細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

質量分析法の応用は代謝の研究に革命をもたらした。標的代謝プロファイリングとメタボロミクストレースにより、エネルギー代謝の変化を正確にモニタリングできます。しかし、メタボロミクスを成功させるには、広範なトレーニング、経験豊富なスタッフ、および高価で機密性の高い質量分析計が必要です。近年、シーホースXFe96などの細胞外フラックス分析装置を用いて、種々の細胞型1、2、3、4、5のエネルギー代謝の変化を測定する代理法として普及している。

精子は高度に専門化された運動細胞です。その仕事は、卵母細胞に父性ゲノムを提供することです。射精後に男性の生殖管を離れる精子はまだ機能的に未熟であり、卵母細胞のベストを貫通できないため、卵母細胞を受精させることができない。精子は、容量^6、7として知られている成熟プロセスで女性の生殖管を通過する時に受精能力を獲得する。カウダ精巣上体から解剖された新鮮に射精した精子または精子は^、Ca2+、重炭酸塩(HCO3−)または細胞透過性cAMPアナログ(例えば、ジブチリルcAMP)、コレステロールアクセプター(例えば、ウシ血清アルブミン、BSA)、およびグルコース(例えば、ウシ血清アルブミン)を含む定義された容量媒体中のインキュベーションによってインビトロで容量化することができる。容量化の間、精子は運動パターンを非対称フラジェラ拍動に変え、過活性化^8、9と呼ばれる水泳モードを表し、卵母細胞のベストを消化するタンパク質分解酵素が放出されるアクロソーム反応⁷を受ける能力を持つようになる。これらのプロセスは、エネルギーを必要とし、および体細胞と同様に、精子は、糖和を介してATPおよび他の高エネルギー化合物を生成するだけでなく、ミトコンドリアTCAサイクルおよび酸化リン酸化(oxphos)10を生成する。複数の研究は、糖質上昇が必要であり、精子の容量^化を支するのに十分であることを示^{しているが、オックス}フォスの寄与はあまり明らかではない。糖分解がTCAサイクルに物理的に結合されている他の細胞タイプとは対照的に、精子は非常に区画化され、これらのプロセスを別々の旗手コンパートメントに維持すると考えられている:ミッドピースはミトコンドリア機械を濃縮し、一方、糖分解の主要な酵素は主片^15、16に制限されているように見える。この区画化は、グリコリシスによって主な部分で産生されるピルビン酸がミトコンドリアオックスホスを中間部分で支えることができるかどうか、そしてミッドピース中のオックスホスによって産生されるATPが、主片^17、18、19の遠位部分のエネルギー要件をサポートするためにフラグラムの長さに沿って十分に迅速に拡散することができるかどうかについての議論を続ける。精子の容量におけるオックスホスの役割のサポートもあります。オックスホスは、糖酸化物よりも精力的に有利であるだけでなく、糖和よりも16倍多くのATPを生成するが、ミッドピース体積およびミトコンドリア含有量は、仲間²⁰のための男性間のより大きな競争度を示す哺乳動物種における生殖適性と直接相関している。これらの質問に対処するには、精子の容量化中に糖質およびオックスホスの相対的な寄与を調べるための方法が必要です。

Tourmenteららは、24ウェル細胞外フラックス分析装置を適用し、有意に異なる精子性能パラメータ²¹と密接に関連するマウス種のエネルギー代謝を比較した。ここでは、非容量性精子の基底ECAR値とOCR値を報告する代わりに、96ウェルの細胞外フラックスアナライザを用いて、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化をリアルタイムでモニタリングする方法を適応させます。酸素のフラックス_(O2)とプロトン^(H+)を測定することにより、最大12の異なる実験条件でフラゲラを打つ精子で糖質およびオックスホスをリアルタイムでリアルタイムにモニタリングできる方法を開発しました(図1A)。糖分解中の乳酸へのピルビン酸の分解とTCAサイクルを介した_CO2の産生により、非容量および容量化された精子は^、H+-感受性フルオロフォアを介して細胞外フラックスアナライザによって検出されるアッセイ媒体に^H+を押し出し、センサカートリッジのプローブ先端に固定化します。並行して、酸化リン酸化による_O2消費は、同じプローブ先端に固定化された_O2感受性フルオロフォアを介して検出される(図1B)。放出された^H+および消費された_O2の効果的な検出は、重炭酸塩またはフェノール赤色なしで低い緩衝能を有する修飾精子緩衝液を必要とする。従って、重炭酸塩の非存在下で容量を誘導するために、広範囲PDE阻害剤^IBMX22と共に注入された細胞透過性cAMPアナログの使用を採用した。3つの追加の独立した注入ポートは、薬理活性剤および/または阻害剤の注入を可能にし、実験的操作による細胞呼吸および糖上昇率の変化のリアルタイム検出を容易にする。

精子は8-16週齢のCD-1雄マウスから採取される。動物実験は、ワイル・コーネル医学の制度的動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認された。

1. アッセイの前日

1. センサカートリッジおよび細胞外フラックスアナライザキャリブラントの調製
   1. センサーカートリッジを水和するには、XFe96細胞外フラックスアッセイキットからセンサーカートリッジを取り外し、ユーティリティプレートの横にセンサーカートリッジを逆さまに置きます。
   2. マルチチャンネルピペットを使用して25mLの二重蒸留_H2Oで溶液貯留部を充填し、ユーティリティプレートの各ウェルに200 μLの_H2Oを加えます。センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻し、37°Cの非_CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。
      メモ:カートリッジは少なくとも4時間は水和する必要があります。
   3. 細胞外フラックス分析装置のアリコート25mLを50mL円錐管に入れ、37°Cの非_CO2インキュベーターで一晩インキュベートする。
2. ConAコーティングマイクロプレートの調製
   1. 2.5mgのConAを二重蒸留_H2Oの5mLに溶解し、0.5mg/mL(w/v)ストックを調製した。
   2. マルチチャンネルピペットを使用して、細胞外フラックスアナライザ96ウェルプレートの各ウェルを0.5 mg/mL Con A溶液の50°Lで充填します。蓋を開けたまま、プレートを室温で一晩乾かします。
      注:複数のプレートを一度にコーティングし、使用できる状態になるまで4週間4°Cで保存することができます。
3. 精子緩衝液の調製
   1. 138 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.7 mM CaCl 2、1.2 mM KH₂PO_4、1.2mM MgSO_4、5.6mM グルコース、および 1 mM HEPES を含む低 HEPESを使用して、250 mL の細胞外フラックスアナライザ TYH バッファーを準備します。バッファーを 37 °C に加熱し、pH を 7.4 に調整します。

2. アッセイの日

1. カートリッジキャリブレーションの準備
   1. ユーティリティプレートの_H2Oをウェル当たりのXFキャリブラントの200°Lに交換し、非_CO2 37°Cのインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートします。
      メモ:キャリブラントの代わりに、無菌フィルタPBS、pH 7.4を使用することができます。
   2. 37°CでのTYH緩衝液の熱50mL。
2. 細胞外フラックスアナライザのウェーブテンプレートの生成
   1. 細胞外フラックス分析装置をオンにし、温度が37°Cに安定するようにします。
   2. Wave ソフトウェアを開き、空のテンプレートを開いて新しいテンプレートをデザインします(補足ファイル 1、Wave テンプレートを参照)。
   3. [グループ定義] タブを開きます。pH 7.4およびマウス精子としての細胞型は、注射戦略と前処理を空白のままにします。アッセイ条件ごとに異なるグループを作成します。この例では、6 つの異なるグループがあります (TYH、TYH + db-cAMP/IBMX、2-DG、2-DG + db-cAMP/IBMX、アント/ロート、Ant/Rot + db-cAMP/IBMX)。ジブチリルcAMP(db-cAMP)および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)は、容量化を誘導し、グリコ分解阻害剤として2-デオキシグルコース(2-DG)、アンチマイシンA(antA)およびロテノン(rot)を電子輸送鎖の複合体IIIおよび複合体Iの阻害剤として挙げられる。
      注:井戸間の変動性を考慮するために、条件ごとに少なくとも7〜8ウェルを並列に測定する必要があります。
   4. [プレート マップ]タブを開き、特定のウェルにグループを割り当てることによってプレート マップを定義します。
      注:4つのコーナーウェル(A1、A12、H1、H12)はTYHバッファ(精子なし)で満たされ、後でバックグラウンド減算に使用されます。
   5. [プロトコル]タブを開き、4つの異なる測定サイクルを追加し、それぞれのポートを選択して測定の詳細を編集します(図2、表1)。注入後の測定値を強調表示し、平衡を強調しないでください。
   6. アッセイ テンプレートを保存し、プロジェクトのサマリーを入力し、結果ファイルの保存場所を定義します。
3. センサーカートリッジにロードする化合物の調製
   1. TYHバッファーに9.8mgの化合物を溶解して50mM db-cAMPの2 mLを調製し、IBMXを5mMの最終濃度に添加します。
      注: IBMX は、TYH バッファーで希釈された後に沈殿する傾向があります。沈殿物は、渦化してTYH/db-cAMP/IBMX溶液を37°Cのヒートブロックに5分間インキュベートすることによって溶解させることができる。
   2. 82.1mgの化合物をTYH緩衝液に溶解して500mM 2-DGの1mLを調製する。
   3. TYH緩衝液中の両方の薬剤を希釈して、AntA/Rotの5μMの1 mLを調製します。
      注:化合物は、細胞外フラックスアナライザカートリッジへの注入によって10倍に希釈されます。したがって、注入溶液が10倍より濃縮されていることを確認してください。
4. マウス精子の分離
   1. イソフルランにより8~16週間の間に3匹の雄マウスを麻酔し、つま先の挟み込み反応がなかった後に頸部脱臼によりマウスを犠牲にした。コーダ上分骨上膜と精巣を取り除く。
   2. 各カウダを24ウェルプレートウェルに500μLの前温TYH緩衝液に入れ、1対の鉗子を使用してプレートの底部にコーダを固定し、羽はさみで5-7小さな切開を行って組織を開きます。
   3. すぐに非_CO2 37°Cのインキュベーターにプレートを移し、精子を15分間分散させます。
5. センサーカートリッジのローディング
   1. ポート A と D およびポート B および C の 2 つのポートローディング ガイドが、セルラーフラックス キットに用意されています。特定のポートをロードするには、センサー・カートリッジからふたを取り外し、それぞれのポート・ローディング・ガイドの文字をカートリッジの左上隅に合わせます。注入中は、非注入手の指先を使用してポートローディングガイドを所定の位置に保持し、ピペット先端をポートローディングガイド穴に垂直に挿入します。
   2. ポート A: マルチチャネル ピペットを使用して、TYH バッファの 20 μL をすべての列に挿入します。
   3. ポート B: 22 μL の TYH バッファーを列 1 から 4 に注入し、500 mM 2-DG の 22 μL を列 5-8 に注入し、5-M AntA/Rot の 25 μL を列 9-12 に注入します。
   4. ポート C: 奇数を持つすべての列に 25 μL の TYH バッファーを注入し、偶数を持つすべての列に 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX の 25 μL を注入します。
   5. キャリブレーションプレートを使用したセンサーカートリッジを細胞外フラックスアナライザに入れ、アッセイを開始します。キャリブレーションには10~15分かかります。
6. 精子プレートの調製
   1. TYH緩衝液(3mg/mL w/v)の15 mLにBSAの45mgを溶解し、それぞれ5 mL遠心管に3 mL BSA/TYH溶液の3つのアリコートを調製する。
   2. 1つの1.5 mL遠心管にそれぞれ2つの精子井戸を組み合わせ、造光計を使用して精子をカウントし、精子を2 x 10⁷精子/mLの濃度に希釈します。
      注:細胞に損傷を与えないように、精子をピペットにするためのカットピペットの先端を使用してください。
   3. 700 x gで3分間精子を遠心分離し、上清を取り除き、TYH緩衝液を1mL加えます。遠心分離工程を繰り返し、上清を取り除き、各精子懸濁アリコートをBSA/TYHの3mLで1本の5mL遠心管に移します。
   4. 180 μLのTYHバッファーをConAコーティングプレートの各コーナーウェル(A1、A12、H1、H12)に入れます。180°Lの精子懸濁液をConAコーティングプレートの各空の井戸(1.2 x 10⁶精子/ウェル)に入れます。
   5. 精子プレートを250 x gで1分間遠心分離し、プレートを180°回転させ、250 x gで再び1分間遠心分離機を1分間(最低制動速度1)行います。
   6. 細胞外フラックス分析装置からキャリブレーションプレートを取り出し、精子プレートを追加します。アッセイを続けます。
7. データ抽出と分析
   1. アッセイが終了したら、カートリッジを取り出し、結果ファイルを開き、[エクスポート]タブをクリックして、完成した実行を GraphPad Prism ファイルとしてエクスポートします (補足ファイル 2:図 3で使用される主要なサンプル データ)。
   2. [新規作成] タブをクリックし、[ファミリの複製] タブ (図 3A)をクリックして、ECAR ファイルと OCR ファイルを複製します。
   3. データの最初の 7 行を削除します (図 3B)。
   4. ベースライン減算行 1 によって、cAMP/IBMX 注入の前のデータ・ポイントに正規化します。[分析] タブをクリックし、[ベースラインと列の数式の削除] タブで、[選択した行を強調表示] タブで、[最初の行]、[計算: 比率:値/ベースライン]、および [サブ列: サブ列を無視]をクリックします。[OK]をクリックします (図 3C)。

この方法では、細胞外フラックスアナライザを使用して、マウス精子の容量中の糖質およびオックスフォスの速度のリアルタイム変化を監視します。図4は、精子が唯一のエネルギー基質としてグルコースの存在下で容量化し、薬理学的モジュレーターとして2-DGとアンチマイシンとロテノンを有する例示的な実験を示す。細胞外フラックス分析装置TYH緩衝液及び薬理調節器内のエネルギー基板は、実験の目的に応じて自由に選択することができる。BSA/TYHの非容量マウス精子は、頭部を介してConA被覆された一過性マイクロチャンバーの底部に取り付けられた。この例では、検出されたすべてのウェル間の平均ベースECAR値とOCR値は、それぞれ12.76±2.75 mpH/minおよび23.64±2.78 pmol/minであった。

TYH緩衝液を用いた模擬注射の後、それぞれ2-DGおよびant/rotの注射を行い、それぞれ、db-cAMP/IBMXの注射により精子の容量を誘導した。

代表的な結果は、グルコースの存在下で、容量が2次元Gで糖上昇を遮断することによって阻害される細胞外酸性化速度(ECAR)の7倍の増加を伴っていることを示す(図4A)。容量化精子は、非容量化精子(図4B)と比較して酸素消費率(OCR)の20倍の増加を示し、マウス精子が糖度および酸化リン酸化の両方を増強し、容量化時のエネルギー需要の増加をサポートすることを実証する。精子容量化時のECARの上昇は、糖化阻害剤2-DGによって阻害されるが、酸化リン酸化阻害剤の抗マイシンAおよびロテノン(図4C)の影響を受けず、ECARの変化が主に糖化からのH+放出によって駆動されることを示す。OCRの増加は、予想通り、抗マイシンAおよびロテノン(図4D)によって遮断されるが、精子容量化中のオックスホスの増加が糖分解活性に依存することを明らかにする2-DG(図4B)によっても阻害される。

図1:細胞外フラックス分析装置の原理(A)糖分解時の乳酸の分解とTCAサイクルを介したCO2の生成により、糖分解およびオックスホスの変化は細胞外媒体へのH+排泄を伴う。XFe96アナライザは、細胞外H+濃度のこれらの変化をECARとして検出します。並行して、酸化リン酸化によるO2消費による細胞外O2濃度の変化はOCRとして測定される。2-デオキシグルコース(2-DG)による糖分解を遮断するか、複合体Iおよび複合体III阻害剤ロテノンおよびアンチマイシンAによる呼吸は、どの代謝経路が精子の容量化中のエネルギー需要の増加を支えているかを明らかにする。(B)マウスの精子は、ConAコーティングされたマイクロチャンバーの底に頭を介して取り付けられます。彼らのフラッグラは自由に動いている。細胞外H+およびO2濃度の変化はH+-およびO2-感受性フルオロフォアをセンサプローブに固定することにより検出されるが、最大4種類の化合物を順次注入することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:例示的な実験の概略表現。ECAR(mpH/min)およびOCR(pmol O2/min)の変化は、細胞外フラックスアナライザを使用して非容量および容量性精子で検出されます。サイクル 1: 基底 ECAR と OCR 値。サイクル2-5:TYHモック注入後のシステム安定化。サイクル 6-8: 薬物インキュベーション.サイクル9-27:精子の容量。矢印は注射を示します。2-DG:最終濃度50mM、AntA/Rot:最終濃度0.5μM、db-cAMP:最終濃度1mM、IBMX:最終濃度500μM.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: データ分析(A)マウス精子容量中のECARの変化の生データ。(B)最初の7つのデータポイントを削除した後のデータ。(C) cAMP/IBMX 注入前のデータ・ポイントに正規化されたデータ。データは、7-8ウェル±S.E.M.注射の平均として示され、矢印で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マウス精子容量における糖質および酸化リン酸化の変化(A) 50 mM 2-DGの有無における非容量および容量性マウス精子における正規化されたECAR。(B) 50 mM MM 2-DGの有無における非容量性および容量性マウス精子における正規化されたOCR。(C)0.5μMアンチマイシンAおよびロテノンの有無において、非容量および容量化マウス精子における正常化されたECAR。(D) 0.5μMアンチマイシンAおよびロテノンの有無において、非容量および容量性マウス精子における正規化されたOCR。データは、db-cAMP/IBMX インジェクションの前にデータ・ポイントに正規化された平均 ± S.E.M として表示されます。n = 6。注射は矢印で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: 測定の詳細

補足図1:細胞外フラックス分析TYH緩衝液中のマウス精子の容量。(A) 25 mM HCO3-,3mg/mL BSA および 20 mM HEPES または(B) 5 mM db-cAMP でインキュベーションした後、容量(0 - 90 分)の容量(0 - 90 分)の間に検出されたマウス精子のチロシン残基のリン酸化 500μM IBMX、および1mM HEPESは、α-ホスホチロシン抗体で検出された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:マウス精子容量中の糖質および酸化リン酸化の変化を検出する波アッセイテンプレート。ウェーブデスクトップソフトウェアは、登録フォーム(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)に記入した後に無料でダウンロードでき、Windows 7、8、または10(Mac OSx 10.11(またはそれ以上)にパラレル12(またはそれ以上)にインストールできます。それにより、波テンプレートは、細胞外フラックス分析装置から独立して生成され、エクスポートされ、任意の細胞外フラックスアナライザの波ソフトウェアにインポートすることができる。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

補足ファイル2:例示的なデータ分析と波のソフトウェアからエクスポートされたグラフパッドプリズムファイル。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

著者たちは何も開示する必要はない。