高分子電解質複合体ミセルの組み立てと特徴付け

サマリー

我々は、設計、組み立て、および高分子電解質複合ミセル、高分子電解質および親水性荷電ブロックコポリマーによって形成されるコアシェルナノ粒子の設計、組み立て、および特徴付けのための代表的なデータを提供する。

要約

高分子電解質複合ミセル(PCM)、水溶液中の荷電ポリマーの自己集合によって形成されるコアシェルナノ粒子は、高分子相互作用の物理学を探索するための強力なプラットフォームを提供し、また、有望なソリューションを提供します。治療オリゴヌクレオチドを生体内に送達するという差迫した問題。PCMの予測構造特性関係の開発は、ナノ粒子自己集合中に強力な運動トラップが存在するため、困難であることが証明されています。本稿では、PCM構築のためのポリマーを選択するための基準について説明し、繰り返し可能な、低多分散性ナノ粒子の組み立てを可能にする塩アニールに基づくプロトコルを提供します。また、光散乱、小角X線散乱、電子顕微鏡によるPCM特性解析についても議論する。

概要

逆に荷電性の高分子電解質が水溶液中に混合されると、それらの対イオンの放出によるエントロピーゲインは、高分子が豊富な凝縮相と高分子枯渇上清^{1、2、3、4、5}に溶液の脱混合を引き起こし、高分子電解質錯体として知られている現象である。中性親水性ブロックが一方または両方の高分子電解質に結合している場合、ナノスケールの相分離が起こる(図1A)。得られた自己集合コアシェルナノ粒子は、様々にポリ電解質複合体ミセル(PCM)と呼ばれ、ポリイオン複合体ミセル、ブロックイオノマー複合体、または界面活性剤ミセル化にたとえよるコアミセル、システムのすべての構成要素が親水性^6、7であるにもかかわらず。PCMのタンパク質や核酸などの親水性分子をカプセル化する能力、ならびにブロックコポリマーキャリアアーキテクチャによって提供される広範なツナビリティは、それらの治療分子を生体^{8、9、10、11、12、13}で送達するための魅力的な候補となる。

細胞標的に治療用核酸を送達することは特に重要な課題であり、PCMにはいくつかの利点があります。治療用核酸(遺伝子DNA、mRNA、およびsiRNAなどのオリゴヌクレオチド)は、ヒトの健康を改善する大きな可能性を有するが、その電位^14、15、16を実現するためには多数の生物学的および物理的障壁を克服しなければならない。裸の核酸は血清および細胞ヌクレアーゼによって分解され、急速に循環から取り除かれ、その強い負電荷は助けを借りずに細胞膜に浸透することを困難にする。これらの障壁を克服するための現在のアプローチは、疎水相互作用^15、17、18を介して組み立てられた種々の脂質ナノ粒子へのヌクレアーゼおよび/またはカプセル化による損傷を防止するための高価な化学修飾を含む。これらの方法は局所的な注射および肝臓の標的化に有効であることが証明されているが、全身使用は毒性、免疫原性、および限られた生体分布¹⁶の重大な限界を提示する。対照的に、PCMは核酸の負の電荷を使用して相分離コア内でそれらを凝縮し、中性コロナは分解に対する立体障壁を提供し、リガンドを組み込んで標的化または内在化を強化するプラットフォーム^11,19を提供する。インビトロおよび動物研究では、PCMは様々な核酸ペイロード20、21、22、23、24を効果的に送達できることが示されていますが、構成ポリマーの特性からサイズ、形状、安定性などのPCM特性を予測する能力の弱点は、より広い採用を妨げている。

我々のグループや他の分野の他の人々による最近の研究は、構造特性を開発することによってこの問題に対処し始めており、いくつかのケースでは、核酸と様々なカチオン中性ポリマー^{7、25、26、27}から形成されたPCMのための構造特性と機能の関係を構築しています。これらの研究から生まれた2つの一貫したテーマは、PCMアセンブリのための十分に制御された再現可能なプロトコルを開発することの重要性と、得られるナノ粒子を特徴付けるために複数の技術を使用することの利点です。高電解質、特に核酸のような高い電荷密度を有するものは、互いに非常に強く相互作用し、混合時にキネティックに閉じ込められて容易に見え、その結果、手順の小さな変動に対して高感度で、バッチからバッチへの高い多分散性と再現性の悪さを示すPCM製剤が生じる。PCMは、部品の原子レベルの構成に応じて幅広い形状とサイズを採用することも示されており、特にダイナミック光散乱(DLS)などの一般的な技術では粒子形状に関する仮定が必要なため、個々の特性評価技術でこの多様性を捉えるのが非常に困難です。

本稿では、オリゴヌクレオチドとカチオン中性のジブロックコポリマーに焦点を当てて、PCMの材料設計と選択について議論する。次に、PCM アセンブリ中の運動トラップを回避するために、高い塩濃度を使用し、低速透析を行う塩アニールプロトコルについて説明します。高電解質は、静電的なアトラクションがスクリーニングされる高塩条件で混合され、その後、塩濃度をゆっくりと低下させ、熱アニーリングの遅い冷却プロセスに似た、高分子電解質が最も精力的に有利な構成に落ち着くことを可能にする。このプロトコルを使用して、オリゴヌクレオチドPCMs^7、26の非常に低い多分散性と高い再現性を定期的に達成することができます。最後に、外部形態から内部構造まで、幅の広いスケールでPCMを特徴付ける4つの個別の測定技術(DLS、マルチアングル光散乱(MALS)、小角X線散乱(SAXS)、透過電子顕微鏡(TEM)の4つの異なる測定技術を説明します。私たちは、これらのプロトコルにより、より多くの研究者がこれらの興味深いナノ粒子の能力を効果的に探求することを可能にすることを期待しています。

ポリマーの選択と調製
PCM特性は、構成ポリマーの物理的および化学的特性に強く影響を受け、設計プロセスにおける重要なステップとしてポリマーを選択します。核酸PCMの最もよく特徴付けられるブロックコポリマーは、ポリ(リジン)-ポリ(エチレングリコール)(pLys-PEG)のような線形二重ブロックであるが、PCMは高いスループット²⁸で生成することができる多電解質と様々な親水性中性荷電ポリマーの間で形成することができる。荷電群の選択はミセル²⁶のイオンペアリングおよび形状の安定性に強く影響し、PCMサイズは、充電ブロック^5、7、26(図2)の長さに伴って増加することが示されており、PCM特性は所望のアプリケーションの要件に合わせて調整することが可能である。線形ディブロックの場合、荷電ブロックは少なくとも10の電荷を持ち、所望のpHで強く充電されるべきであることがわかりました。より長い荷電ブロックは、siRNAなどのオリゴヌクレオチドを用いたPCM形成を促進し得るが、これは短いブロック²¹との複合体化が困難である。我々は、最大200のブロック長でPCM形成を観察することに成功しており、文献はより長いポリマーを記述している。ニュートラルブロック²⁴の選択では柔軟性が高いが、経験上、ナノ粒子形成ではなく凝集に至る非常に短いニュートラルブロック、および最小中性の長さが帯電したブロック長で増加することが示されている。pLys-PEGの場合、〜50未満のpLysの長さには少なくとも3,000~5,000のPEGMWが必要であり、チャージブロックがさらに増加するにつれて長い長さが必要です。ニュートラルブロック長の増加により、中性ポリマーの立体混雑によるPCMサイズ、特にシェルの厚みが増加します。

この原稿は、凍結乾燥した高純度のpLys-PEGおよび既知の量のオリゴヌクレオチドからPCMを調製するためのプロトコルを提示するが、他のシステムにも容易に適応可能であるべきである。ポリアルギニンやポリグルタミン酸をはじめ、ポリアクリル酸やポリ(ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)などの合成ポリ電解質を挙げ、いくつかの荷電ポリペプチドを用いて試験を行いました。また、多電荷の量論比を持つPCMの準備についても説明していますが、これは容易に変更できます。私たちは、充電濃度単位(c.c.)で作業するのが最も簡単であり、完全に充電されていないポリマーにも自然に対応しています。いずれかのポリマーが十分に特徴付けされていない場合は、ポリマーの長さ/質量を正確に決定し、透析による電荷中和に必要な量を超えて余分な塩が存在しないことを確認する必要があります。任意の保持水の存在は、濃度が計算されたときにも考慮する必要があります。核酸濃度は、260 nmでの吸光度によって簡便に定量することができ、c.cを計算する際には末端リン酸塩の有無を考慮する必要があります。

ポリアニオンとしてオリゴヌクレオチドを使用する場合、ハイブリダイゼーション状態および化学構造は、自己集合性に対する傾向および得られたPCM^5、7、26の特性を決定するのに役立つ。これらを最適化すると、配信にPCMを使用する場合の生物学的有効性の要件の範囲内で、所望の構造を形成する可能性が高くなります。ハイブリダイゼーションの分析に役立つツールには、核酸の MATLAB 関数、NUPACK²⁹、および IDT オリゴ アナライザーがあります。1)に結合する強さを理解するために候補配列を分析することを推奨します。2)同じシーケンスの別のコピー(自己ダイマー);そして3)系に存在する他のオリゴヌクレオチドに対する。特定の配列のDNAおよびRNA融解温度は、近傍法^30,31を用いて計算することもできる。核酸の熱アニーリング(ステップ2.3)は、個々のヌクレオチド中の残留二次構造を変性させ、平衡折りたたみを促進します。

PCM の特性評価と分析
静的・動的光散乱、電子や中性子の小さな角度散乱、電子顕微鏡など、ナノ粒子を特徴付けるための幅広い技術が利用可能です。本稿では、小角X線散乱法と2つの電子顕微鏡技術の2つの光散乱技術に関するプロトコルを提供する。

DLSは、サンプルのブラウン運動から一角度で散乱強度の時間的変動の自己相関を測定します。このデータをフィッティングすることで、球体ミセルの流体力学半径と多分散性を提供できます(図3)。マルチアングル光散乱(MALS)は、多くの角度で静的散乱強度を測定します。この角度依存性はナノ粒子の形状を表しますが、可視光の場合は約50nmを超える長さスケールに制限され、より小さなナノ粒子に対する有効性が制限されます。どちらの手法も屈折率の不一致に基づいており、主にナノ粒子の外側の寸法を記述しています。

小角X線散乱(SAXS)は、散乱プローブとしてX線を使用し、その短波長は、〜0.1〜100nmの範囲にわたって測定を可能にします。観察された散乱強度対角度(従来は運動量移動q)にフィッティングすることで、PCMの形態(サイズと形状)および内部構造に関する情報が提供されます。絶対強度キャリブレーションが可能で、散乱強度をゼロ角度に外挿できる場合、PCM質量と凝集数も³²と推定でき、SAXSは非常に汎用性の高い貴重な方法です。小角中性子散乱(SANS)は、長さのスケールの同様の範囲にわたって敏感であるが、専門施設でのみ利用可能であり、この記事33、34、35で明示的に議論されません。

近年、ベンチトップSAXS機器の登場が見られますが、これらの低コントラストサンプルのデータを高速に収集できるため、シンクロトロン源はPCMの特性評価に適していることがわかります。ユーザーの視点から高度なフォトンソース(米国アルゴンヌ国立研究所)でビームライン12-ID-BでPCM SAXSデータを取得するための簡単なプロトコルを提供します。このプロトコルは、ほとんどのシンクロトロン源に適用可能であるべきですが、実験を提案する前に現地スタッフと相談することを強くお勧めします。また、Irena^36、イゴールプロのために書かれたマクロの自由なセットを使用して、データの削減と分析プロトコルを提供します。Irena には、SAXS データをモデル化するための多彩なフォーム ファクタが含まれており、PCM の複雑な散乱プロファイルを記述できるマルチコンポーネント モデルを構築できます (代表的な結果を参照してください (図 4参照)。Irenaには、オンラインで利用可能な包括的なドキュメントとチュートリアルもあります。以下の手順を試す前に、これらのチュートリアル、特に「2つの主要な散乱母集団を持つSAXSデータのモデリング」に精通することをお勧めします。

放射線の損傷はX線散乱の問題ですが、それを最小限に抑えるためにいくつかの対策を講じることもできます。特に、密閉キャピラリーではなく、データ取得中に流れるシリンジポンプとPCMサンプルを備えたフローセル設定を使用することをお勧めします。これにより、背景の減算も大幅に簡略化されます。また、サンプルの単一の体積が見るフラックスを制限し、暴露データの比較を可能にするために、1つの長いサンプルではなく、流れるサンプルの複数の暴露を取ることを提案します。

一般的に解釈にフィッティングを必要とする散乱技術とは対照的に、透過電子顕微鏡(TEM)は、試料を電子ビームを通過させ、シンチレーションスクリーン上に画像を投影することによって、ナノ粒子の実際の空間視覚的な画像を提供する(図5)。この記事では、2 つの TEM 手法のプロトコルを紹介します。Cryo TEMは、ミセルサンプルを薄い層の水晶体に凍結し、最小の異物で構造コンフォメーションを維持し、半径内のミセル≤〜10〜100nmに最適です。マイナス染色剤TEMは、グリッドの表面で乾燥した後、試料を取り囲むために重金属塩(例えばウラン)を使用する。密な汚れは、サンプルよりも多くの電子を散乱させ、コントラストを加え、サンプルの負の画像を生成します。Cryo TEMは、高品質の画像に推奨されます。しかし、それはより高価で、時間がかかり、十分なコントラストを提供しない可能性があります。これが懸念される場合は、陰性染色サンプルを使用する必要があります。それぞれの例を図 5に示します。

これらの技術のそれぞれは、異なる強みと制限を持つナノ粒子のわずかに異なる側面を報告します。光散乱は容易に利用でき、多くの場合、最も高速なアプローチですが、サイズと形状の解像度にかなりの制限があります。SAXS は、かなり高いスループットで、長さのスケールの広い範囲にわたって情報を提供できますが、データを取得するための特殊な装置と、それを解釈するためのモデリングが必要です。TEM イメージは解釈が簡単ですが、コントラストが制限され、本質的にスループットが低くなります。我々の経験では、複数の技術を用いて特性化を行うと、PCM特性について得られる情報が大幅に増加し、各々から得られたデータセットの解釈が簡素化されるということが分かってきた。例えば、SAXSとTEMは主にPCMの高密度コアを調べる一方、光散乱はナノ粒子の全体的な寸法を報告する。従って、それらを組み合わせることによって、コアおよびコロナサイズの両方の測定が可能になる。実空間画像を取得する TEM の機能は、根拠の真実データを提供して、あいまいな SAXS データをモデリングするための適切なフォーム ファクターを選択できるようにします。この資料では、4 つの手法すべてに対するプロトコルについて説明し、これらのプロトコルを使用して不明なサンプルを特徴付けるプロセスの例については、「説明」セクションで説明します。

プロトコル

1. 材料の調製

1. 凍結乾燥ジブロックポリマーを計量し、10 mg/mLの最終濃度のストック溶液に必要なほぼ体積まで水を加えます。2分間の最高速度で渦。
2. 超音波処理 5 分. 非常に長いディブロックは、追加の超音波処理を必要とすることがあります。ストックソリューションは、完全に透明で均質に見えるはずです。
3. 必要に応じて NaOH または HCl を使用して pH を 7.4 に調整します。最終ボリュームに水を加えます。pLys-PEGソリューションはかなり安定していますが、長期保存のために冷蔵する必要があり、pHは使用前にチェックする必要があります。凍結する場合には凍結が好ましい。
4. 凍結乾燥オリゴヌクレオチド(s)を所望のストック濃度で再懸濁し、通常は50nt以下の長さに対して2〜5mMの分子濃度を有する。完全な溶解を確実にするために徹底的に渦。
5. 「はじめに」で説明されているように、分子量または長さを使用してモル濃度を計算します。
6. モルチャージ濃度(c.c.)を計算する

この高分子電解質電荷は荷電モノマーの数であり、一方、核酸電荷は塩基数マイナス1であり、リン酸化を前提としていない。二本鎖DNAは、一本鎖DNAと比較して分子あたり2倍の電荷を持つことに注意してください。

7. 各ポリマーに対して20 mM c.c.c.で希釈ストックを作成します。

2. 核酸多価系ミセルの調製

1. 1.5 mLマイクロ遠心チューブで、合計280μLに以下を混合します。
   1. ヌクレアーゼフリー水(核酸を含まないPCM用超純水)の200μL。
   2. 40 μLの10μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、137 mMの塩化ナトリウム、10 mMリン酸、pH 7.4 1xに希釈した場合)または他の適切な緩衝液^37。
   3. 20 mM c.c. オリゴヌクレオチドの 40 μL.二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、20 mM c.c.c.に各鎖の20 μLを加えます。
2. オリゴヌクレオチド溶液を70°Cで5分間インキュベートする。オリゴヌクレオチドの融解温度が高い場合、それに応じて温度を上げる必要があります。RNA は高温で分解されるので、この工程や他の敏感な成分が存在する場合は、このステップを長くしないでください。
3. 15分間冷却し、20 mM c.c.ディブロックの40 μLを加え、最大速度で20秒の間すぐに渦を引きます。室温(RT)で5分間インキュベートします。
4. 塩アニールを行います。
   1. 5 M 塩化ナトリウムの80 μLを加え、最終濃度は1M NaCl、最終体積は400μLです。最高速度で10 sのための渦。
   2. 室温で10分間インキュベートし、透析カートリッジに入ります。記載されている分子量カットオフは球状タンパク質に対して決定され、線形ポリマーでは正確ではありません。2k MWCOカートリッジはサンプル損失を回避し、イオン強度の緩やかな変化を提供する。
   3. 透析風呂を準備します。
      1. 必要な透析浴の体積を計算します。
         
      2. 10x PBS(または他の所望の緩衝液)、5 M NaCl、および1x PBSと0.5M NaClの最終溶液のための超純水、ならびに1x PBSの2つの溶液を混合する。
   4. 透析カートリッジをロードします。
      1. 永久マーカー付きのラベルカートリッジ。カートリッジを少なくとも2分間バッファーに浸して、膜を水和します。
      2. 反時計回りにねじってキャップを外します。ゲルローディングピペットチップを使用してサンプルをロードします。膜をやさしく絞って余分な空気を取り除きます。キャップを交換してください。
      3. 1x PBS、0.5 M塩化ナトリウム透析浴にカートリッジを入れます。カートリッジは、両方の膜が浴にさらされ、浮遊する必要があります。泡の浮遊物は必要に応じて使用することができる。
   5. 透析
      1. 磁気攪拌バーでゆっくりと攪拌する24時間インキュベート。
      2. 1x PBSまたはその他の必要な作業バッファーの新しい浴場にカートリッジを移動します。24時間インキュベートし、磁気攪拌バーでゆっくりと攪拌する。この手順を繰り返します。
   6. サンプルを回復します。
      1. お風呂からカートリッジを取り外します。キャップを取り外し、ゲルローディングピペットチップを使用してサンプルを回収します。なお、回復された体積は、膜の膨潤による初期の400μLよりも高い場合があることに注意してください。わずかな希釈が懸念される場合は、ボリュームを回復した記録。
      2. サンプルを清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、清潔な1.5mLのマイクロ遠心チューブに入れ、清潔なチューブに入れ、清潔な1.5mLのマイクロ遠心チューブに入れ、この方法で調製されたPCMは、ヌクレアーゼ汚染が回避されていれば、冷蔵時に数ヶ月間安定しているべきである。

3. 動的光散乱

1. ダストフリーの状態を確保するために、バッファーは慎重に濾過し(0.22 μmのシリンジまたは真空フィルターを通して3倍ろ過ろがれる)、ガラス製品はサンプル間で完全に洗浄する必要があります。測定を行う前に、サンプルが熱平衡に達していることを確認することも重要です。
2. PCM サンプルを 0.2 mM c.c. (上記のプロトコルを使用する場合は 10x) に適した作業バッファーを使用して希釈し、適切なキュベットにロードします。微量キュベットを使用し、希釈後に約200μLのサンプルを必要とします。
3. DLS検出器の位置を90°に設定します。
4. 可能であれば、1 秒当たり 100,000 ~ 200,000 カウント (cps) になるように、レーザーパワーまたは減衰器を調整します。カウント率は10kcpsまで低く使用できますが、良好な統計を得るために測定時間を延長する必要があるかもしれません(ステップ4.1)。複数の散乱が測定を混乱させるので、より高いカウント率は避けるべきです。
5. 1分間のデータを取得します。カウントレートは、取得時間全体にわたって一定である必要があります。そうでなければ、サンプルまたは計測器の一部のコンポーネントがまだ平衡していないことを示します。
6. 自己相関データを調べます。図 3Aに示すように、長い基準線は非常に平坦で、自己相関曲線は最小限の散布で滑らかでなければなりません。ベースラインドリフトは平衡状態の欠如を示し、より多くのデータを取得することによってデータのノイズを改善することができます。
7. フィット自己相関関数。
   1. REPES^38,39を使用して、緩和時間と拡散係数Dの分布を提供するために規則化された逆ラプラス変換を実行します。次に、ストークス-アインシュタイン方程式を使用して、流体力学半径R_hを計算します。
      
      図1Bは_Rhの表現を示し、図3BはREPESの結果を示す。
   2. あるいは、CONTIN^40、41 (代替規則化アルゴリズム)、または非負最小二乗継 (NNLS) を含む他の方法を使用します。複数のフィッティング方法からの一貫した結果は、高品質のデータのシグネチャです。積層解析(多くの計測器で標準)は、マルチモーダルサイズ/長さの分布に非物理値を与えます。

4. 多角光散乱

注:光散乱強度対角度は、さまざまな機器で測定できます。我々は、ゴニオメーターベースの機器と複数検出器の機器の両方を使用して、バッチモードで実行して良好な結果を得ています。

1. 検出器を飽和させることなく、あらゆる角度でバッファ専用のサンプルに対して十分な信号/ノイズを提供するために、PCMの濃度と照明強度を調整します。後者は、様々な希釈因子でサンプルを調製し、強度対濃度の直線性をチェックすることによってテストすることができます(PCM間の相互作用が最小限であると仮定します)。
2. 光散乱率を15°から135°に記録し、角度ごとに1分で記録します。サンプルと器具が適切に平衡化されていれば、散乱率は測定時間の経過とともに一定になります。
3. 正規化された散乱率をプロットし、isin(θ)対q、ここで私は散乱率です。qは、散乱ベクトル(フォトン運動量転送)で定義されます。

η =溶媒屈折率、θ=測定角度、λ=光源の波長。図4は、MALS散乱強度のプロットを示す。

5. 小角X線散乱

1. データ取得
   1. 上のバックグラウンドを十分に散乱させるオリゴヌクレオチドPCMに対して、上記の2 mM電荷濃度でPCMサンプルを調製してください。重い原子を欠くPCM(例えば、核酸中のリン)の場合、より高い濃度が必要になる。SASSIE⁴²などの電卓を使用して、散乱の長さの密度を推定できます。
   2. フリーラジカルを清掃することで放射線被害を最小限に抑えるために、濃縮物からグリセロールを添加(例:50%)ミセル溶液が1%(v/v)グリセロールを含むように、ストック溶液。きちんとしたグリセロールは粘性が高く、正確に測定することは困難であることに注意してください。水またはバッファーで希釈することを強くお勧めします。
   3. バックグラウンドモニターとして使用するために1%グリセロールを使用して、大量の作業バッファーを準備します。
   4. ビームライン特異的フローセル装置と較正検出器を準備する。このプロトコルは、小さな直径と最小長のポリエチレンチューブを備えたコンピュータ制御のシリンジポンプに接続された直径3mmの石英キャピラリーを使用します。このセットアップでは、サンプルあたり最大140 μLの最小量が必要です。
   5. サンプル露出パラメータを決定します。最適な露光は、ビーム強度、検出器感度、およびサンプルの濃度、散乱強度、および損傷感受性に基づいて変化しますが、目的は、目的のq範囲にわたって十分な散乱強度を得るために必要な最小限のフラックスにサンプルを曝露することです。
   6. オリゴヌクレオチド/プリスペグPCMの場合、1Hzの繰り返し速度で30x 0.2秒の暴露は、ほとんど知覚できる損傷を与え、良好なデータ品質を生成します。新しいサンプルの場合、次の手順が役立ちます。
      1. 濃度の範囲(例えば、10~10,000 μM c.c.c.)でPCMサンプルを準備します。
      2. 中間濃度から開始し、さまざまな露光時間を持つ代替PCMおよびバッファ専用サンプル。データの取得と縮小の手順については、以下を参照してください。サンプル信号は良好な統計量(小さい統計的誤差、またはq全体のスムーズな変動)を有するべきである。統計が悪い場合、露光時間が増加する可能性があります。
      3. サンプル信号も、目的のq範囲にわたって背景から明確に区別できる必要があります。(シグナル–バックグラウンド)/バックグラウンド比とq比を計算してプロットし、信号/背景比率を決定します。シグナル/バックグラウンド比が低い場合は、サンプル濃度を高くする必要があります。
      4. 散乱強度(濃度に正規化)が、より高い濃度と低濃度のデータを取得し、必要に応じて露光時間をスケーリングすることによって、サンプル濃度とは無関係であることを確認します。粒子間相互作用(濃度依存の最も可能性の高い原因)は、低q範囲で最も顕著になります。
   7. PCM サンプルと背景 (グリセロールを含むバッファー) のデータを取得します。
      1. シリンジポンプをトリガーして、サンプルを毛細血管内に移動します。双方向または一度に通過する動作は許容できますが、各サンプルを分離する(例えば、サンプル間に気泡を挿入することによって)注意が必要です。サンプルは回収され、放射線による損傷が見られない場合は再利用できます。
      2. フローが開始されたら、上述のX線露光およびデータ収集プログラムをトリガする。流体の流れが行う前にビームの露出が終了することを注意する必要があります。
   8. 各サンプルの後、各露出の1Dプロファイル(すなわち、強度対q)を一緒にプロットして、方位平均を行います。これらは、統計的誤差内で同一である必要があります。時間の経過とともに信号を変化させると、放射線の損傷を示す可能性があります。
      1. 単離された異常プロファイルは、マイクロバブルの存在を示す可能性がある。気泡が頻繁に観測される場合、流量を減らすことが助けになるかもしれません。
   9. 1D 散乱プロファイルの平均値。
   10. バッファーのみのサンプルのデータを頻繁に取得し (4 ~ 5 個の PCM サンプルごとに 1 回)、時間の経過と同時に比較します。バッファのみのサンプルからのシグナルが増加した場合、毛細血管が放射線損傷サンプルで汚染されている可能性があることを示します。
       1. 汚染が気づいたら、毛細血管を漂白剤で洗い、可能であれば露光時間を短縮することを検討してください。
2. イレーナを用いたデータの削減と分析
   1. ミセルおよびバックグラウンド ASCII データ・セットをインポートします(SAS/データのインポートとエクスポート/ASCII SAS データのインポート)。
   2. サンプル データから背景散布を減算します。通常、qの最高値(例: q > 0.5)は、信号を支配する溶媒からの支離滅裂な散乱を示します。このq範囲でのサンプル データに一致するようにバックグラウンド データをスケーリングすると、ビーム強度の変動とサンプル濃度による変動が除去されます。
      1. 対数目盛りでサンプルと背景をプロットします。高い q (SAS/データ操作/データ操作 I)でフラット強度を確認します。サンプル/バックグラウンド比(Data1/Data 2)を計算し、線形対数スケールでプロットし、高- q asymptote を検証します。
      2. このq範囲の平均 (サンプル/背景) の比率を計算します (カスタム マクロを使用するか、データ ブラウザーからスプレッドシートにコピー/貼り付けます)。
      3. データ操作マクロを使用して、上記で計算した比率を使用して背景をスケーリング (たとえば、データ 2の変更) を行い、背景減算信号と背景に対する比率をq ([Data1-Data2]/Data2)とプロットします。この比率を記録します。各サンプルの 1.0 から 1 ~ 2% 離れている必要があります。
      4. 背景から減算されたシグナル (Data1-Data2) とqをプロットし、新しい名前でデータを保存します。元のデータを上書きしません。
      5. 高-qデータが使用できない場合は、背景の減算に 1 のスケーリング係数を使用しますが、シグナル/バックグラウンド比が小さいq範囲で不正確さが発生する可能性があることに注意してください。
   3. モデリングマクロ (SAS/モデリング) を開き、背景から差し引かれたデータを読み込んでプロットします (データ cntrls/Add data) 。このマクロでは拡大縮小しないでください。
   4. まず、PCMの外部サーフェス(ミセルサイズ/形状)の近似モデルを見つけます。
      1. [データ cntrls]で、低 ~中程度のq範囲を選択します (例: ~0.003Å^-1 < q < ~0.1Å^-1)。振動が表示されている場合は、それらを含めます。
      2. データに適したフォーム ファクタを選択します。低いqの傾きはナノ粒子の形を示す、またTEMおよび/またはMALSを通して確認することができる。シュルツ-Zimmスフェロイド(q^0)、シリンダー(q^-1)、または柔軟な円筒(q^-2)モデルを使用してください。イレーナは電力法を適合するためのツールを提供しています(SAS/プロットとテーブルのサポートツール)。
      3. [モデル cntrls]で最初の散布母(1P)を選択し、それが唯一使用していることを確認します([使用]チェックボックスを選択します)。
      4. [モデル] で[サイズ分布]を選択し、目的の分布タイプとフォーム ファクター を選択します。[尺度]、[平均サイズ]、および[幅]フィールドに値を入力して検索の初期パラメータを設定し、[モデル計算]をクリックして結果のフォームファクタを描画します。
         注: フレキシブル シリンダ フォーム ファクタは、ユーザー フォーム ファクタとして追加し、https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irenaからダウンロードできます。パラメータ 1 と 2 は、それぞれ円柱の長さと Kuhn の長さに対応します。
      5. 妥当なパラメータが見つかったら、[モデルに合わせる]をクリックして、データに適合する非線形最小二乗を実行します。サイズ分布モデルは、半径と幅の平均を示します。
         多分散性(PDI)の使用を計算するには
         
         非線形フィッティング手順と同様に、安定した物理的に合理的な適合を得るためには、データ範囲(q領域)および開始パラメータを調整する必要があります。
      6. 合理的なフィット感が得られたら、それを保存します(ノートブックに保存/フォルダに保存)。
   5. 次に、PCMコア内の個々のポリマーの散乱をモデル化する。これは電力則モデル(例えば、理想の鎖のq^-2、膨れ上がった鎖の場合は^q-5/3など)によって捕捉することができる。イレーナは、ボーケージモデル⁴³を通じてこれを実装します。
      
      ここでPは電力則であり、GとBは因子です。
      1. q範囲全体をカバーするようにデータ コントロールを調整し、モデルを再プロットします (モデルの計算)。通常、過剰な散乱は中程度から高いq範囲(例えば、q > ~0.1Å^-1)で観察されます。
      2. データ コントロールを使用して、過剰な散布 (フォーム ファクター モデルの 10 倍) が観測されるq範囲を選択します。
      3. 2 番目の散布母体 (2P) を追加し、それが使用されている唯一の散布図であることを確認します(1Pの場合は[使用] の選択を解除します)。
      4. モデルの [統一レベル]を選択します。B と P は関連するパラメータです。プロット支援ツールまたはcsrsマクロ間の適合P/Bを使用してこれらのパラメータの初期推測を取得し、ギニエ因子Gと_Rgを調整して、モデルが低いqで過度の散乱を予測しないようにします。
      5. フォーム ファクタについては、非線形適合を実行し、パラメータとモデルを記録します。
   6. 次に、図 4のように回折ピークが存在する場合は、対象のq範囲(q = ~0.22 Å^-1)の回折ピークに対する第 3 のモデルを追加します。
   7. 個々の散乱集団に対する近似適合値が得られたら、3 つすべてをオンにして (それぞれに使用を選択)、結合された適合を最適化します。
   8. 各値が物理的に妥当であることを確認します。この手順の結果は、図 4に示すように、SAXS データを広範囲にわたるサイズスケールで十分に記述した複合モデルにする必要があります。[フォルダに保存]ボタンを使用して、イゴール内に保存するフィットを保存します。

6. 透過型電子顕微鏡(TEM)

1. クライオ TEM
   1. グリッドを選択します。代わりに、標準的なTEMグリッドまたはレイシーカーボンに穴のあいたカーボンサポートフィルムをお勧めします。いずれの場合も、カーボンの間の穴は純粋な水晶体氷およびサンプルの撮像領域を提供し、フィルムは提供しない。
   2. きれいなガラスのスライドの上にグロー放電装置のグリッドカーボン側を上に置きます。実験室のフィルムのスライドを包むことは格子の処理を助けることができる。ピンセットでグリッドの中心に触れないようにし、常にグリッドの端付近にピンチ。
   3. 30 sのグリッドを公開します。
   4. サンプル堆積用のガラス化ロボットを準備します。
      1. 湿度100%とRTに設定し、ブロッティングペーパーを追加します。ロボットのベースに液体エタンと液体窒素浴を準備します。vitrificationロボットの準備と使用に関する追加のヘルプについては、オンラインチュートリアルとビデオを参照してください。
   5. 希釈サンプル 5x.
   6. ガラス化ロボットに付属の負のアクションピンセットを使用して、グリッドをピックアップし、その後、ロボットにピンセットを取り付け、チャンバーにピンセットを移動します。
   7. ロボットの中で、機械側面の穴を通してピペットを使用して、サンプルの4 μLをグリッドのカーボン側に追加します。
   8. 4分間インキュベートします。
   9. ロボットを使用して、フィルターペーパーで3〜5sをブロットします。
   10. ガラス化ロボットは、グリッドを液体エタンに突入させます。
   11. ピンセットを取り外し、グリッドを液体窒素に移動し、液体窒素の下にある必要があります貯蔵容器に移動します。このプロセスは、サンプルを水晶体氷の薄い層に固定します。このステップの間にグリッドが液体エタンまたは液体窒素から費やす時間を最小にします。
   12. 液体窒素を使用して、クライオサンプルホルダーを冷却します。デュワーと貯水池をいっぱいに保ちます。
   13. 画像化の準備ができたら、クライオサンプルホルダーにグリッドをロードします。サンプルを液体窒素下に保管するか、液面のすぐ上の非常に冷たい窒素蒸気に短時間保管してください。
   14. 異なるサイズのミセルは、特定の氷の厚さを好むかもしれないので、薄くて厚い氷の75kxと150kxの間の120 kVでグリッドを画像化します。
       1. 氷を溶かし、サンプルを損傷しないようにビーム暴露を制限します。イメージを計画する場所に直接焦点を当てないでください。近くに焦点を当てます。画像をキャプチャする際にのみ、対象領域を公開します。
       2. 画像を見るときは、サンプルから液体エタン滴を区別してください(図5を参照)。
2. ネガティブ染色を用いた従来のTEM
   1. 汚れを準備します。
      1. 超純水を10mLほど沸騰させます。15 mL円錐管に0.1 gウラニルギネ(UFo)を計量します。
      2. UFoパウダーに5mLの温水を加えます。しっかりと閉じて、光を遮断するためにアルミニウム箔で包みます。1%の酢酸ウラニル染色も一般的に使用される。
      3. 渦または5分間激しく振る。チューブをボルテキサーに締めるのが助けになります。0.2 μm のシリンジフィルターを通して、きれいな円錐形のチューブにフィルターを適用します。
      4. 10分でRTに冷却し、直ちに5M NaOHとボルテックスを2分間加えます。
         1. あるいは、2%UFoの200 μLアリコットを凍結する。使用準備ができたら、アリコートを解凍し、5 M NaOHの1 μLを加え、2分間渦を加えます。
      5. 汚れをホイルで包むか、光から遠ざけてください。
   2. 1x PBS(または所望の緩衝液)でサンプル10xを希釈する。
   3. グリッドを選択します。銅格子のカーボンサポートフィルムを推奨します。グリッドの暗くて輝く側は、サンプルが堆積して染色されるカーボンコーティングされた側です。
   4. きれいなガラスのスライドの上にグロー放電装置のグリッドカーボン側を上に置きます。ステップ 6.1.2 を参照してください。
   5. 30 sのグリッドを公開します。
   6. カーボン側を上に向けてグリッドをピックアップし、グリッドの端で負のアクションピンセットを保持して、中央のイメージング領域を引き裂くのを防ぎます。グリッドを持つピンセットを下に置き、カーボンサイドを上に保持します。
   7. 4 μLのサンプルを、ピペットでグリッドの上部(カーボン側)に塗布します。
   8. インキュベート 4 分
   9. ~1分の残りで、ピペット10μLと20μLのUFo溶液をクリーンな実験室フィルムに滴下した。
   10. フィルター ペーパーを使用して、グリッドの端からサンプルを芯に入れ(垂直接触)して、イメージング サーフェスとの接触を避けます。
   11. ピンセット(まだグリッドを保持している)を使用して、すぐに10 μL UFo液滴の上にグリッドのサンプル側を置き、すぐに液体を吸い取ります(洗浄ステップ)。グリッドを乾燥させないことが重要ですので、ステップの間に停止しないでください。
   12. 同様の方法で、20 μL UFo 液滴をグリッドに適用します。UFoのグリッドを40s保持し、液体を拭き取り、グリッドを乾燥させます。
   13. 20,000xと100,000xの間の120 kVで乾燥した格子をイメージします。
   14. 放射性廃棄物に対する施設の安全サービスを使用して、すべてのUFo汚染物質を適切に処分してください。
   15. 必要に応じて、背景ノイズを低減するために、ImageJのTEM画像に明るさ/コントラストの強調とメジアンフィルタを適用することができます。後処理は、強度などの定量的測定に利用されていない画像に対してのみ、均一に行う必要があり、常に報告する必要があります。

結果

上述の特性評価方法を説明するために、オリゴヌクレオチドから組み立てられたPCMの代表的な結果を示し、様々な長さと化学のブロックコポリマーをブロックする(図1)。図 2は、PCM コア サイズ (SAXS および TEM、図 4、図 5から決定される) が、帯電ブロックの長さによってどのように変化したかを示しています。図3は、比較的長いブロックコポリマーと短鎖オリゴヌクレオチドから形成された球状PCMのDLSデータおよびフィッティング結果を示す。図 4は、存在する複数の空間相関 (外部サーフェス、コア内散乱、ヘリックス間順序付け) のモデルを組み合わせることによって、SAXS の複雑な強度スペクトルを正確に適合させる方法と、MALS を使用して散乱測定を長い長さに拡張する方法を示してい...

ディスカッション

上述のように、ここで提示されたプロトコルは、ポリアニオン成分としてオリゴヌクレオチドに焦点を当て、カチオン中性ブロック共重合体としてpLys-PEGに焦点を当てて書かれていますが、ポリ(アクリル酸)、ポリグルタミン酸、PEGポリ(ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)などの様々なポリマーでテストしており、一般的にポリ電解質ペアに適用可能であると考えています。最適化が必要なパラメータの 1 つは、アニールに使用される塩濃度です。これは、DLSによって実験的にチェックすることができ、または、脂肪電解質単独で相分離の観察と比較して(中性ブロックなし)することができる。熱焼鈍は塩焼鈍が望ましくない場合に使用することができるが、得られる多分散度は⁷より大きい。より大きなナノ粒子は小さなナノ粒子よりも多くの光を散乱させ、核酸は骨格に電子密度のリン原子が存在するため、他の多くのポリマーよりもX線を散乱する方が効率的であるため、特性評価に使用される濃度も最適化する必要があります。また、いずれかの高分子電解質が働き条件に近いpKaを有する場合、緩衝液のpHをより厳密に制御する必要がある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70 mm 円濾紙	Whatman	1001-070	グリッド準備中のウィッキング用濾紙
カーボン フィルム TEM グリッド	電子顕微鏡科学	CF200-Cu	TEM グリッド
DAWN	ワイアット テクノロジー	DAWN	MALS 機器
DNA オリゴヌクレオチド	統合 DNA ナノテクノロジーズ インク		カスタム オリゴヌクレオチド
レイシー カーボンTEM grid	Electron Microscopy Sciences	LC200-Cu	TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50	Alamanda Polymers Inc	mPEG5K-b-PLKC50	Example block copolymer
Milli-Q	Millipore Sigma		Ultrapure water
NanoDrop	Thermo Scientific		核酸濃度
ネガアクションピンセット	デュモン	N7	グリッド準備用ピンセット
パラフィルム「M」	ビーミス社	PM996	ラボフィルム
クワンティフォイル ホーリー カーボン TEM グリッド	電子顕微鏡 科学	Q210CR1.3	TEM グリッド
研究 ゴニオメーターとレーザー光散乱システム	ブルックヘブン・インスツルメンツ	BI-200SM	DLS/MALS 機器
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL	Thermo Scientific Pierce Protein Biology	87723	透析カートリッジ
小容量キュベット	ブルックヘブン・インスツルメンツ	BI-SVC	DLS/MALS用キュベット
Solarus 950 アドバンストプラズマシステム	Gatan	Solarus 950	TEMグリッド用プラズマシステム
Talos TEM	FEI		クライオサンプルに使用
Tecnaiスピリット TEM	FEI	スピリット	TEM 乾燥サンプルに使用される
ギ酸ウラニル	SPI-Chem	16984-59-1	TEM
Vitrobot	FEI	Vitrobot	クライオグリッド調製用ガラス化ロボット