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方法論記事

次のステップを踏む:ラットの機能回復を最大化するための神経凝集整体交位後肢移植モデル

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DOI:

10.3791/60777

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2020年8月30日

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1Comprehensive Transplant Center and Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, University of Illinois at Chicago, 3Department of Surgery, Tianjin Occupational Diseases Precaution and Therapeutic Hospital, 4Department of Biomedical Engineering, McCormick School of Engineering, Northwestern University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、免疫学と機能回復の同時研究に向けた血管化複合同種移植(VCA)の堅牢で再現可能なモデルを提示します。手縫い血管アナストモーセと神経凝集を伴う右大腿後肢整形移植に細心の注意を払った技術に投資した時間は、機能的回復を研究する能力をもたらす。

要約

特に、四肢移植および血管化複合同種移植(VCA)は、免疫抑制および機能性神経運動回復における現在の制限によって汚されてきた広い治療上の約束を有する。VCAのユニークな特徴を研究するために多くの動物モデルが開発されていますが、ここでは現在のVCA制限の両方の側面を同時に調査するように設計されたラットの直交性後肢移植の堅牢な再現性モデルを提示します:免疫抑制戦略と機能的神経運動回復。モデルの中核には、手縫いの血管性アナストモーセや大腿神経と坐骨神経の手縫い神経凝集などの細心の注意を払った、時間テストされた微小外科的技術へのコミットメントがあります。このアプローチは、リハビリテーション、日常活動の再開、および機能テストを可能にする長生き動物を可能にする耐久性のある四肢再建をもたらす。従来の免疫抑制剤の短期治療により、同種移植動物は移植後70日間生存し、同位移植動物は術後200日を超える長生きコントロールを提供する。神経学的機能回復の証拠は、手術後30日までに存在する。このモデルはVCAおよび神経再生に特有の免疫学的質問を尋問するための有用なプラットホームを提供するだけでなく、VCAのためにとりわけ合わせる新しい治療戦略のインビボのテストを可能にする。

概要

血管化複合同種移植(VCA)または複合組織同種移植(CTA)のより広範なカテゴリーの下での四肢移植は、まだその治療上の約束を果たしていない。1998年と1999年にケンタッキー州リヨン、フランス、ルイビルで初めてヒト手移植に成功して以来、厳選された患者1で世界中で100以上の上肢移植が行われてきた。より広い適用性は、実質的な免疫抑制および限られた機能的神経運動回復によって汚されている。現在の免疫抑制戦略は、日和見感染の77%の発生率に直面して急性拒絶反応の85%の発生率を生じる2。一方、手移植後の機能回復が起こる。平均腕肩と手の障害 (DASH) スコアは 71 から 43 に改善しますが、そのレベルの機能は障害2としてまだ資格があります。四肢移植の非生命保存の性質を考えると、現在の技術は、VCAの次のステップを踏むために動物モデルで洗練されなければなりません。

,12,13,141978年3月の初のラットモデルの四肢移植以来、VCA4の分野を進めるために多くの革新的な動物モデルが開発され、血管カフドアナストモーセを組み込んで手術時間,,5,5、6、異形性骨髄筋皮移植を行い、レシピエント動物77、8、9、10、11、および免疫学的アプローチを最小限に10,11抑える。,89ここで提示される直交右後肢中型移植のラットモデルは、現在のVCA制限の両方の側面を同時に調査するための堅牢で再現可能なモデルプラットフォームへの先行投資として、手縫い血管性アナストモーセや神経凝固などの細心の注意を払った時間テストされた微小外科的技術を強調しています:免疫抑制戦略と機能的神経運動回復。

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プロトコル

すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、ノースウェスタン大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。具体的な手順は、プロトコル IS00001663 で実行されました。

注:2つのラット株、ルイスラットとアウグストコペンハーゲンxアイルランド(ACI)ラットが使用されました。動物は、免疫抑制のない同種移植(ACIからルイス)、従来の免疫抑制(ACIからルイスへのACI)、等分移植(ルイスからルイスまたはACI)の3つの治療群に分けられた。ルイスは近交株であり、ACIラットは繁殖した野生型を表すが、したがって、この組み合わせは、より悪い症例拒絶反応をモデル化するために選択された。従来の免疫抑制は、術後1日(POD)からPOD28を差し引いた1mg/kgまたはFK5063mg/kgとして、その後毎週1回ラパマイシンとして皮下投与した。オスラットと雌ラットの両方が生後8~16週の適格なレシピエントで、手術時の体重は250~400グラムであった。

1. ドナー右後肢収穫

  1. 適切な清掃システムを備えた気化器を介して、純粋な酸素中の5%イソファランで全身麻酔を誘発する。
  2. つま先ピンチで麻酔の十分な深さを確認し、その後、右後肢と右鼠径部外科部位の毛皮をトリミングするためにヘアクリッパーを使用
  3. げっ歯類の鼻コーンを通してイオブルランを2-2.5%に下向きにする。
  4. ラットの上に、下に加熱パッドを備えた手術台の側面に広がった手足をテープでつて、ラットの上に置きます。70%のアルコールをこすり、無毛の皮膚を消毒し、生殖不能ガーゼで外科分野を保護する。
  5. 適切なマイクロ外科顕微鏡、微小手術器具を使用し、双極性および単極電気コーテリーへの容易なアクセスを備え、解剖を開始する。
  6. 右後肢の周りに周回皮膚/皮下組織切開を行うためにはさみを使用します。りぎざりの折り目からは、歯腔靱帯とほぼ同じレベルで内側を皮切りに開始し、周切開を完了するために側側側に伸びる。
  7. 切開の真下に筋肉層を露出させた後、筋肉層から近位皮膚/皮下フラップにつながる表面的な上皮血管を解剖し、焼灼する。
  8. 近位フラップを膝に対して下方に、内皮靭帯に、遠位皮膚/皮下フラップを膝に対して下方に反射させる。
  9. ワイヤリトラクタまたはロールガーゼを使用して、フィールドを露出させます。
  10. ラットのうっとうな解剖学は人間に似ている。内側から内側まで、神経、動脈、静脈があります。
  11. 大腿神経を解剖し、可能であれば分岐に近い、インジナル靭帯で鋭く分割する。分裂した神経を劣って引き込み、湿ったガーゼの下に覆われて安全に邪魔をし続ける。
  12. 大腿動脈と静脈に注意を向け、4cm 7-0シルクのネクタイを使用して、直接取り扱う代わりに、外傷を負って血管を引き込みます。
  13. 彼らは7-0シルクのネクタイで発生すると、大腿骨容器のすべての枝をリゲート。ネクタイの間に枝を分ける非常に小さな枝の場合、ネクタイの代わりに双極性焼灼焼けが使用される。
    注:分裂を必要とする動脈および静脈枝には、表面的な眼屈の回合体および筋肉の血管が含まれる。表面的なサーカムフレックス腸骨は、通常、最大であり、人間のプロファンダ大腿骨のように深く潜るように見えるが、プロファンダはラット15に存在しない。最も高い属性および伏在枝のような大腿血管のより遠位の枝は、通常、分裂を必要としない。
  14. 男性ラットドナーの陰茎静脈を通して500の国際的なヘパリン単位を全身に注入する。ドナーラットが女性の場合は、表面上の上皮静脈を使用してください。
  15. 次のステップに進む前に、ヘパリンを2分間全身に循環させます。
  16. 7-0シルクの結びつきを持つ大腿動脈を可能な限りり、りぐるみの靭帯に近いようにリゲートし、結び合いを分ける。
  17. 動脈と同様に、大腿静脈をリゲートして分ける。
  18. 動脈と静脈の両方を劣った、安全に邪魔して、以前に覆われた大腿神経と一緒に湿ったガーゼの下で覆われた。腹側筋群を解剖し、発生する目に見える血管を焼灼するように注意する。ここでの止血症への注意は、再灌流後のレシピエント失血を最小限に抑えます。
  19. 腹側筋群の深部では、坐骨神経の近位をその枝に識別し、鋭く分ける。通常、脛骨、腹膜、およびsuralの3つの坐骨神経枝が見える。3つすべてがドナーの四肢に保存されるべきです。第4の皮枝は、典型的には、この解剖15、16,16では見られない。
  20. 細心の止まり止めで中腿レベルで残りの腹側と後筋群を分割終了します。筋肉を完全に分割するために、四肢の内側を引っ込める必要があるかもしれません。
  21. ハンドヘルドコードレスロータリーソーを使用して、ミッドシャフトで大腿骨の骨をトランセクトします。
  22. ドナーから四肢移植片を取り除いた後、シルクの結ばれた端を移植片側の大腿動脈および静脈切り株から切断し、それによって血管を再び開ける。
  23. 24ゲージの血管カテーテルを移植片動脈切り株に挿入し、開いた静脈を通って流れ出るのを見て、5mLの氷冷正常生理食塩水で希釈した250の国際ヘパリン単位で移植片を洗い流す。
  24. ゆっくりと、約3分間、移植片を静かに洗い流します。過剰な強引な洗い流しは、内皮を損傷する可能性があります。
  25. 移植まで氷バケツに入れ子にした冷たい生理食い皿に移植片を入れます。
  26. 両側性乳房間術でドナーラットを安楽死させる。
  27. すべての手術器具を適切に洗浄してください。

2. 受け取り側のネイティブ右後肢切断

  1. イオフルランを5%で麻酔を誘発し、深さを確認し、毛皮をトリミングし、動物を位置づけ、ドナーラットについて説明したようにアルコールで皮膚を消毒する。
  2. 2-2.5%にダウンチレートイヨフルラン、ブプレノルフィン1.2mg/kgで皮下術前鎮痛を注入し、エンロフロキサシン7.5mg/kgで術前予防を行う。
  3. ドナーと同様に、うぐる折り目の周回切開を行い、止血を保証する皮膚フラップを反射し、大腿神経、動脈および静脈を解剖し、上記と同じ分岐血管を結紮する。
  4. 大腿神経はドナーよりも遠方に分割するが、可能であれば分岐に近い。
  5. 大腿動脈と静脈を、それぞれを、りとうがりの靭帯のレベルで別々に締め付けるのに十分なスペースを持って解剖する。静脈と動脈を微小外科ブルドッグクランプでクランプします。クランプしたら、各容器をはさみで鋭く分割します。
  6. 細心の注意を払った腿部で大腿部の腹側と下側の筋肉を細心の注意を払って割り、必要に応じて四肢の内側を引き込む。
  7. 上のように、坐骨神経をその分岐点に近い位置で識別し、分割します。
  8. のこぎりを使用して、ミッドシャフトで大腿骨をトランセクトします。
  9. 受信者のネイティブの右後肢を取り除き、適切に処分します。
  10. イオブルランを鼻コーンを通して1〜1.5%に下向きにする。

3. 受け取った肢移植へのドナー

  1. ハンドヘルドパワーソーを使用して、ドナーとレシピエント大腿骨のカットエンドの両方からの不規則性を剃ります。
  2. のこぎりを使用して、大腿骨内髄腔内ロッドになる18ゲージ針のハブ端を切断する。
  3. 骨を操作する前に、大腿骨の骨の端を切り裂くレシピエントに少量の骨ワックスを塗布して、リーミングプロセス中の骨髄出血を軽減する。
  4. 18ゲージの針を髄腔内ロッドとして使用してドナーおよびレシピエント大腿骨をcoaptする。何らかの力が必要であるが、皮質を破壊する限り、どちらの骨もリームしないでください。
  5. 必要に応じて、針を取り除き、適切な長さにトリミングして、両方のボーンが針の上に滑らかにフィットし、針が骨の間に表示されないようにします。
  6. ガーゼのパッドや小さな岩やドナーの手足の下に粘土をモデリングするなど、小さなサポートを配置して緊張を防ぐ。
  7. 8~10個の単純な中断された5-0ポリグラクチン縫合糸で腹側筋群を再近似し、移植片が大腿骨針の周りを回転しないようにする。これは、アナストモーゼのための四肢の安定性を与えます.
  8. より良い視覚化と暖かい虚血性再灌流傷害を減らすために、定期的に氷冷生理食糸で移植片および外科分野を灌漑する。
  9. ドナーとレシピエントの大腿動脈を整列させ、緊張とループの両方を避け、簡単に中断された10-0ナイロン縫合糸を使用して、最終的に最後から最後までそれらをアストモーゼします。動脈は平均6本の縫合糸を必要とする。
  10. 動脈と同様に、ドナーとレシピエント大腿静脈をエンドツーエンドで吻合する。静脈は6〜8縫合糸を必要とする。
    注:寛大な冷たい生理学灌漑、非外傷性血管取り扱い技術、および血管の後退のための滞在縫合糸として役立つ長い尾を残すことは、効果的な微小外科的なアナストモーセのための重要なツールです。
  11. 両方のアナストモーゼの周りに少量の止血セルロース粉末を置き、静脈と動脈の近位微小外科的ブルドッグクランプを取り除きます。
  12. 両方のアナストモーゼが良好な愛臭と流れを検査します。綿棒を使用して静脈を優しく突き出し、両方のアナストモーゼの良好な止止めを保証します。出血部位に圧力をかけ、必要に応じてより多くの止血セルロース粉末を配置します。別の縫合糸は、最後の手段としてのみ針を「後ろに壁にする」リスクで出血穴を通して置かれる可能性があります。
  13. 両方のアナストモーセが満足のいくものが確認された場合は、残りの長い滞在縫合尾を短くトリミングして他の部分に合わせる。
  14. ラットを左横型の褥瘡位置に再配置し、リベラルな電気焼灼を利用して、あらゆる再灌流筋出血の細心の注意を払って止血を行う。
  15. 筋肉の止まりが保証されたら、神経の筋肉の筋力症に注意を向ける。ぼろぼろに見える神経切り取り端をトリミングします。
  16. 単純な中断5-0ポリグラクチン縫合糸で坐骨神経の下で後筋群を再近似する。
  17. 坐骨神経を再近似する。8〜10 10-0ナイロン神経単純な中断縫合糸は通常十分です。
  18. 思い出させる筋基を再近似し、4-0ポリグラクチン連続縫合で後頭皮膚を閉じる。
  19. ラットを後方に位置合わせし、大腿神経を再近似する。2~3個の10-0ナイロン神経の単純な中断縫合糸は通常十分です。
  20. 4-0ポリグラクチン連続縫合で腹側の皮膚を閉じます。余分な縫合糸尾を避けます, 一度目を覚ますネズミに刺激することができます.

4. 術後ケア

  1. ケージの下に暖房パッドを使用してケージ内の動物を回復し、食べ物や水へのアクセスを準備し、最初の1週間毎日早期合併症を監視します。
  2. POD 2を介して毎日1mg / kgの皮下メロキシカムと術後鎮痛を提供します。術後の抗生物質予防薬希釈エンロフロキサシンスプレーを提供する。Pod 7を介して移植片に1日2回スプレーされたビターセーフミストで、自己切り傷(自己突然変異)の排他性を提供する。
  3. 他のラットとケージに移植されたラットを維持し、毎日の活動への復帰を刺激し、移植された四肢をリハビリする。

術後感覚試験

  1. 熱感覚プロトコルのハーグリーブス試験を適用します, また、他の場所で説明します17,18.
  2. ラットを試験容器に入れ、20分間順応させた。装置ガラスがクリーンであることが確認され、熱源が調査員の指で働いているのが確認された。
  3. テストの前に、ラットが起きていて、テストされた足が赤外線運動検出器の上に配置されていることを確認してください。
  4. 強度レベル90で熱エネルギーを送信します。熱源から足を離れて移動する動物の時間遅延が記録されます。20 秒以内に動きが発生しない場合は、損傷を防ぐためにテストが中止されます。
  5. 各動物の平均離脱待ち時間を計算する前に、最高値と最低値を除いて、試験された四肢ごとに5回の試験を得る。

6. 術後モーター試験

  1. 歩行分析トレッドミルと統合ソフトウェア分析プラットフォームを使用して、手術後4〜6週間でトレッドミル検査の候補を選択します。
  2. テストの1〜2日前にすべてのラットの足の爪をトリミングします。
  3. テストの前に1時間試験室に動物を順応し、不安を落ち着かせるためにテスト前のふれあいの1分間を可能にします。
  4. トレッドミル内にラットを配置し、10 cm/sから14 cm/ sの速度を上げる試験でトレッドミルを実行し、目標の18 cm/sを実行します。ラットが無口で歩くことができない場合は、負のコンディショニングを避けるためにその日のテストを中止してください。高いパフォーマーが24 cm /sまで歩くことを許可します。
  5. 試験動物間で70%エタノールでトレッドミル装置をリンスします。
  6. 歩行パラメータは、解析プラットフォームの独自のソフトウェアから出力されます。

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結果

生存と回復は、細心の注意を払った外科技術に依存します。血管のアナストモーゼと神経のアナストモーゼへの注意、ならびに上記のような骨の凝集は、このモデルの成功を最大化する重要である。手術設計と代表的な解剖学的結果を 図1に示す。

全体的な死亡率は免疫抑制戦略に依存しており、等移植された動物の大半は 図2に示すように術後100〜200日の研究エンドポイントを達成した。急性術後の窓から出ると、治療された同種移植動物は、術後58日まで生存を経験する可能性がある。同種移植ラットは研究の過程で無期限に生きていたが、同種移植ラットはラパマイシンおよびFK506による可変死亡率を持っていた。治療のうちFK506は最も長い生存率(57日目)を促進し、ラパマイシンは未処理のコントロール(10日目)よりも2番目に良かった(20日目)。

感覚と運動の回復を 図3に示すことがで...

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ディスカッション

四肢移植は、血管化成分同種移植(VCA)のより広範なカテゴリーの下で、まだ満たされていないとして広く適用可能な治療上の約束を有する。主な障害は、VCAと現在使用されている神経運動回復技術に特有の未解決の免疫学的問題にあります。新しい技術の開発は、柔軟で堅牢で再現性のある動物モデリングに依存します。

多くの動物モデルはVCAで確立されており、それぞれに特別な利点が4.非ヒト霊長類モデルは、ヒト患者に魅力的な翻訳性を提供するが、コスト上の懸念と必要な免疫抑制の毒性レベルによって妨げられている4.イヌモデルは、人間としての筋肉構造の特定の類似点だけでなく、より経験豊富な免疫システム19、20,20に有利であると考えられている。豚モデルは、免疫系がますますよく研究されている大規模な動物モデルの利点を提供します21,,

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、フランケル財団とノースウェスタン記念病院マコーミックグラント(オペレーション復元)によって資金提供されました。この出版物で報告された研究は、賞番号T32GM008152の下で国立衛生研究所の国立一般薬科学研究所によってサポートされました。この研究は、ノースウェスタン大学マイクロサージャストコアと行動フェノタイピングコアによって支えられていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔器Vet Equip911103
0.5cc シリンジExel26018
18ゲージ針BD305196
1cc シリンジBD309659
22ゲージ針BD305156
24ゲージ血管カテーテルSur-VetSROX2419V
25-ゲージ針エクセル26403
3 cc シリンジBD309657
5cc シリンジエクセル26230
アルコールフィッシャー サイエンティフィックHC-600-1GAL
麻酔誘導チャンバー獣医装備941443
麻酔ガス スカベンジャー システム獣医装備931401
バイポーラ電気焼灼オーラ26-500
ビタースプレー ミストヘンリー・シャイン5553
ボーンワックスCP メディカルCPB31A
呼吸回路獣医 装備921413
ブプレノフィンレキット ベンキーザー12496075705
カストロビエホス ニードルドライバーロボズRS-6416
コードレスロータリーソードレメル8050-N/18
綿棒フィッシャーサイエンティフィック23-400-101止血用
DigiGait Appparatus およびソフトウェアマウス 詳細MSI-DIG、DIG-SOFT
デュモン鉗子(#4)RobozRS-4972
デュモン鉗子(#5)RobozRS-5035
エンロフロキサシンノーブルックアナダ 200-495
FK-506アステラス301601
ガーゼケンドール1903
ガーゼCovidien8044
グローブマイクロフレックスDGP-350-M
バリカンオスター078005-010-003
ハンドヘルド モノポーラ 電気焼灼ボディAA00
ハーグリーブス 装置ウーゴ バジーレ S.R.L. ジェモニオ、イタリア37370
ヒーティングパッドウォルグリーン126987
ヘパリンフレゼニウス カビ42592K
ホットプレートコーニングPC-351蘇生液の温め用
イソフルランヘンリー・シャイン29405
乳酸リンガーバクスター2B2074
大きなペトリ皿フィッシャーサイエンティフィックFB0875713やした生理食塩水メ
ロキシカムリーシャイン49755
マイクロコリンハートマン開創器
マイクロ解剖はさみボズRS-5841
マイクロ原線維コラーゲン粉末BD1010590止血用
微小血管クリップRobozRS-5420
生理食塩水バクスター2F7124
眼科用潤滑油デクラIS4398
ラプマイシンMedChem ExpressHY-10219
小型シャーレフィッシャーサイエンティフィFB0875713A温めた蘇生液用
滅菌ドレープProAdvantage N207100
手術用ガウンCardinal Health9511
サージカルマスク3M1805
手術用顕微鏡、光学モデル OPMIMDZeiss169756
手術用顕微鏡、ユニバーサルS3Zeiss243188
縫合糸 10-0 ナイロンCovidienN2512
縫合糸 5-0 vicrylEthiconJ213H
縫合糸 7-0 シルクタイテレフレックス103-S
テープ3M1530-1
超音波器具クリーナーRobozRS-9911
血管拡張鉗子RobozRS-5047
冷ヘンロック

参考文献

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