OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

サマリー

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。

要約

化学・バイオコンジュゲーション技術は近年急速に開発され、タンパク質ポリマーの構築が可能です。しかし、制御されたタンパク質重合プロセスは常に課題です。ここでは、合理的に対照的な配列で重合タンパク質を段階的に構築するための酵素的方法論を開発しました。この方法では、タンパク質モノマーのC末端は、OaAEP1(オルデンランディア・アフィニアスパラジニアル・エンドペプチダーゼ)1)を用いたタンパク質結合のためのNGLであり、N末端は一時的なN末端保護のための鎖切りTEV(タバコエッチウイルス)切断部位に加えてL(ENLYFQ/GL)であった。その結果、OaAEP1は一度に1つのタンパク質モノマーのみを添加することができ、その後TEVプロテアーゼはQとGの間のN末経を切断してNH 2-Gly-Leuを暴露した。その後、ユニットは次のOaAEP1ライゲーションの準備ができています。この工学的ポリタンパク質は、原子間力顕微鏡ベースの単分子力分光法(AFM-SMFS)を用いて個々のタンパク質ドメインを展開することによって検査される。したがって、本研究は、ポリタンパク質工学と固定化のための有用な戦略を提供する。

概要

合成ポリマーと比較して、天然の多ドメインタンパク質は、サブドメイン¹の数と種類がよく制御された均一な構造を有する。この機能は、通常、改善された生物学的機能と安定性^2、3をもたらす。システイン系ジスルフィド結合結合結合や組換えDNA技術など多くのアプローチが、複数ドメイン^{4、5、6、7}を有する重合タンパク質を構築するために開発されている。しかし、前者の方法は常にランダムで制御されていない配列を生み出し、後者の方法は、有毒で大きなタンパク質の過剰発現の困難さや、補因子やその他の繊細な酵素による複雑なタンパク質の精製など、他の問題につながります。

この課題に対応するため、プロテアーゼTEV^8,9と組み合わせたプロテインリガーゼOaAEP1を用いて、ポリマー/ポリタンパク質のタンパク質モノマーを段階的に結合する酵素法を開発しています。OaAEP1 は、厳格かつ効率的な内ペプチダーゼ.2つのタンパク質は、N末限がGly-Leu残基(GL)であり、C末終点がNGL残基である他のタンパク質がNGL残基^である場合、30分以内にOaAEP1によって2つのテルミニを介してAsn-Gly-Leu配列(NGL)として共有結合することができる。しかし、OaAEP1を使用してタンパク質モノマーをリンクさせると、システイン系カップリング法のような制御されていない配列を有するタンパク質ポリマーに導く。そこで、取り外し可能なTEVプロテアーゼ部位とロイシン残基をENLYFQ/G-L-POIとして持つタンパク質ユニットのN末限を設計しています。TEV切断の前に、N末端はOaAEP1ライゲーションに関与しなかった。そして、さらにOaAEP1ライゲーションと互換性があるN末経でGL残基がTEV切断後に暴露される。このように、比較的良好な配列を持つポリタンパク質の逐次酵素生合成法を達成した。

ここでは、当社の段階的酵素合成法は、配列制御および制御されていないポリタンパク質サンプル調製法、および単分子研究のためのタンパク質固定化、特に次のような複雑系に使用することができます。金属タンパク質。

さらに、AFMベースのSMFS実験により、タンパク質ポリマーの構造と安定性を単一分子レベルで確認することができます。AFM、光ツイーザー、磁気ツイーザーを含む単分子力分光法は、ナノテクノロジーにおける一般的なツールで、生体分子を機械的に操作し、その安定性を測定する^{11、12、13、14、15、16、17、18、19、20}である。単分子AFMは、タンパク質(un)折りたたみ21、22、23、24、25、受容体リガンド相互作用26、27、28、29、30、31、32、33、34の研究で広く使用されています。 ^35,無機化学結合^{20,36,37,38,39,40,41,}42^,43および金属- リガンド結合 , 金属タンパク質⁴⁴,^{45,46,47,48,49,50}.ここで、単分子AFMは、対応するタンパク質展開シグナルに基づいて合成されたポリタンパク配列を検証するために使用される。

プロトコル

1. タンパク質の生産

1. 遺伝子クローン
   1. 目的タンパク質(POI)用にコード化した遺伝子(POI):ユビキチン、ルブレドキシン^(RD)51、セルロース結合モジュール(CBM)、ドッカリンXドメイン(XDoc)およびルミノコッカスフラベファシス、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ、エラスチン様ポリペプチド(Elps)からの凝集体。
   2. ポリメラーゼ連鎖反応を行い、異なるタンパク質断片から遺伝子を再結合するための3制限消化酵素システムBamHI-BglII-KpnIを用いる。
   3. 直接DNAシーケンシングによりすべての遺伝子を確認する。
2. タンパク質の発現と生産
   1. 発現用に pQE80L-POI または pET28a-POI プラスミドを使用して大腸菌BL21(DE3) を変換します。
   2. 各抗生物質(例えば、100 μg/mLアンピシリンナトリウム塩または50 μg/mL、カナマイシン)を用いて、1つの単一コロニーをLB培地の15mLに選びます。16-20時間の37 °Cで200rpmで培養を振り続けます。
   3. 一晩培養液を800mLのLB培地(1:50希釈)に希釈します。rubredoxinの場合は、1,800 x gで培養を遠心分離し、M9培地の15 mL(0.4%のグルコース、0.1 mMのCaCl_2、2mM MgSO₄を補って)に再懸濁し、M9培地の800mLに希釈した。
   4. 200rpmで振とうながら37°Cで培養液をインキュベートし、培養が0.6の_600nm(OD600)で光学密度に達するまで。タンパク質発現を検査するための事前誘導制御として、培養液のサンプル100μLを保存します。
   5. IPTGを1mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導し、200rpmで4時間の培養液を37°Cで振る。タンパク質発現を検査するための誘導後制御として、培養液の100μLサンプルを予約してください。
   6. 4°Cで25分間13,000 x gで培養を遠心分離し、精製前に-80°Cで保存します。
      注: ここでプロトコルを一時停止できます。
3. 目的タンパク質の精製
   1. 25 mLのリシスバッファー(50mMトリス、150 mM NaCl、pH 7.4、DNase、RNase、PMSF)で細胞を再懸濁し、ソナレータ(15%振幅)を使用して氷上で30分間ライセリングします。
   2. 4°Cで40分間19,000 x gで細胞ライセートを明らかにする。
   3. Co-NTAまたはNi-NTAアフィニティカラムのパック1 mL(ベッドボリューム)を、重力流によって10列ボリューム(CV)の超純水と10 CVの洗浄バッファー(50 mMトリス、150 mM NaCl、2 mMイミダゾール、pH 7.4)で洗浄します。
   4. 重力流によってカラムを通ってタンパク質上清を3回通過させます。
   5. 50個のCVでカラムに洗浄バッファを注ぎ、汚染タンパク質を取り除きます。
   6. 氷冷溶出バッファーの 3 CV (20 mM トリス、400 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 7.4) の結合タンパク質を溶出します。ラベドキシンタンパク質に関しては、4°CでpH8.5でアニオン交換カラムを用いた更なるアニオン交換精製が必要である。
   7. SDS-PAGEでサンプルを分析します。

2. カバースリップとカンチレバー表面の機能化

1. 機能化されたカバースリップ表面の準備
   1. 40mLの超純水に20gのクロム酸カリウムを溶かします。グラスロッドを使ってクロム酸カリウム溶液に360mLの濃硫酸をゆっくりと加え、クロミック酸を調製します。
      注意:ここで使用される化学物質と最終クロム酸は、強く腐食性と酸性です。適切な保護具で作業します。この溶液は、濃硫酸を加えるときに熱を放出し、冷却のためのゆっくりとした追加と適切な休止を意味する。
   2. クロム酸処理により、ガラスカバースリップを80°Cで30分間洗浄し、活性化します。カバースリップを光から保護しながら、室温で1時間の1%(v/v)APTESトルエン溶液に完全に浸します。
   3. トルエンと絶対エチルアルコールでカバースリップを洗浄し、窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。
   4. 80°Cで15分間カバースリップをインキュベートし、室温まで冷却します。
   5. 2つの固定化カバースリップとインキュベートの間に、スルホ-SMCC(1mg/mL)の200 μL(1mg/mL)をジメチルスルホキシド(DMSO)溶液に加え、光から保護された1時間のインキュベートを行います。
   6. 最初にDMSOでカバースリップを洗い、次に絶対エチルアルコールで残留スルホ-SMCCを除去します。
   7. 窒素の流れの下でカバースリップを乾燥させます。
   8. 200 μM GL-ELP_50nm-Cタンパク質溶液のピペット60 μLを機能化されたカバースリップに、約3時間インキュベートする。
   9. 超純水でカバースリップを洗浄し、未反応のGL-ELP_50nm-Cを除去します。
      注:機能化されたカバースリップは4 °Cで貯蔵の下で約2週間可能である。
2. 機能化カンチレバー表面調製
   1. クロム酸処理により、80°Cで10分間、カンチレバーを洗浄します。
   2. 1%(v/v)APTESトルエン溶液でアミノシラン化によってカンチレバーを機能化し、80°Cで15分間焼いてからスルホSMCCに結合します。
   3. C-ELP_50nm-NGLを1.5時間のスルホ-SMCCのマレイミド基と表面にリンクします。
   4. 超純水により、カバースリップ上の未反応C-ELP_50nm-NGLを洗い流します。
   5. 機能化されたカンチレバーを200μM GL-CBM-XDocタンパク質溶液200μMの200μLに浸し、20~30分間25°Cで200nM OaAEP1を含有します。次に、AFMバッファー(100 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.4)を使用して未反応タンパク質を洗い流します。
      注: 片持ち面とカバースリップの表面化学は似ています。

3. 制御された配列を用いて段階的にポリタンパク質を調製する

1. このライゲーションユニット Coh-tev-L-POI-NGL を OaAEP1 によってカバースリップ面に固定化された GL-ELP_50nmに 30 分間リンクします。
2. AFMバッファー(100 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.4)を15~20 mL使用して、未反応のタンパク質を洗い流します。
3. TEVプロテアーゼの100 μL(0.5 mM EDTA、75 mM NaCl、25 mMトリス-HCl 10%[v/v]グリセロール、pH 8.0)を加えて、TEV認識部位でタンパク質ユニットを25°Cで1時間切断します。
4. 残りのタンパク質を洗い流すために15-20 mLのAFMバッファーを使用してください。
5. OaAEP1によるライゲーションユニットCoh-tev-L-POI-NGLをOaAEP1によって30分間リンクします。
6. ステップ3.3~3.5 N-1を繰り返して、ガラス表面にGL-(Ub)n-NGLを構築します。最後のTEV切断反応を省略して、タンパク質ポリマーの凝集をCoh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glassとして予備します。

4. AFM実験の測定とデータ解析

1. AFM測定
   1. 10 mM CaCl₂および 5 mM アスコルビン酸でチャンバーに AFM バッファーの 1 mL を追加します。
   2. 実験用の機能化されたAFMプローブのD先端を選択します。等分定理を使用して、各実験の前に正確なばね定数(k)値を持つAFMバッファーのカンチレバーを較正します。
   3. 片持ちチップをサンプル表面に取り付けて、まとまり/ドッカーニンのペアを形成します。
   4. 片持ち面を表面から400 nm·s^-1の一定速度で引き込みます。その間、4000 Hzのサンプルレートで力延長曲線を記録します。
2. データ分析
   1. JPK データ処理選択の強制拡張トレースを使用します。
   2. ソフトウェアを使用してトレースを分析します。ポリマー弾性のワーム様鎖(WLC)モデルで曲線を適合させ、個々のタンパク質展開ピークに対する展開力と輪郭長増分を得ます。
   3. 展開する力のヒストグラムをガウス モデルに合わせて、展開フォースの最も可能性の高い値 (u>) と輪郭長インクリメント (<ΔL_c>) を取得します。

結果

OaAEP1ライゲーションによって隣接するタンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力()としてポリマー中のタンパク質モノマー安定性に影響を及ぼさないし、輪郭長増分(<ΔL_c>)は前の研究と同等である(図1)。このルブレドキシンタンパク質の精製結果を図2に示す。TEV切断後のタンパク質が、制御配列を有するタンパク質ポリマーを構築する以下のOaAEP1ライゲーションと適合していることを証明するために、図3は、SDS-PAGE画像を基準として提供する。機能化された片持ちおよびカバースリップ調製のステップは、図4に記載されています。カバースリップ上のポリタンパク質の段階的な酵素生合成と固定化を図5に示す。このプロトコルを使用すると、対照配列を有するタンパク質ポリマーを構築し、AFMベ...

ディスカッション

我々は、ポリタンパク質の酵素性生合成および固定化のためのプロトコルを説明し、AFMベースのSMFSによるポリタンパク質設計を検証した。この方法論は、ポリタンパク質工学と固定化4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61のための以前の方法を補完する、設計された配列でタンパク質ポリマーを構築するための新しいアプローチ^を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鉄(III)塩化物六水和物	化学		99%
塩化亜鉛	Aesar		100.00%
塩化カルシウム水和物	Alfa Aesar		99.9965%結晶凝集
体L-アスコルビン酸	シグマライフサイエンス		バイオエクストラ、≥99.0%、結晶性
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン	Sigma-Aldrich		≥99%
スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸	サーモサイエンティフィック		90%
グリセロール	マックリン		99%
5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)	アルファ エーザー
遺伝子	Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM	JPK ドイツ
MLCT カンチレバー	Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare
AKTA FPLC システム	GE Healthcare
ガラスカバースリップ	セイル ブランド
Nanodrop 2000	Thermo Scientific
Avanti JXN-30 遠心分離機	ベックマン・コールター
ゲルイメージシステム	タノン