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方法論記事

哺乳類細胞における細胞内タンパク質センサーのエンジニアリング

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DOI:

10.3791/60878

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2020年4月28日

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

この記事について

サマリー

ここでは、遺伝的にコードされた細胞内タンパク質センサーアクチュエーターをエンジニアリングするためのプロトコールを紹介します。このデバイスは、細胞内抗体(体内)を介して標的タンパク質を特異的に検出し、遺伝子転写出力をオンにすることで応答します。一般的なフレームワークは、イントラボディを迅速に置き換えるように構築されており、一般的なアーキテクチャを変更することなく、任意の目的のタンパク質を迅速に検出できます。

要約

タンパク質は、神経変性疾患、感染症、メタボリックシンドロームなどの病的状態のバイオマーカーとして機能することができます。これらのバイオマーカーを感知して応答するように細胞を操作することは、病理学の根底にある分子メカニズムの理解に役立つだけでなく、新しい細胞ベースの治療法の開発にも役立つ可能性があります。細胞外タンパク質を検出するシステムはいくつか開発されていますが、さまざまな細胞内タンパク質を感知するために簡単に再設計できるモジュール式のフレームワークが欠けていました。

ここでは、細胞内タンパク質を感知し、特定の細胞応答を活性化するモジュール式遺伝プラットフォームを実装するためのプロトコルについて説明します。このデバイスは、細胞内抗体または小さなペプチドで動作し、目的のタンパク質を高い特異性で感知し、TEVプロテアーゼ(TEVp)ベースのアクチュエーションモジュールを介して出力遺伝子の転写活性化をトリガーします。TEVpは、短い同族ペプチドを選択的に切断するウイルスプロテアーゼであり、切断部位に対する高い直交性により、バイオテクノロジーや合成生物学で広く使用されています。具体的には、ハンチントン病、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の感染をそれぞれ検出するための変異ハンチンチン、NS3セリンプロテアーゼ、Tatタンパク質、Nefタンパク質など、ウイルス感染や遺伝性疾患のタンパク質バイオマーカーを認識し、応答するデバイスを設計しました。重要なことは、バイオセンサーの蛍光表示、免疫応答のための抗原提示の刺激、または不健康な細胞を排除するためのアポトーシスの開始など、目的の入出力機能結果に合わせてシステムを手作業で調整できることです。

概要

合成生物学1,2,3では、制御可能な遺伝子回路を介した細胞応答の研究と調節が主要な目標であり、がん4、感染症5、代謝性疾患6、免疫学7における関連する生物学的または医学的応用を持つ有望なツールの開発が進められています。

特定のシグナルに応答して細胞機能を再プログラミングするには、細胞外または細胞内の動的変化の感知(入力)を下流の処理にリンクし、診断目的(レポーター遺伝子など)または細胞応答の再配線(治療)のいずれかで特定の出力をトリガーするスマートインターフェースの設計が必要です。センシングモジュールによって検出される入力は、疾患の発症または進行に特異的な小さな分析物8、タンパク質9、10、11、またはマイクロRNA11、12、13であり得る。さらに、複雑な回路制御は、複数の入力情報処理によって達成することができ、定義された条件14,15,16に応答して導入遺伝子発現に対する厳密な制御を増大させることができる。例えば、マイクロRNAベースのセンサーは、がん細胞などの特定の細胞タイプを識別し、アポトーシス遺伝子の発現によりそれらのクリアランスを誘導することができる13。マイクロRNAは、モジュール式に合成回路に容易に実装可能であるので、それらは、遺伝的にコードされたバイオセンサー12,13,17のための広く使用されているインプットを表す。タンパク質は、遺伝子変異、癌、感染症の有効なバイオマーカーでもあり、実際、多くの細胞外タンパク質センシングデバイスが報告されています18,19。

細胞外タンパク質を検出する回路の多くは、転写因子(TF)を膜につなぎ、TEVp応答性切断部位(TCS)に融合する人工受容体の使用に依存しています。TEVpの主な利点は、切断の特異性と内因性タンパク質プロセッシングへの干渉がないことです。これらのシステムでは、TEVpは第2のペプチドに融合し、細胞外分子の結合時に遺伝子操作された受容体と相互作用します。したがって、外部入力はTEVpを介した切断とTF解放を誘発します。このメカニズムで機能するシステムは、Tango/TEVp18、光誘起20、およびモジュール式細胞外センサーアーキテクチャー (MESA)19である。細胞外タンパク質の検出は進歩しているものの、細胞内タンパク質をモジュール式にセンシングする技術は、特定のタンパク質に応答する単一のデバイスに対して多くのビルドとテストの反復を経るという制限があり、これまで実現されていませんでした。

私たちのシステムは、細胞内タンパク質センシングのための最初のプラットフォームです21。モジュール性は、ターゲットに対する特異性を定義するイントラボディの使用によって保証されますが、細胞のリプログラミングはTEVpを介して行われます。具体的には、1つのイントラボディが膜結合し、C末端に融合して蛍光タンパク質mKate、TCSおよびTF(融合タンパク質1)に融合します。2番目の体内はTEVpに融合し、サイトゾル(融合タンパク質2)に位置します(図1)。

したがって、2つの体内と標的タンパク質との間の相互作用は細胞質内で起こり、TEVpによるTCS切断を引き起こし、その結果、TFが核内に移されて機能出力を活性化します。このセンシング作動装置は、HCVウイルス22によって発現されるNS3セリンプロテアーゼ、HIV感染由来のTatおよびNefタンパク質23,24、およびハンチントン病の変異ハンチンチン(HTT)25の4つの細胞内疾患特異的タンパク質について試験に成功しました。出力発現には、蛍光レポーター、アポトーシス遺伝子(hBax)26および免疫調節剤(XCL-1)27が含まれる。私たちは、システムがその標的の病理学的機能を損なう可能性もあることを示しています。例えば、Nef応答性デバイスは、標的タンパク質を隔離し、感染したT細胞上のHLA-I受容体のダウンモジュレーションを元に戻すことにより、ウイルス感染の拡大を妨害する24。記載されたセンシング作動プラットフォームは、細胞内タンパク質の検出のためのこの種の最初のものであり、診断および治療目的のために、異常なタンパク質発現、翻訳後またはエピジェネティックな修飾を感知するために潜在的に実装することができる20。

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プロトコル

1. センサーアクチュエーターデバイスの建設とテストのための設計原則

  1. 目的のタンパク質を選択します。
    注:細胞質に位置するタンパク質、または細胞質と他のコンパートメントの間を往復するタンパク質のシステムを設計しました。
  2. 標的タンパク質の異なるエピトープに結合する2つの体内を選択します。私たちの研究では、体内がすでに開発されているタンパク質を選択し、28,29,30,31をテストしました。イントラボディが利用できない場合は、新たに開発する必要があります。
    注:イントラボディの代替物は、目的のタンパク質と相互作用する他の分子であり得る。例えば、Nefセンシングデバイスは、1つの体内(sdAb19)およびp59fynタンパク質チロシンキナーゼ32のSH3ドメインを含む。
  3. 融合タンパク質をコードするDNA配列を持つプラスミドをin silicoで設計します。
    注:プラスミド設計用のソフトウェアは、無料または購入可能です。
    1. メンブレンタグ、蛍光マーカー(mKateなど)、 融合タンパク質1の体内、TCSおよびTF、 融合タンパク質2の体内およびTEVpのモジュールを含む配列を生成します。
      注:いくつかのコンポーネントの相互作用に基づいて新しいアーキテクチャを構築するには、標的タンパク質が検出されたときにシグナルの活性化を最大化する可能性のあるパラメータに注意を払う必要があります。具体的には、タンパク質間相互作用を促進するためのキメラタンパク質のTEVp活性と柔軟性に着目しました(表1)。これらの特徴は、すべて以下の点で規定されています。
    2. 柔軟なグリシン-セリンリンカードメイン(LD)を体内-TCSおよび/またはTEVp-体内に挿入します。LDは可変長(0、10または15アミノ酸-AA)であり得る。
    3. 融合タンパク質1:TEVp切断活性を制御するために、高親和性TCS(S)または低親和性TCS(L)を含むバリアントを設計します。このコンストラクトの発現は、構成的プロモーターによって駆動されます。TCSのC末端にGAL4VP16転写因子を含めて、TEVp切断時に核への転座を可能にします。
      注:hEF1aプロモーターを使用しましたが、他の構成プロモーターを選択することもできます。
    4. 融合タンパク質2:構成的(hEF1a)またはドキシクリシン誘導性(pTET)プロモーターを使用して、TEVp転写を調整します。低分子シールドによって制御される分解ドメイン(DD)を使用して、タンパク質の安定性を調節します。
      注:タンパク質発現を調整する他の誘導性システムも選択できる可能性があります。
    5. 出力:転写因子に応答するレポーター遺伝子の下流UASプロモーターを配置しGAL4VP16。デバイスのアプリケーション(蛍光タンパク質、サイトカインなど)に応じて出力を選択してください。
  4. 任意の戦略でクローニングを実行します。ここでは、ゴールデンゲートまたはゲートウェイ技術を使用してプラスミドを構築しました。
  5. 一過性トランスフェクションにより、目的の細胞株におけるデバイスのさまざまな構成をテストします。得られた融合タンパク質1および2のプラスミド、およびUAS-EYFPなどの蛍光レポーター遺伝子と細胞を共トランスフェクションします。融合タンパク質1には、トランスフェクションマーカーとして使用される赤色蛍光タンパク質(mkate)が含まれます。
    注:デバイスをテストするには、HEK293FT細胞などのトランスフェクションが簡単な細胞株から始めます。
    1. HEK293FT細胞でのトランスフェクション。2 x 105 細胞を500 μLのDMEMを含む24ウェルプレートに播種します。トランスフェクション試薬を使用して、300 ngの全DNAで細胞をトランスフェクションし、混合物をボルテックスし、RTで20分間インキュベートします。
      1. 細胞を37°C/5%CO2 インキュベーターに入れます。トランスフェクションの24時間後に新鮮な培地を添加します。
    2. Jurkat細胞でのトランスフェクション。24ウェルプレート用のRPMI細胞培養培地500 μLに3 x 105 細胞を使用します。メーカーの指示に従ってエレクトロポレーションを行います。各サンプルに2〜4μgの総DNAを使用してください。トランスフェクションの24時間後に500 μLの新鮮細胞培養培地を添加します。
      1. エレクトロポレーション中に、細胞とDNAを混合したものを氷の上に置きます。次に、細胞を37°C/5%CO2 インキュベーターに入れます。
        注:デバイスの特定のアプリケーションに応じて、さまざまな細胞株とトランスフェクション方法を選択できます。
  6. 顕微鏡画像を取得して、デバイスの機能を定性的に理解します。融合タンパク質1の膜局在を確認するために、細胞膜に近接した蛍光シグナル(mkate)を検出します。標的タンパク質の存在下または非存在下での蛍光出力(EYFP)を可視化します(ネガティブコントロール-NC)。
    1. Tx RedおよびGFPライトキューブを搭載した細胞イメージングシステムを使用して、mKateおよびEYFP蛍光タンパク質を検出します。10倍または20倍の対物レンズを使用します。
      注:トランスフェクションされていない細胞を使用して、自家蛍光がないことを確認してください。
  7. フローサイトメトリー(FACS)によるトランスフェクションの解析。
    注:サンプル調製については、プロトコル2を参照してください。
    1. 標的タンパク質の存在下でデバイスを評価します。融合タンパク質1と2の変異体を組み合わせた実験マトリックスを作成し、TEVpを(i)構成的hEf1aプロモーター、(ii)ドキシサイクリン誘導性TETプロモーター、および(iii)タンパク質安定性のためのシールドで調節します。ドキシサイクリンを添加し、濃度(0〜1000 nM)で遮蔽します。
    2. FACS分析を実施して、対象タンパク質の有無にかかわらず、サンプル間のEYFPのフォールド誘導を比較します。
      注:最も高いフォールド誘導は、OFF(標的タンパク質の不在)モードと比較して、ON(標的タンパク質の存在)における最大の入力感度に対応します。
  8. 目的のアプリケーションに対するデバイスの機能をテストします。
    1. FACS解析を実行して、出力タンパク質やアポトーシス、またはその他の関連するアッセイのレベルを測定します。
    2. デバイスの出力部分が標的遺伝子の発現レベルを調節している場合、RT PCR解析を行います。ハウスキーピング遺伝子(GAPDHまたは同等)に対する2-ddCT を計算し、ONモードとOFFモードでの出力発現の倍率変化を比較します。

2. フローサイトメトリー解析のためのサンプル調製

  1. トランスフェクションの48時間後にフローサイトメーター(FACS)を使用してタンパク質デバイスの定量分析を実施します。
    1. DMEM培地を吸引し、HEK293FT細胞を300μLのPBSで洗浄します。100 μLのトリプシンを加え、37 °C/5% CO2 インキュベーターに2〜4分間放置します。
      注:Jurkat細胞はトリプシンを必要としません。
    2. フェノールレッドを含まないDMEM培地400 μLを添加し、凝集体の形成を避けるために細胞を再懸濁します。FACSチューブで移します。
    3. 405、488、561 nmのレーザーを搭載したフローサイトメーターを使用してください。
    4. 次のサイトメーター設定を使用して、生細胞集団から選択した30,000〜100,000のイベントを収集します:EYFP / EGFP用の488nmレーザーと530/30nmバンドパスフィルター、mKate用の561nmレーザーと610/20nmフィルター、EBFP用の405nmレーザー、450/50フィルター。
      注:フローサイトメーターのセットアップには、トランスフェクションされていない細胞と単一の蛍光タンパク質でトランスフェクションされた細胞を含めてください。
    5. 採取したサンプルの分析は、お好みのソフトウェア(DIVAソフトウェア、Flowjo、TASBE33メソッドなど)を使用して行います。

3. HCVセンサアクチュエータデバイスの評価

  1. NS3タンパク質を検出するために体内を選択します。scFv35 と scFv162 は 2 つの異なるエピトープに結合するため、選択されました。
  2. ステップ1.3に記載されている合理性に従って、NS3応答性デバイスのバリアントを設計およびテストする(例:融合タンパク質1:膜タグ、mKate、一本鎖フラグメント体内scFv35、LD0、TCS-LおよびTF GAL4VP16;融合タンパク質2:一本鎖フラグメント体内scFv162、LD0およびTEVp;出力:UAS-EYFPまたはUAS-hBax(アポトーシス);NS3 ( 表 2 を参照)。
  3. HEK293FTセルでコンストラクトをテストします。
    注:各実験について、デバイスの送達であるネガティブコントロールを設定し、目的のタンパク質がない場合の定量を出力します。
    1. NS3の存在下または非存在下で、構成プロモーターの下でTEVpについてデバイスをテストします。ステップ1.5.1で説明したように、HEK293FT細胞で融合タンパク質1(ステップ1.3.3)、融合タンパク質2(ステップ1.3.4)、およびEYFP出力ステップ(1.3.5)のトランスフェクションを行います。トランスフェクションの48時間後に、蛍光レポーター(EYFP)をフローサイトメトリー(プロトコル2)で測定することにより、サンプルを分析します。
    2. mKateによる体内-NS3の相互作用と、BFP-NS3融合タンパク質を用いたBFP共局在を評価します。mKateを含む融合タンパク質1とBFP-NS3による細胞のトランスフェクション。トランスフェクションの48時間後、共焦点顕微鏡(63倍対物レンズ)で細胞を観察し、蛍光タンパク質の共局在を試験します。
      注:ネガティブコントロールとしてBFP(NS3に融合していない)を使用します。この状態では、BFPはびまん性の細胞局在を示すべきであり、膜結合mKateと共局在してはなりません。
    3. NS3 が存在するかどうかにかかわらず、pTET プロモーターの下でデバイスの TEVp をテストします。NS3の不在下と存在下でEYFPを比較します。ステップ1.5.1で説明したプロトコルを使用して、融合タンパク質1(ステップ1.3.3)、融合タンパク質2(ステップ1.3.4)、およびEYFP出力(ステップ1.3.5)で細胞をコトランスフェクションします。トランスフェクションは、NS3の存在下または非存在下で行われます。トランスフェクションの48時間後に、蛍光レポーター(EYFP)をフローサイトメトリー(プロトコル2)で測定することにより、サンプルを分析します。
  4. NS3デバイスによって駆動されるセルの殺傷をテストします。
    1. EYFP出力をアポトーシス遺伝子hBaxで置き換えます。
    2. 手順3.3.3を繰り返します。トランスフェクションの48時間後に細胞を採取し、アッセイを開始する前にPBSで洗浄します。
    3. Pacific Blueに結合したAnnexin Vを用いてアポトーシスアッセイを行います。アポトーシスマーカーAnnexin V(2.5 μLのPacific Blueと結合)で細胞を結合バッファー(容量比1:20)で希釈し、室温で10分間染色します。
    4. フローサイトメトリーで細胞を解析します。集団内のアポトーシスレベルをPacific-Blue(Annexin V)陽性細胞の数として計算します。

4. Nef応答性HIVセンサアクチュエータデバイスの評価

  1. Nef にバインドするイントラボディを選択します。単一ドメインの体内sdAb19とSH3は、異なるエピトープに結合するため選択しました。
    注:SH3は体内ではなく、Nefと生理学的に相互作用するp59fynタンパク質チロシンキナーゼのドメインです。
  2. ステップ1.3で説明した合理性に従って、Nef応答性デバイスのバリアントを設計およびテストする(例:融合タンパク質1:膜タグ、mKate、sdAb19、LD0、TCS-LおよびGAL4-VP16;融合タンパク質2:SH3、LD0およびTEVp;出力:UAS-EYFP;Nef( 表3を参照)。
  3. HEK293FT T 細胞と Jurkat T 細胞でデバイスをテストします。
    注:各実験について、デバイスの送達と目的のタンパク質の非存在下での出力定量化であるネガティブコントロールを設定します
    1. HEK293FTのトランスフェクション:Nefの存在下または非存在下で、ステップ1.5.1で説明されている手順に従います。
    2. Jurkat T細胞のトランスフェクション:Nefの存在下または非存在下で、ステップ1.5.2に記載されている手順に従ってください。
    3. トランスフェクションの48時間後、プロトコル2に記載されているように、フローサイトメーターでサンプルを分析します。
  4. Jurkat細胞をHIV LAI株に感染させてHIVを検出します。
    1. 実験の少なくとも48時間前にウイルスストックを調製します。HEK-293T細胞に感染性分子クローン(NIH AIDS reagents program)をトランスフェクションして得られたウイルスと、製造元の指示に従って市販の試薬を使用してください。40時間後に20%ショ糖に1時間、64,074 x g、4°Cの超遠心分離によりウイルスを濃縮し、ウイルス粒子を含まないタンパク質を避けます。HIV-1 p24 ELISAによる力価ウイルスストック。
    2. HIV-1株の細胞に500 ngのp24接種液を感染させます。感染後40時間で、KC57-FITC標識抗体でウイルスタンパク質p24を検出し、フローサイトメトリー解析を行うことにより、感染細胞の割合を定量化します。
    3. AlexaFluor 647標識抗体クローンW6/32でHLA-A、B、Cに対して細胞を染色し、細胞を固定し、フローサイトメーターで解析します。Nefは、タンパク質センサーデバイスの存在下または非存在下で、Jurkat T細胞におけるHLA-Iのダウンモジュレーションを媒介しました。

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結果

モジュール式の細胞内タンパク質検出のためのアーキテクチャ
図1に示すように、このデバイスは、1)膜つながれた蛍光マーカー(mKate)およびTEVp切断部位(TCS)に接続された体内1、続いて転写活性化因子GAL4VP16(TF)で構成されています。2)TEVプロテアーゼ(TEVp)に融合した体内2、サイトゾルに遊離;3)GAL4VP16に応答し、レポーター遺伝子の発現を駆動する合成プロモーター。モジュール性は、任意の目的のタンパク質を標的とするためにプラグアンドプレイ方式で変更できるイントラボディによって保証されています。また、目的のアプリケーションに応じて出力を選択できます。センシングアクチュエーション性能を最適化するための重要な側面は、(目的のタンパク質がない場合)システムのバックグラウンド活性化を回避することです。したがって、デバイスのいくつかの機能を調整しました(表1)。

HCV、ハンチンチン、HIVセンサーアクチュエーター...

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ディスカッション

最近まで、細胞内環境に基づく細胞の調査は、特定の標的に対してde novoで開発されたシステムを使用して行われていました。本プロトコルは、1つのデバイスでタンパク質をセンシングおよび作動するための最新の細胞工学的アプローチの例を説明しています。これは、新しい所望のバイオマーカーに迅速に適応することができます。

この先駆的なシステムは、細胞内タンパク質を感知し、疾患を検出または中和するための特定の出力を提供します。このクラスの遺伝的回路の利点は、体内によって提供されるモジュール性と、Nefセンサーで示されているように、他のセンシング「パーツ」を使用してタンパク質を標的にする可能性です。私たちの知る限り、いくつかの細胞内タンパク質に適用できる可能性のあるシステムは、これまで実証されたことがありませんでした。

モジュラーアーキテクチャにより、研究者はコンポーネントを調整して、任意のアプリケーションに対してデバイスのON/OFF比を最大化できます。これは、最高の機能性...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、Istituto Italiano di Tecnologiaの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AlexaFluor 647 マウス抗ヒト HLA-A, B, C 抗体クローン W6/32バイオレジェンド311414抗体
アネキシン Vライフテクノロジーズ A35122アポトーシスマーカー
AttracteneQiagen301005トランスフェクション試薬
BD ファルコン 丸底チューブBD バイオサイエンス352053FACS チューブ
ドキシサイクリンクローンテック-細胞培養:薬物
ダルベッコの改変イーグル培地Cellgro10-013-CM細胞培養:培地
Evos 細胞イメージングシステムライフサイエンスEVOS M5000システム;感染性分子クローン
FACSDiva8ソフトウェアBD Biosciences659523FACSソフトウェア
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR反応
FBS(胎児ボビン血清)Atlanta BIOS11050細胞培養:ミディアム
ゲートウェイシステムLifeTechnologies-PlasmidConstruction
ゴールデンゲートシステム内プラスミド製造
HEK 293FTInvitrogenR70007細胞培養:細胞
注入 クローニングシステムClonetech638920プラスミド製造
JetPRIME試薬Polyplusトランスフェクション114-15トランスフェクション試薬
ジャーカット細胞ATCCTIB-152細胞培養:細胞
L-グルタミンSigma-AldrichG7513-100ML細胞培養:中型
リポフェクタミン LTX プラス試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック15338030トランスフェクション試薬
LSR Fortessa フローサイトメーター (405、488、561 nm lasers)BD Biosciences649225Flow cytometer
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate (0.1 mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR reaction
Neon Transfection SystemLife TechnologiesMPK10025トランスフェクション試薬
非必須アミノ酸HyCloneSH3023801細胞培養:培地
Opti-MEM I 還元血清培地Life Technologies31985070トランスフェクション培地
ペニシリン/ストレプトマイシンSigma-AldrichP4458-100ML細胞培養: Medium
QuantiTect 逆転写キットQiagen205313Rev 転写酵素キット
RNeasy ミニキットQiagen74106RNA 抽出キット
RPMI-1640ATCCATCC 30­2001細胞培養:ミディアム
シールドClonetech632189細胞培養:薬剤
SpheroTech RCP-30-5-A ビーズSpherotechRCP-30- 5A-2補正セットアップ
StepOnePlus 7500 高速マシンApplied Biosystems4351106qPCR反応
イメージング

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