方法論記事

β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

DOI：

10.3791/60823

⸱

2020年3月10日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Brain and Mind Research Institute, University of Ottawa

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCRは、魅力的な薬剤の標的であることを考えると、GPCRリガンドスクリーニングは、リード化合物の同定や脱孤児化研究に不可欠です。これらの取り組みに向けて、TEVベースのレポーターアッセイを用いて約300 GPCRで一過性β-arrestin2募集の同時プロファイリングに使用されるオープンソースのリソースプラットフォームPRESTO-Tangoについて説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞シグナル伝達経路の範囲の最大かつ最も汎用性の高い遺伝子スーパーファミリーおよびメディエーターとして、Gタンパク質共役受容体(GPCRs)は製薬業界にとって最も有望な標的の1つである。Ergoは、創薬やGPCR薬理学と成果を操作するための遠隔操作ツールを表すため、GPCRリガンドスクリーニングアッセイの設計、実施、最適化が重要です。これまで、Gタンパク質依存アッセイは、リガンド誘導事象を検出し、二次メッセンジャーの生成を定量化するこの分野を代表して行っていました。しかし、機能的選択性の出現以来、他のいくつかのGタンパク質非依存経路およびGタンパク質依存アッセイに関連する限界に対する意識の向上と同様に、代替の作成に向けてより大きな推進があるGPCRリガンドスクリーニングアッセイ。この取り組みに向けて、我々は、そのような資源の1つであるPRESTOタンゴプラットフォーム、ヒトGPCR-omeの並列かつ同時の尋問を可能にするルシファーゼレポーターベースのシステムの適用について述べている。技術的にも経済的にも実現不可能。Gタンパク質独立型β-arrestin2採用アッセイに基づいて、GPDRにおけるβ-arrestin2媒介性人身売買およびシグナリングの普遍性により、PRESTO-TANGOは約100人を含む約300の非嗅覚ヒトGPCRsを研究するための適当なツールとなる孤児受容体。PRESTOタンゴの感度と堅牢性は、既知の薬物の新しいGPCR標的を発見したり、孤児受容体の新しいリガンドを発見するために使用される複合ライブラリを使用して、一次ハイスループットスクリーンに適しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gタンパク質共役受容体(GPCRs)は、膜貫通タンパク質の最大かつ最も多様なファミリーを構成し、細胞とその環境間の通信インターフェースとして動作する1。GPCRsの多様性は、神経伝達物質からヌクレオチド、ペプチドから光子、および多くのリガンドの多様な配列を検出する能力と、細胞増殖、移動、分化、アポトーシス、細胞焼成などに関与する多数の下流シグナル伝達カスケードを調節する能力によって強調される。彼らの普遍性と多くの生理学的プロセスへの関与を考慮すると、この受容体ファミリーは、現在入手可能な処方薬の3分の1以上がGPCRs4を標的としているという事実によって示される、最も治療上の重要さである。しかし、これらの既存の治療法は、スーパーファミリーの小さなサブセット(推定10%)のみを標的とし、多くのGPCRsの薬理学は未解明のままである。さらに、100以上のGPCRsが、内因性リガンド5と一致していないとして、孤児受容体として存在する。したがって、GPCRリガンドスクリーニングは、リード発見と最適化への道を開き、おそらく臨床試験段階に道を開くため、脱ファン化と医薬品開発において重要です。

GPCRリガンドスクリーニング法は、従....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 一次スクリーニング:細胞培養およびプレートシード

  1. ポリL-リジン(PLL)コーティングされたプレートを調製するために、電子マルチチャネルピペットまたは試薬ディスペンサーを使用して白または黒の384ウェル光学底板のPLLの20 μg/mLストック溶液の20 μL/ウェルを分配する。プレートを室温で0.5~2時間インキュベートします。
    注: 黒い 384 ウェル プレートを使用する場合は、白いプレートと比較してバックグラウンド信号が低いことを期待してください。隣接するウェル間の発光のブリードスルーを減らすために、ブラックプレートをお勧めします。
  2. コーティングされたプレートを保存し、余分なPLLを洗い流し、それを流しの上にフリックしてPLLを取り除き、ペーパータオルの上で乾かして、電子マルチチャネルピペットまたは試薬ディスペンサーを使用して抗生物質抗ミキミティックの希釈された1x溶液の40 μL/ウェルを加えます。PLLコーティングされたプレートは、プレートの播種の準備ができるまで4°Cで保管してください。
  3. HTLA細胞(リチャード・アクセル博士が親切に提供)を維持するヒト胚性腎臓細胞株(HEK293T)は、β-アレスティン2-TEVおよびtTA駆動ルシファーゼ-完全なダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で胎児の血清の5%を補い、 牛子牛血清5%、ピューロマイシン2.5μg/mL、ハイグロマイシン50μg/mL、100 U/mLペニシリン、および100μg/mL....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本明細書で提示されたPRESTOタンゴプロトコルを用いて、クロマフィン顆粒(CG)抽出物を168の非嗅覚GPCR標的に対してスクリーニングし、その大半は孤児受容体である。上記の抽出物のプロファイリングは、選択された受容体におけるβ-arrestin2動員を調べることによって、Barneaららによって設計された原理に基づいて行われた(図1)。目的のGPCRのプラスミドcDNAは、PRESTOタンゴGPCRキットから取り出し、所望のレイアウトで2つの96ウェルプレートに組み立てられました。合計で、HTLA細胞を播種した4つの384ウェルプレートがトランスフェクションされ、96ウェルDNAプレートの各半分が完全な384ウェルプレートに作られ、各受容体が2つの象限(合計8つの384ウェル)でトランスフェクトされた。2つの象限のうちの1つはCG抽出物で刺激された;異なる配置で、交互の行 C–D、G–H、K-L、および O–P は(+)刺激を表します (図 2)。一次スクリーニングで.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

立体構造の動的GPCRsは、信号伝達の大国です。これらのヘプタケリカル受容体の結合ポケットの物理化学的性質と、それらの生理学的関連性は、GPCRリガンドスクリーニングツールの必要性を強調している。上記のように、PRESTOタンゴアッセイは迅速で敏感でユーザーフレンドリーであり、医薬品開発に適しています。このアッセイはアゴニスト誘導活性化を測定するだけでなく、アンタゴニストおよびアロステリックモジュレーター19の活性を定量化するためにも使用できる。機能的選択性に照らして、異なる薬物構造が単一の受容体で異なる受容体シグナル伝達カスケードを引き出すことを示唆する概念は、Gタンパク質依存アッセイを用いたGタンパク質経路の活性化とPRESTO-Tangoを用いたβ-アレプチン募集を比較することで、負の副作用を軽減した鉛化合物の設計に手掛かりを与えることができる。特に、Gタンパク質結合の検出からの独立性は、Gタンパク質依存アッセイでは以前は検出されていなかったであろう孤児GPDRの結合パートナーを同定するのに役立ちます。

PRESTO-Tango.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

オートアワーは競合する利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、カナダ保健研究所(CIHR助成金#MOP142219)によって支援されました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
384ウェル光学ボトムプレート、ポリスチレンポリマーベース、細胞培養処理済み、BLACK、蓋付き、滅菌済みNUNC12-566
384ウェル光学ボトムプレート、ポリスチレンポリマーベース、細胞培養処理済み、ホワイト、蓋付き、滅菌済みNUNC12-566-1
384ウェル丸底、ポリプロピレン、未処理、青、非滅菌、蓋なしThermoFisher12-565-390
抗生物質-抗真菌剤Wisent450-115-EL
D-ルシフェリン、ナトリウム塩GoldBioLUCNA
DMEM、L-グルタミン、4.5g / Lグルコースおよびピルビン酸ナトリウムコーニング10-013-CV
Eppendorf Xplorer、12チャンネル、可変、15–300 マイクロ;LEppendorf4861000155
Eppendorf Xplorer、12チャンネル、可変、5–100 & マイクロ;Lエッペンドルフ4861000139
マトリックス プレートメイト 2x3サーモフィッシャー801-10001
MicroBeta 1450 ワラックパーキン エルマー
ペニシリン-ストレプトマイシンWisent450-201-EL
ポリ-L-リジン 臭化水素ミリポアシグマP2636-500MG
ロスラボ プレスト-タンゴ GPCR キットAddgeneキット #1000000068

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
  2. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

2 GPCR HTLA L Glow

関連記事