このプロトコルは、巨大な単層脂質小胞と組み合わせて滑空キネシン運動性を使用して脂質ナノチューブネットワークを作製するためのプロセスを記載している。
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この記事について
サマリー
要約
脂質ナノチューブ(LNT)ネットワークは、真核細胞に見られるユビキタス脂質細管に関連する分子輸送および脂質生物物理学を研究するためのin vitroモデルシステムを表す。しかし、in vivo LNTは高度に非平衡な構造であり、化学エネルギーと分子モーターを組み立て、維持、再編成する必要があります。さらに、インビボLNTsの組成物は、複合体であり、複数の異なる脂質種からなる。LNTを押し出す典型的な方法は、時間と労力の両方を要し、巨大な脂質小胞からナノチューブを強制的に引き抜くために光学ピンセット、マイクロビーズ、およびマイクロピペットを必要とする。ここに提示されるのは、キネシン駆動微小管運動性を使用して巨大な単層小胞(GUV)から大規模なLNTネットワークが迅速に生成される滑空運動性アッセイ(GMA)のプロトコルです。この方法を使用して、LNTネットワークは、生物学的LNTの複雑さを模倣する幅広い脂質製剤から形成され、脂質生物物理学および膜関連輸送のin vitro研究にますます有用になる。さらに、この方法は、一般的に使用される実験装置を使用して、短時間(<30分)でLNTネットワークを確実に製造することができる。長さ、幅、脂質分配などのLNTネットワーク特性も、ネットワークの構築に使用されるGUVの脂質組成を変更することによって調整可能です。
概要
脂質ナノチューブ(LNT)ネットワークの作製は、非平衡脂質構造のインビトロ検査のための関心が高まっている1、2、3。細胞は、タンパク質4および核酸5の拡散輸送ならびに細胞間通信6,7のために脂質細管を使用する。小胞体およびゴルジ体装置は、これらの膜結合小器官が脂質およびタンパク質合成ならびに細胞の細胞質内のこれらの不可欠な生体分子の輸送のための主要な場所であるため、特に興味深い8,9。これらの細胞小器官の膜は、スフィンゴ脂質、コレステロール、およびリン脂質10を含む複数の脂質種で構成されており、最終的にそれらの機能を定義するのに役立つ。したがって、これらの細胞小器官をより密接に複製および研究するためには、インビトロLNTは、ますます複雑な脂質製剤11を有する小胞から作製されなければならない。
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プロトコル
1. ストック微小管溶液の調製
警告: 安全ゴーグル、手袋、および白衣は、プロトコル全体を通して常に着用する必要があります。
- 5x BRB80バッファーを調製する:1Lのガラス瓶に、24.19gのパイプ(ピペラジン-N,N'-ビス[2-エタンスルホン酸])と0.38gのEGTA(エチレングリコール-ビス[β-アミノエチルエーテル]-N,N,N',N'-四酢酸)を加える。1 mL の 1 M MgCl2 を加え、KOH で pH を 6.9 に調整します。脱イオン水を加えて、溶液を500mLの最終容量にする。
- 100 mM ストックの GTP 溶液を調製する: 52 mg の GTP を秤量し、1 mL の蒸留水に懸濁する。100 mM 溶液を 20 μL アリコートに分割し、-20 °C で保存します。
- GPEM溶液を調製する:200μLの5x BRB80、10μLの100mM GTP溶液、100μLの100%グリセロール、および600μLの脱イオン水を混合する。GPEM溶液を100μLアリコートに分割し、-20°Cで保存する。
- 市販の凍結乾燥チューブリン(ビオチン化、蛍光標識、および非標識の各バイアル1本)のバイアルを低温(4°C)GPEM溶液中で再構成して微小管溶液を調製し、原液濃度5mg/mLにする。
- 4 μLのビオチン化チューブリン、4 μLの蛍光....
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結果
LNTネットワーク(図4)は、微小管のキネシン輸送によって実行される作業を使用して、GUVからLNTを押し出すために記載されたプロトコルを使用して製造されました。簡単に説明すると、GUVsは、スクロース溶液を用いたアガロースゲル再水和を用いて調製され、微小管は、GPEM溶液中で重合され、BRB80T中で安定化された。次に、キネシンモータをフローセルに導入し、カバースリップの表面にモータの活性層を形成した。次いで、微小管を導入し、ストレプトアビジン溶液を添加し、ビオチン化脂質とGUVとの間の結合を促進した(その後導入された)。
フローセルにすべての成分が存在する状態で、LNTを30分間形成させ、その時点でAMP-PNPを導入して運動性を停止した。次に、LNTsを、100倍のオイル対物レンズを用いて落射蛍光顕微鏡下で画像化した。LNT は非常に大きくなる可能性があります。したがって、より低い出力の目標を使用して、より大きなLNTを捕獲することもできます。LNTネットワークは、GUVから伸びて接続する薄いウェブ状の突起によって特.......
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ディスカッション
LNTネットワークは、膜特性および膜貫通タンパク質などの生体分子の輸送に対するin vitro研究のための有用なツールである。さらに、複合脂質製剤を使用してLNTネットワークを製造することで、より生物学的に関連する研究が可能になります。他の作製研究は、1)単純な脂質製剤および多層状小胞、または2)複雑な脂質製剤からなるGUVからネットワークを作製するために、より厄介な運動性技術のいずれかを使用している。ここで説明する方法は、安価な試薬および装置を使用して、複雑な脂質製剤およびGUVからの大規模なLNTネットワークの効率的な製造を可能にする。このように、この方法論は、相分離および膜タンパク質輸送を含むさまざまな生物学的プロセスを研究する能力を提供する。このプロトコルは、LNTの組成がそれらの生物学的類似体(例えば、ゴルジ体)に近似するように最適に調整され得るインビトロモデルを使用する。
ここで説明する方法におけるLNTネットワークの形成には多くの利点があります。例えば、微小管は凍結乾燥チューブリンを用いて容易かつ迅速に重合され、パクリタキセル16<.......
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開示事項
サンディア国立研究所は、米国DOEの国家核セキュリティ局(DE-NA-0003525)の契約に基づき、ハネウェル・インターナショナルの完全子会社であるサンディアLLCのナショナル・テクノロジー&エンジニアリング・ソリューションズが管理・運営するマルチミッション研究所です。このホワイトペーパーでは、客観的な技術的結果と分析について説明します。この論文で表明される可能性のある主観的な見解や意見は、必ずしも米国エネルギー省または米国政府の見解を表すものではありません。
謝辞
この研究は、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局、材料科学工学部(BES-MSE)の支援を受けた。キネシン合成と蛍光顕微鏡は、米国エネルギー省(DOE)科学局のために運営されている科学局のユーザー施設である統合ナノテクノロジーセンターのユーザープロジェクト(ZIM)を通じて実施されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100x/1.4 開口数 油浸対物レンズ | オリンパス | 1-U2B836 | オリンパス UPlanSApo 100x/1.40 オイル対物レンズ 無限遠補正、RMS スレッド 作動距離 0.12mm |
| 3.0 ND フィルター | オリンパス | 減光フィルター | |
| AMP-PNP | シグマ-アルドリッチ | A2647 | (β,γ;-イミドアデノシン 5&プライム;-三リン酸) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | アデノシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物 BioXtra |
| Brightline ピンケル DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 フィルターセット | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000< | br/> BrightLine ピンケル フィルター セット、DAPI、FITC、TRITC、Cy5 &Cy7および他のLEDベースの光源で照らされる蛍光色素 |
| カゼイン | Sigma-Aldrich | 22090 | 微生物学のためのカゼイン加水分解物 |
| カタラーゼ | Sigma-Aldrich | C9322 | ウシ肝臓からのカタラーゼ |
| クロロホルム | Sigma-Aldrich | 288306 | 無水クロロホルムは、安定剤として0.5-1.0%のエタノールを含んでいます |
| コレステロール | Avanti | 700000P | コレステロール(ヒツジウール、>98%) (粉末) |
| D-グルコース | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-グルコース粉末、BioReagent、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(クロロホルム中) |
| DOPE-ビオチン | Avanti | 870282C | 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)(ナトリウム塩) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(粉末) |
| DPPE-ビオチン | アバンティ | 870285P | 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)(ナトリウム塩) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA、エグタジン酸、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸 |
| コースオキシダーゼ | Sigma-Aldrich | G6125 | アスペルギルス・ニジェール由来のグルコースオキシダーゼ II型、≥10,000単位/g固体(無酸素) |
| グリセロール | フィ | ッシャーG33 | グリセロール(ACS認証)、フィッシャーケミカル |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | グアノシン 5&プライム;-三リン酸ナトリウム塩水和物 |
| IX-81 オリンパス顕微鏡 | オリン | N/A | IX81 倒立顕微鏡 オリンパス |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | カリウム水酸化 |
| マグネシウム塩化物 | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M 塩化マグネシウム溶液 |
| オルカフラッシュ 4.0 デジタルカメラ | 浜松 | C13440-20CU | オルカフラッシュ 4.0 V3 デジタル CMOS カメラ |
| オレゴングリーン-DHPE | Invitrogen | O12650 | オレゴングリーン 488 1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン |
| パクリタキセル | サーモフィッシャー | P3456 | パクリタキセル(タキソール当量) - 研究のみに使用 |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-ピペラジンジエタネスルホン酸、ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)、ピペラジン-N,N′-ビス(2-エタンスルホン酸) |
| テキサスレッド-DHPE | Invitrogen | T1395MP | テキサスレッド 1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、 トリエチルアンモニウム塩 |
| トロロックス | シグマ・アルドリッチ | 238813 | (±)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸 |
| チューブリン、ビオチン | 細胞骨格 | T333P | チューブリンタンパク質(ビオチン)、ブタ脳 |
| チューブリン、Hy-Lite 488 | 骨格 | TL488M | チューブリンタンパク質(蛍光HiLyte 488)、ブタ脳 |
| チューブリン、非標識 | 細胞骨格 | T240 | リンタンパク質ブタ脳 |
参考文献
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D.
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再版と許可
