方法論記事

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

DOI：

10.3791/60793

⸱

2020年2月14日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Molecular Biotechnology, Turkish-German University, 3Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 4Braunschweig Integrated Centre of Systems Biology, 5Helmholtz Centre for Infection Research

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで提示された、ゼブラフィッシュ幼虫を蛍光標識された嫌気性C.ディフィシルでマイクロインジェクションおよび非侵襲的なマイクロガベージによって感染させる安全で効果的な方法です。

要約

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クロストリジオイド・ディフィシル感染(CDI)は、米国で最も一般的な医療関連胃腸感染症の1つと考えられている。C.ディフィシルに対する自然免疫応答は説明されているが、CDIにおける好中球およびマクロファージの正確な役割はあまり理解されていない。現在の研究では、Danio rerio(ゼブラフィッシュ)幼虫は、生体内でこれらの自然免疫細胞の行動と協力をイメージングするためのC.ディフィシル感染モデルを確立するために使用されています。C.ディフィシルを監視するために、蛍光色素を用いた標識プロトコルが確立されている。局在感染は、ゼブラフィッシュ腸管内で活発に増殖し、CDIの腸上皮損傷を模倣するC.ディフィシルとラベル付けされたマイクロインジェクトによって達成される。しかし、この直接感染プロトコルは侵襲的であり、顕微鏡的創傷を引き起こし、実験結果に影響を与える可能性がある。したがって、より非侵襲的なマイクロガブジプロトコルがここで説明される。この方法は、開口を通して挿管することによってゼブラフィッシュ幼虫の腸に直接C.ディフィシル細胞を送達することを含む。この感染方法は、C.ディフィシルの自然感染経路を密接に模倣する。

概要

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C.ディフィシルは、グラム陽性、胞子形成、嫌気性、および胃腸管1における重篤な感染症の主な原因である毒素産生菌である。CDIの典型的な症状は、下痢、腹痛、および致命的な偽膜性大腸炎を含み、死に至ることがある1,2.証拠は、ホスト免疫応答がこの疾患の進行と結果の両方で重要な役割を果たしていることを示しています3.免疫応答に加えて、 CDI4の発症および病因のためには、固有の腸内微生物叢が重要である。過去10年間で、C.ディフィシル(BI/NAP1/027)5、6の超低温株の出現により、CDIの症例数と死亡率の両方が有意に増加した。CDI中の基礎となる免疫メカニズムと微生物叢の役割をよりよく理解することは、新しい治療の発展と進歩につながり、この流行のより良い制御を可能にします。

ハムスターやマウスなどのいくつかの動物モデルは、C.ディフィシル7、8に対する免疫防御への洞察を提供するために開発されています。しかし、自然免疫細胞の役割は、特に自然免疫細胞の挙動が主に組織学的分析または培養細胞に由来するので、まだまだ十分に理解されていない。従って、生きている脊椎動物の内部のC.ディフィシルに対する自然免疫応答を明らかにする透明ゼブラフィッシュモデルを確立することは、そのような研究を促進する。ゼブラフィッシュ幼虫は機能的な自然免疫系を有するが、受精後4〜6週間まで適応免疫系を欠いている 9 .このユニークな特徴により、ゼブラフィッシュ幼虫はCDIの自然免疫細胞の単離された応答と機能を研究するための優れたモデルになります。

このレポートでは、ゼブラフィッシュ幼虫を用いて、マクロファージや好中球などのC.ディフィシル細胞と自然免疫細胞との相互作用を研究する新しい方法について説明します。まず、C.ディフィシル接種と染色を含む局在マイクロインジェクションプロトコルが提示される。in vivo共焦点タイムラプスイメージングを用いて、感染部位に対する好中球およびマクロファージの応答が記録され、好中球およびマクロファージによる細菌の貪食が観察される。しかし、注射自体が組織損傷を引き起こし、細菌10とは無関係に白血球の募集につながることが報告されている。したがって、ゼブラフィッシュ幼虫の腸内にC.ディフィシルを送達する非侵襲的なマイクロガベージプロトコルが続いて記載されている。これまでの研究では、先住民族の胃腸微生物叢がC.ディフィシル11の植民地化に対して宿主を保護することが実証されている。したがって、グノトビオティックゼブラフィッシュ幼虫はまた、感染しているゼブラフィッシュを素因にするために使用される12。その後、腸切除術が行われ、生存可能なC.ディフィシルを回復し、ゼブラフィッシュ腸管内での存在期間を検証する。

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プロトコル

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ここで説明したすべての動物の作業は、法的規制に従って行われました(EU指令2010/63、ライセンスAZ 325.1.53/56.1-TUBS、ライセンスAZ 33.9-42502-04-14/1418)。

1. 低融解アガロース、ゲルプレート、マイクロインジェクション/マイクロガバジ針の調製

  1. 0.08 gの低融解アガロース(材料表、アガロースA2576)を30%ダニオー培地(0.12 mM MgSO 4,0.18 mM Ca [NO3]2)の10 mLに溶解し、0.21 mM KCl、 1.5 mM HEPES (pH = 7.2)、および 17.4 mM NaCl を室温 (RT) で保存し、0.8% 溶液を得た。
    注:アガロースの高濃度または低濃度を使用することができます。しかし、固化に必要な時間は、同じ濃度であってもアガロースの異なるブランドのために異なります。
  2. ガラス毛細管(材料表)からマイクロインジェクションとマイクロガバジ針を準備します。
    1. マイクロピペットプーラーを使用して以下の設定を行います(ユニットはここで使用されるプーラーに固有であることに注意してください)。マイクロガバジ針(空気圧= 500;熱=400;プル=100;速度= 75;時間=150)。マイクロローダーチップを使用して、ヌクレアーゼフリーH2Oの3μLを引っ張った針にロードします。
    2. 注射器に針を導入し、適切に締め付けます。注射に適した角度に針を調整します。マイクロ注射針の場合は600~900 hPa、gavage針の場合は200~300 hPaの射出圧力を設定します。
    3. キャリブレーションスライドの黒い円にミネラルオイルを1滴置きます。細かい鉗子を使って針の先端を切り取ります。ミネラルオイルに1滴を注入し、液滴の大きさを測定します。
    4. マイクロインジェクションの場合、注入時間を調整して、直径 0.10 ~ 0.12 mm の液滴を得ます。マイクロガバジの場合、直径が0.18~0.20mmの液滴を入手します。
  3. マイクロガバジ型としてプラスチック金型を使用して、30%ダニオーの媒体で10cmのペトリ皿にアガロース(材料のテーブル、8050)と1.5%のアガロースプレートを準備します。4°Cで保存し、必要になるまで乾燥を防ぎます。実験前にRTまたは28°Cに暖かくする。

2. 蛍光色素を用いたC.ディフィシルおよび胞子の調製と標識

  1. 蛍光色素の1mMストック溶液(材料表)を調製します。色素は粉末の50 μgアリコートで販売されているので、バイアルにDMSOを69 μL加えて1mMのストック濃度を得ます。
  2. 遠心管に1mMストック溶液の2μLをDMSO18μLに加えて、蛍光色素の100μMの働き溶液を調製し、よく混ぜ合わせます。
  3. 培養C.ディフィシル(リボタイプ027株のリボタイプ)を10mLのBHIS液体培地に接種して、一晩振ることなく嫌気性フード内のプレートから2〜3個のコロニーを持つ。BHISは、0.5%(w/v)酵母エキスおよび0.1%(w/v)L-システインで補うBHIである。1gのL-システインを10mLのddH2Oに溶解し、濾過により殺菌し、オートクレーブ培地に加えて、オートクレーブ処理の最終濃度を得て、1g/Lプレートをオートクレーブする前に培地に15g/L寒天を加えて調製する。C.ディフィシルの選択的培養は、クロムイドC.ディフィシルプレート(材料表)を使用して行われます。
  4. 蛍光色素でC.ディフィシルを染色する
    1. 1.0~1.2のOD600でC.ディフィシルを収穫し、1mLのPBS(RTで3分間5,000 x g)で1倍洗浄します。1×PBSの1 mLで再サスペンド。
    2. 蛍光色素の3μLの働き溶液を1mLの細菌懸濁液に加えます。暗闇の中でRTでサンプルを15分間インキュベートします。1 mL PBSで1回染色されたC.ディフィシルを洗浄し、残留染料を除去し、1.0のOD 600(1.0 OD600は108 cfu/mLとほぼ同等)に1x PBSで再懸濁します。

3. 染色されたC.ディフィシルをゼブラフィッシュ幼虫に注入する

  1. 受精後5日間(ここでは5dpfと呼ばれる)で20~30個のゼブラフィッシュ幼虫を0.02%~0.04%トリカイン(トリカインパウダーは二重蒸留水に溶解し、pH=7に調整し、1M Tris-HCL溶液で1M Tris-HCL溶液)で30%の中~10min射出。麻酔した幼虫を新鮮な10cmのペトリ皿に移し、余分な30%ダニオーの培地を取り除きます。
  2. ゼブラフィッシュの幼虫に0.8%の低融解アガロースを置いてカバーします。幼虫を横の位置にそっと調節します。30~60sの氷の上にペトリ皿を置き、低融解アガロースが固化できるようにします。アガロースをカバーするために0.02%~0.04%のトリカインを含む30%ダニオー培地を加えます。
  3. 注射液を準備します。注射プロセスを可視化するために、色素染色されたC.ディフィシル接種の9μLにPBS溶液中の0.5%フェノール赤の1μLを加える。
  4. マイクロローダーを使用して、インジェクション溶液を使用して、較正されたマイクロインジェクション針をロードします。装填された針をマイクロマニピュレーターに取り付け、立体顕微鏡下に置きます。
  5. 射出圧力を600~900 hPaの間で調整します。射出時間を 0.5 ~ 1.0 nL に設定します。マイクロマニピュレーターの針を、埋め込まれた幼虫に向かって~45°の角度に設定します。
  6. 尿生殖孔の近くに消化管の上に針先を置きます.アガロースを貫通し、針先の筋肉を突き抜け、それを腸管腔に挿入して、0.5~1.0 nLのC.ディフィシルを注入する。蛍光顕微鏡を使用して、注入された幼虫を監視し、共焦点イメージングのために適切に注入された幼虫を拾います。

4. グノトビオティックゼブラフィッシュ幼虫の生成

  1. 確立された天然繁殖法を使用して、グノトビオティックゼブラフィッシュ胚を生成し、 体外受精、抗生物質含有培地(1μg/mLアンホテリシンB、10 μg/mLカナマイシン、20 μg/mLアンピシリン)での洗浄、0.1%の重量/volポリビニルピロリドン-ヨウ素(PVP-I)溶液による洗浄、および細胞培養12における胚のインキュベーション。
  2. すべてのグノトビオティックゼブラフィッシュ幼虫を5 dpfまで、または直前に、グノトバイオティクス条件下で維持します。ガベージの後、ゼブラフィッシュの幼虫は標準的なインキュベーターに移されますが、無菌の30%ダニオーの培地です。

5. ゼブラフィッシュ幼虫のガベージ

  1. ステップ 1.2 で説明したようにマイクロガバジ針を較正する。
  2. 1滴の鉱油で、調整スライドに針を置いて、針の先端の直径を測定します。先端が直径30~40μm、鈍く、滑らかであることを確認します。鋭利な針や荒い針を捨てます。
    注:針の鋭いエッジは、迅速な炎によって鈍化することができます。
  3. ステップ 3.3 で説明したように、ギャビング溶液を準備します。
  4. ステップ 3.4 で説明されているように、針をマイクロマニピュレータにロードして取り付けます。マイクロマニピュレータを調整して針を45°の角度にします。
  5. ステップ3.1で言及したゼブラフィッシュ幼虫を麻酔する。幼虫が動かなくなったら、パスツールピペットを用いて微小葉型の溝に移す。
  6. ゼブラフィッシュの幼虫に0.8%の低融解アガロースを置いてカバーします。溝の45°の角度で直立した頭と溝の壁に対する尾で幼虫を静かに調整します。頭部の角度がガバジ針の角度と整列するように、ほぼ同じになるようにします。マイクロガベージ型を氷の上に30~60s入れ、低融解アガロースが固まり、幼虫の位置を安定させます。
  7. 射出圧力を200~300hPaの間で調整します。射出時間を 0.1 ~ 0.3 s に設定して、C. ディフィシルの射出量を 3 ~ 5 nL に設定します。
  8. 穏やかにアガロースを通して針を操作し、ゼブラフィッシュの幼虫の口に、食道を通して。針の先端が前腸球根の内側に入ったら、注入ペダルを押して細菌を解放します。腸の内腔を送達した容積で満たしてください。食道やクロアカからあふれないようにしてください。ゼブラフィッシュの口から針をそっと引き出します。
  9. gavageの後、感染したゼブラフィッシュの幼虫を柔軟なマイクロローダーチップでアガロースから救出し、最初にアガロースを切断してから幼虫を持ち上げます。これらの幼虫を滅菌30%ダニオー培地に移す。幼虫を滅菌培地で2回すすすります。幼虫を新鮮な10cmのペトリ皿に移します。幼虫は最大11dpfまで維持されます。

6. 注入されたゼブラフィッシュ幼虫の共焦点顕微鏡分析

  1. ゼブラフィッシュ幼虫の麻酔はステップ3.1と呼ばれる。35mmペトリ皿の底に穴を開け、穴に取り付けたガラススライドをイメージングチャンバーと呼びます。30%ダニオー培地の適切な量で、胚をイメージングチャンバーの底部に移す。
  2. 麻酔した幼虫を覆うために、1%の低融解アガロースの200〜300 μLを加える。逆転焦点顕微鏡を使用しているので、幼虫の感染した領域をできるだけ近いガラススライドに置きます。
  3. アガロースを氷の上で固めて30~60s.30%のダニオーを含む3.02%~0.04%のトリカインでアガローを水で覆う。
  4. 幼虫を共焦点レーザー走査顕微鏡(材料表)で画像化する。

7. 幼虫ゼブラフィッシュ腸の解剖が生存可能なC.ディフィシルを回復する

  1. 細菌の負荷を分析するために幼虫から消化管を分離します。シマウマの幼虫を0.4%のトリカインで安楽死させることから始めます。
  2. ゼブラフィッシュを無菌1x PBSで短時間すすい、新鮮なアガロースプレートに移します。
  3. ゼブラフィッシュの解剖
    1. ゼブラフィッシュを固定するために、頭の近くのゼブラフィッシュ幼虫の後部の幹に針を挿入します。ランセットでエラの後ろの頭を取り除きます。
    2. 2本目の針を後部の幹の中央に挿入します。ゼブラフィッシュの腹部に3番目の針を挿入し、体腔から腸を引き出します。
      注:無傷の腸を隔離するためには、細心の注意が必要です。そうすることが困難な場合は、残りの腸から腸の残りの部分を分離するために追加の引き抜きを行います。
    3. マイクロ注射針を使用して、10~15個の腸管を1x PBSの200μL無菌を含む1.5mL管に移します。
    4. 組織を破壊し、ホモジネートを調製するために、害虫で腸を均質化します。害虫がチューブの底に到達し、すべての腸を完全に破壊することを確認してください。
  4. D-シクロセリンおよびセフォキシチンを含有するC.ディフィシル飼育培地中のホモジネートをインキュベートし、嫌気性チャンバー内のタウロキオン酸(TCA、C.ディフィシル胞子の発芽剤)の有無にかかわらず、
  5. 37 °Cで48時間、嫌気的にプレートをインキュベートする。
  6. 16S rRNA-PCRに細菌培養物を使用します。
    1. コロニーを50μLのH2Oで再懸濁し、95°Cで15分間沸騰させます。 遠心分離(RTで2分間14,000rpm)によって、2 μLの上清をC.ディフィシル特異的プライマー(Cdiff16Sfw:5'GTG AGC CAG TAC AGG 3';)を用いたPCR反応のテンプレートとして2μLを使用して、精液された破片をペレット化する。Cdiff16Srev: 5' TTA AGG アガ TGT CAT TGG 3').
    2. 液体培養から細菌を使用する場合、1 mLの培養物を収穫し、PBSの1 mL(RTで2分間14,000rpm)で1回洗浄します。ペレットをH2Odの100μLに再懸濁し、上記のように処理します。細菌コロニーをさらに特徴付けるために、BHIS-またはクロムIDプレート(材料のテーブル)上のストリーク。

   

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結果

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C.ディフィシルは厳密に嫌気性であるが、蛍光タンパク質の発クロモフォアは通常、成熟するために酸素を必要とする。この問題を克服するために、蛍光色素を使用して、活発に増殖していたC.ディフィシル細胞を染色した(リボタイプ027株のR20291;図 1A)。Gal4/UASシステムを使用して、mpeg1.1またはlyZプロモーターがマクロファージおよび好中球におけるEGFP蛍光タンパク質の発現をそれぞれ(それぞれ)Gal4依存的に駆動する、ライブイメージングのために安定したトランスジェニックゼブラフィッシュラインを生成した。

染色されたC.ディフィシルを5dpfでゼブラフィッシュ腸管に注入し、感染部位を1時間後にインキュベーションを行った後に画像化した。タイムラプスイメージングは、好中球とマクロファージの両方が感染部位に到達したことを示し(図

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ディスカッション

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提示された方法は、注射およびマイクロガベージ10、14の両方を行うことによってゼブラフィッシュ幼虫に感染する既存のアプローチを改変および拡張する。また、ゼブラフィッシュ幼虫22で嫌気性病原体を研究するアプローチを示しています。さらに、このプロトコルは、CDIおよびゼブラフィッシュにおけるC.ディフィシルの植民地化時に生体内での自然免疫細胞応答の分析を容易にする。この方法は、定期的な実験室または臨床環境で再現可能で簡単に行うことができます。

白血球によるC.ディフィシルの食細胞をモニタリングするには、 2つの安定したトランスジェニックゼブラフィッシュライン(例えば、Tg[mpeg1.1:KalTA4]bz16)を使用してマクロファージ(KalTA4:ゼブラフィッシュ最適化Gal4-variant)とTg(lz:KalTA4)...

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開示事項

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著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、優れた動物のケアのためにティモフリッチに感謝しています。私たちは、Kösterとシュタイナートの研究室のメンバーがサポートと有益な議論に感謝します。原稿を批判的に読んでくださったダンダン・ハン博士に感謝します。我々は、ニーダーザクセン州ニーダーザクセン州、ニーデルザクシッシェス・ヴォラブ(VWZN2889)による資金提供に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガローSigma-AldrichA2576超低ゲル化アガロース
アガロース低融解 (LM)Pronadisa8050アガロースプレートに使用されています
BacLight Red バクテリアステインサーモフィッシャーサイエンティフィックB35001蛍光色素
ブレイン・ハート・インフュージョン・ブロスカール・ロスGmbHX916.1
真鍮(野生型)メラニン合成が不足、安定したトランスジェニックラインを生成するために使用される
硝酸カルシウム(Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
毛細管ガラスハーバード装置30-0019注射針
Clostridioides difficileR20291、、リボタイプ027株、TcdA + / TcdB + / CDT +生産
DMSOカールロスGmbHA994
FIJIオープンソースプラットフォーム画像処理
HEPESCarl Roth GmbH6763
水平ニードルプーラーSutter instrument IncP-87
L-システインSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)ライカ画像処理
硫酸マグネシウム(MgSO4)Carl Roth GmbHP026
マイクロインジェクターエッペンドルフ5253000017
マイクロインジェクション 金型適応科学ツールTU1
ライカSP8共焦点顕微鏡ライカ
フェノールレッドSigma-AldrichP0290
塩化カリウム(KCl)Carl Roth GmbH5346
塩化ナトリウム (NaCl)Carl Roth GmbH9265
タウロコール酸Carl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3安定トランスジェニック系統で、好中球
における EGFP 蛍光タンパク質の発現を lyZ プロモーターが駆動しますTg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3安定トランスジェニック系統で、マクロファージのEGFP蛍光タンパク質の発現を駆動します
トリカイン、Sigma-Aldrich、E10521
酵母抽出物、BD、Bacto、212750
ス 。、

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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