の細胞体内で、さらなる小胞様の標識パターンが認められた。我々のデータは、3 kDaテキサスレッドデキストランを使用して、細胞染料取り込みのための2つの経路を視覚化し、研究することができることを示唆している。機能的なMETチャネルおよびエンドサイトーシスを通る毛髪細胞特異的なエントリルート、より大きなデキストランにも利用できるパターン。

概要

内耳の毛細胞は、音を検出し、最終的に私たちの脳によって解釈される電気信号の機械的刺激を隠す感覚細胞です。これらの細胞は、立体領域^1、2から突き出た立体基のフィラメントの3列の階段状の束を有する。機械的刺激は、ステレオシリアフィラメントを最長の列に向かって偏向させ、メカノトランスダクション(MET)チャネル³の開口部を引き起こす。METチャネルの開口部は、細胞を脱分極し、その結果、毛細胞の基底領域でシナプス小胞の放出を知らせるカチベーションの流入につながります。

聴覚に不可欠なMETチャネルの生物物理学的特性は広範囲に特徴付けられている。他の特性の中でも、これらのチャネルはカチオン選択的であり、比較的大きなコンダクタンス(低Ca²⁺で150〜300 pS)4、5、6、7、8、9、10を有する。驚くべきことに、FM1-43およびテキサス赤標識アミノグリコシドのような大きな蛍光分子は、METチャネルの過透過遮断薬であり、蛍光顕微鏡11、12、13、14を用いて可視化することができる毛髪体内での蓄積をもたらす。逆に、METチャネルの分子同一性と構造とその透過経路は、依然として不可解なままである。実験証拠の増加は、膜貫通様チャネルタンパク質1(TMC1)が成熟した毛細胞^{15、16、17、18、19}におけるMETチャネルの成分であることを示す。膜貫通チャネル1(TMC1)の突然変異は、METチャネル特性^{19、20、21、22}を変化させ^、難聴を引き起こす。また、TMC1はMETチャネル^18,23の部位に局地化し^{、METチャネル24,25}に機械的力を伝達するチップリンクと相互作用する。さらに、最近のバイオインフォマティクス解析では、TMCタンパク質がメカ感受性チャネルTMEM63/OSCAタンパク質およびTMEM16タンパク質、カルシウム活性塩化物チャネルおよび脂質スクランブラース^26、27、28に関連する進化的なものであると同定されている。これらのタンパク質の関係に基づくTMC1の構造モデルは、タンパク質-脂質界面²⁷における大きな空洞の存在を明らかにした。この空洞は、常染色体優性難聴(DFNA36)27、29、30、31、32を引き起こす2つのTMC1変異を収容し^、また、空洞内の残基に対するシステイン突然変異体の選択的改変はMETチャネル特性²⁸を変化させ、METチャネルの透過経路として機能し得る可能性があることを示す。TMCタンパク質におけるこの予測空洞の大きなサイズは、METチャネルに浸透する大きな分子の能力を説明することができる。METチャネルに異常に大きな浸透経路が含まれているという予測をテストし、TMC1で観察された空洞の大きさの限界を押し広げるために、テキサスレッドで蛍光標識された3kDaデキストランを大きな分子を有するコルチ外植体の器官で取り込み実験を行うプロトコルを開発した。

デキストランは、α-1,6グリコシド結合によって結合された多くのD-グルコース分子から構成される複雑な分岐多糖である。水、低細胞毒性、およびバイオインナーティの高い溶解性は、いくつかの細胞プロセスを研究するための汎用性の高いツールになります。さらに、デキストランは、サイズの広い範囲で利用可能であり、蛍光色に複数の色の蛍光体で標識されています。蛍光標識デックストランスは、細胞および組織透過性研究^{33、34において}一般的に使用され、複数の細胞系システム^35、36、および神経追跡^37、38におけるエンドサイトーシスを研究する。聴覚分野では、デキストラン分子はまた、コルチ^39、40のチンチラ器官の強烈な騒音にさらされた後の細胞接合の破壊および聴覚上皮完全性の喪失を評価するためにも使用されている。

本研究では、最小(3~10kDa)の蛍光デクトランスの特性を利用して、マウス内耳毛髪細胞の取り込み実験を行い、内耳毛細胞METチャネルの透過経路の大きさを調べた。また、エアリスキャン検出器を搭載したレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM)880を用いて、立体性と聴覚毛細胞の細胞体で蛍光デキストランを可視化し、局在化しました。

プロトコル

動物のケアと実験手順は、国立神経障害・脳卒中研究所(KJSに#1336動物プロトコル)の動物ケアおよび使用委員会によって承認された実験動物のケアと使用のガイドラインに従って行われました。

1. マウス

1. ごみの生年月日を制御し、子犬の年齢を追跡するために動物施設で繁殖するC57BL / 6J野生型の繁殖ペアのカップルを設定します。

2. コクレア解剖

1. 分節を行うために、実体顕微鏡に近いきれいな空間を設定します(図1A)。70%エタノールを使用して、スペースや周囲をきれいにし、きれいなベンチパッドを置きます。動物の死骸を捨てるには、医療病理学的廃棄物(MPW)ビニール袋が必要です。
2. ライボヴィッツのL15メディアで35mmの料理を数種類用意してください。
   注:ライボヴィッツのL-15細胞培地には、チップリンクの完全性を維持するために必要な1~2 mM Ca²⁺が含まれており、細胞の健康と生存を改善するために必須アミノ酸、ビタミン、ピルビン酸ナトリウムが含まれています。血清は、その不十分な組成およびデキストランとの潜在的な干渉による実験的変動を避けるために除外された。
3. 出生後6日(P6)マウスを切断することによって安楽死させる。
   注:6日齢のマウスは、吸入麻酔薬に対してやや耐性があります。イソフルランまたは長期の_CO2曝露(最大50分)を安楽死に使用することができますが、死亡を確実にするために二次的な物理的方法が推奨されます。
4. 手術はさみを使用して、前部から後端まで、そして外耳道を横切って表面的な切り傷を作ることによって、頭蓋骨の皮膚を取り除きます。
5. 皮膚を鼻に向かって折り畳んで、頭蓋骨を露出させる(図2B)。
6. 頭蓋骨の後部から前部へ、そして目線を越えて切開する(図2B-C)。
7. 頭蓋骨を2つの半分に分け、頭の骨を露出させるために小さなへらを使って脳を取り除きます(図2C-D)。
8. 小さなはさみで、側頭骨の周りを切り取り、組織を切除する。
9. 両方の側頭骨を35mm皿に入れ、L15メディアで覆われていることを確認します(図2E)。
   注: 次の手順は、立体顕微鏡で実行されます。黒い背景は、通常、細かい解剖ステップ中に組織を視覚化するのに役立ちます。
10. 広視野接眼レンズ(10X倍率(WF10X)と外付け交流(AC)ハロゲン光源を備えた立体顕微鏡の下で、周囲のコクチー組織、半規管、手術鉗子を有する前庭器官を取り除く(図2F)。
11. デキストランとL15の媒体が人工内管に入るようにするには、解剖された人工内液に対して2つの穿刺境界を行い、1つは円形の窓に、もう1つは尖部の人工内口領域で行う。
12. ライボヴィッツのL15メディアを9ウェルのガラスのうつ病プレートから各ウェルに300 mL追加します。
13. 各井戸に少なくとも3つの解剖された内痛を置きます。

3. デキストランラベリング

1. 最終濃度10mg/mLで^、Ca2+およびMg2+(HBSS-CFM)を使用せずにハンクスのバランスの取れた塩溶液中のデキストランを再構成します。このストック溶液は、不透明な黒いチューブ(光から保護)で引用し、使用するまで-30°Cで保存する必要があります。
   注: このプロトコルの成功の結果のためには、リジン修正可能デキストランの使用が重要です。
2. ライボヴィッツのL15培地の500mLで2mg/mLの最終濃度で各デキストランを準備します。
3. コクレアから培地を取り出し、関心のあるデキストランを含むライボヴィッツのL15培地を2mg/mLの最終濃度で追加します。
   注: MET チャネルの比率は、残りの^41、42で開いていますが、デキストランインキュベーションは、MET チャネルのオープン確率を高めるために、外植物の緩やかな揺れで実行されました。
4. 傾いた角度25°の3次元シェーカーを使用して、穏やかな振とう(25rpm)で室温で2時間インキュベートします。
   注:蛍光標識デキストランは、可能な限り光から保護する必要があります。2時間のインキュベーション中にデキストランを保護するために、9ウェルガラス板を細胞培養P150皿の中にアルミニウム箔で包んで置きます。

4. イメージング用サンプル調製

1. デキストランでインキュベートした後、培地で2回、HBSSで1回、ティッシュを2分間洗います。
2. ハンクスのバランスのとれた塩溶液(HBSS)で4%のパラホルムアルデヒドで30分間室温で組織をインキュベートします。
   注意:ホルムアルデヒドへの暴露は、目、鼻、および上気道に刺激を与えることができます。特定の個体では、ホルムアルデヒドへの皮膚暴露を繰り返すと、アレルギー性皮膚炎を引き起こす可能性のある感作を引き起こす可能性があります。ホルムアルデヒドは、既知のヒト発がん性物質であり、生殖の危険性が疑われる。
3. HBSSで固定組織を素早く、穏やかに洗浄し、パラホルムアルデヒドを除去します。
   注:側頭骨の脱石は、この発生段階の内臓では必要ありません。
4. 渦巻帯靭帯と微細な先端鉗子を持つテクトリアル膜を取り除き、コルチの器官を解剖します(図2G)。
5. すべての小片のティッシュを取り除き、HBSSでティッシュを洗う。
6. 蛍光標識ファロジン(TR-またはFITC標識デキストランの取り込み試験時に緑色または赤色に結合)を含むPBS中の0.5%トリトンX-100で組織を透過して、F-actinの標識を30分間1:20に希釈し、視覚化するアクチンベースのステレオシリア。
7. HBSSバッファーで2分間2~3回組織を洗浄し、トリトンとファロイジンの過剰を除去し、PBSで1回ずつ塩を除去します。
8. コルチ組織の器官を顕微鏡のスライドに取り付け、取り付けメディアで覆います。
   注:組織を取り付ける際は、毛髪の立体性を含む組織の側面がカバースリップに向かっていることを確認してください。
9. 取り付けメディアの追加中に発生する可能性のある気泡を取り除き、カバースリップの配置中に新しい気泡が発生するのを防ぎます。
   メモ:取り付けメディアの追加中に発生した気泡はピペットで吸い込まれます。カバースリップの下に気泡が閉じ込められるのを防ぐには、カバースリップの端をサンプルの近くに置き、シーズ上のカバースリップを慎重にゆっくりと下げる。
10. 取り付けメディアで組織をガラスカバースリップで覆う (図 2H)。
    注: 0.4 以上の開口を持つ目的は、#1.5 カバースリップ(厚さ 0.17 mm)を使用するように設計されています。誤ったカバースリップを使用すると、画像の強度と品質に重大な影響を及ぼす可能性があります。
11. 取り付け済み組織を室温で一晩インキュベートし、取り付けメディアを乾燥させ、スライドをイメージングまで4°Cで保存します。

5. 画像取得と画像処理

注:共焦点画像は、超解像度(SR)モード^43と63xの目的で32チャンネルのエアリスキャン検出器を備えたLSM 880コンフォーカル顕微鏡で撮影されました。

1. 目的に浸漬油の小さな滴を追加します。
2. 実装された組織試料を含む顕微鏡スライドを、浸漬油に面したガラスカバースリップで顕微鏡ステージに配置します。
3. サンプルに焦点を当て、画像取得ソフトウェアを使用してイメージングパラメータを設定します。
4. X、Y、Z の解像度に対して、同一の画像取得設定と最適なパラメータを各独立実験に使用します。画像の z スタックを取得する際に、目的を素早く正確に移動するには、ピエゾ駆動のフォーカス システムが必要です。
   注: ヘア セルのポペカル領域全体をイメージするには、最適な設定を使用して、ステレオシリアからヘア セルボディのポペカルハーフまでのイメージの Z スタックを収集します。小胞状粒子のイメージングを保証するために、毛髪細胞に沿って大きなzスタックを収集することが重要です。
5. 画像取得ソフトウェアを使用して、Airyscan 3D再構築アルゴリズムを使用して生の共焦点画像を自動デフォルトのデコンボリューションフィルタ設定で処理します。
6. 画像処理ソフトウェアで共焦点画像を開いて、明るさとコントラストを調整し、スケールバーを追加し、最終的な数値の画像をエクスポートします。

結果

我々は、テキサスレッド(dextran-TR)で蛍光標識された3kDaデキストランを有する野生型出生後6日目(P6)マウスからのコルチ外植物の器官の2hインキュベーション後の毛細胞の堅牢かつ特異的な標識を観察した(図2A-B)。デキストランの標識は、コルチの器官の基底、中、および尖部領域での内側および外側の毛細胞(IHCおよびOHC)の両方で観察された(図2B)。

蛍光標識ファロイジンは、フィラメントアクチン(F-アクチン)に対抗し、アクチン系毛髪ステレオシリアを可視化するために使用した。また、インキュベーション時間が短い場合も同様の実験を行い、毛髪体内でデキストラン-TRの蓄積を観察したが、シグナルは2hインキュベーションの場合よりも弱く、より可変であった(図2C)。

ディスカッション

このプロトコルは、3 kDa デキストランテキサスレッドとコルチ外植物のマウスの器官で取り込み実験を行う方法について説明します。この方法の目的は、以前にテストされた他の分子よりも大きい分子が、METチャネルを通して聴覚毛細胞を特異的に標識し、浸透させることができたかどうかをテストすることです。同様の実験プロトコルは、FM1-43(0.56 kDa)12、19、20^およびテキサス赤色標識アミノグリコシド(1.29-1.43 kDa)13、52のような他の蛍光色素への毛髪細胞の透過性を評価するために以前に使用されてきた。これらの蛍光分子を使用して毛髪細胞を標識するために必要な時間は、そのサイズによって異なります。最大標識は、FM1-43^13、53、

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#1.5 ガラスカバースリップ 18mm	ワーナーインスツルメンツ	64-0714
アレクサフルオア 488 ファロイジン	サーモフィッシャー	A12379
アレクサフルオア 594 ファロイジン	サーモフィッシャー	A12381
アルファプランアポクロマート 63X/1.4 オイルコア M27 対物	カールツァイス	420780-9970-000
アミロリド塩酸塩	EMD ミリポア
129876 Benchwaver 3-dimensional Rocker	Benchmarks 科学	B3D5000
C57BL/6J野生型マウス	株 000664	The Jackson Laboratory
Cell impermean BAPTA tetrapotassium salt	ThermoFisher	B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable	ThermoFisher	D1820
デキストラン、テキサスレッド、10,000 MW、リジン固定可能	ThermoFisher	D1863
デキストラン、テキサスレッド、3000 MW、リジン固定可能	ThermoFisher	D3328
ホルムアルデヒド水溶液 EMグレード	電子顕微鏡科学	15710
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし	ThermoFisher	14025
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド	ThermoFisher	14170
Image J or FIJI	NIH	http://fiji.sc/
Immersol 518F 油浸メディア	Carl Zeiss	444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	31415029
neomycin trisulfate salt hydrate	Sigma	N6386
PBS (10X), pH 7.4	ThermoFisher	70011069
Phalloidin-CF405M	Biotium	00034
ProLong Diamond 退色防止封入剤	ThermoFisher	P36970
スーパーフロストと顕微鏡スライド	Fisherbrand	22-037-246
Triton X-100	Sigma	T8787
Zen Black 2.3 SP1ソフトウェア	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html