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方法論記事

細菌群のタイムラプスイメージングと集団ストレス応答

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DOI:

10.3791/60915

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2020年5月23日

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1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

この記事について

サマリー

我々は、平板文書スキャナを用いて、バクテリオファージ(ファージ)および抗生物質ストレスに反応する緑膿菌群の高解像度タイムラプスムービーを生成する簡単な方法を詳述する。この手順は、群れの動態を監視するための迅速かつ簡単な方法であり、他の細菌種の運動性および成長を研究するために適応され得る。

要約

群れは、緑膿菌や大腸菌を含む多くの細菌種で観察される表面運動性の一形態である。ここでは、細菌の密集した集団は、数時間にわたって特徴的な傾向性の形をしたコミュニティで大きな距離を移動します。群れは、中程度の水分、湿度、栄養素の含有量を含むいくつかの要因に敏感です。さらに、抗生物質やバクテリオファージ(ファージ)によってストレスを受けるP.緑内症で観察される集団ストレス応答は、ストレスを含む領域に近づくから群れを撃退する。ここで説明する方法は、群れの影響を及ぼす重要な要因を制御する方法を説明します。フラットベッド文書スキャナを用いて、群れの動態や高い時間分解能での集合的ストレス応答を監視する簡単な手法を紹介し、群れの定量分析を行う方法を説明する。このシンプルで費用対効果の高い方法は、群れの正確かつ適切に制御された定量を提供し、他のタイプのプレートベースの成長アッセイおよび細菌種に拡張することができます。

概要

群れは、抗生物質耐性を増加させ,、宿主1、2、32における病原性因子の産生を増加させる協調1細菌運動性の集合的形態である。3この多細胞挙動は、肺,4,5の上皮膜を覆う粘膜層に似た半固体表面で起こる。4バイオサーファクタントは、表面の表面張力を克服するために群れの集団によって一般的に生産され、これらの産生は、クォーラム,センシング6、7、87としても知られている複雑な6細胞シグナル伝達システムによって調節される。8緑膿菌、黄色ブドウ球,菌、大腸菌9、10、11、12,10など、多くの種の細菌が群がることができる。11,12細菌によって作成される群れのパターンは多様であり、栄養成分、気孔率、および水分13、14を含む表層の物理的および化学的特性の影響を14受ける。表面特性に加えて、成長温度と周囲湿度は、群れの速度とパターン12、13、14、15,13,14を含む群れのダイナミクスのいくつかの側面に影響を与えます。群れに影響を与える成長変数は、実験再現性と結果を解釈する能力に影響を与える課題を作成します。ここでは、タイムラプスイメージングを通じて細菌群の動態をモニタリングする簡単な標準化方法について述べていきます。この方法では、群れの進行に大きな影響を与える重大な成長条件を制御する方法について説明します。従来の群れの分析方法と比較して、このタイムラプスイメージング法により、長期間にわたって高解像度で複数の群れの運動性を同時に追跡することができます。これらの側面は、群れを監視することで得られるデータの深さを改善し、群れに影響を与える要因の識別を容易にします。

P.緑素吸塩の群れは、周囲の領域6,6、16にラムノリプト脂質および3-(3-ヒドロキシアルカノキシ)アルカノ酸の生産および放出を通じて促進される。抗生物質の亜致死濃度またはファージウイルスによる感染からのストレスの導入は、群れの組織に影響を与える。特に、これらのストレスは、P.エルギノーサがクォーラムセンシング分子2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロンを放出することを誘導し、シュードモナスキノロンシグナル(PQS)17,18とも呼ばれる。17,18群れの2つの集団を含む群れのアッセイでは、ストレス誘発集団によって産生されるPQSは、ストレスを含む領域に入って未処理の群れを撃退する(図1)。この集団ストレス応答は、近くの脅威18、19についてP.緑内鼻波に警告する危険な通信信号システムを19構成する。P.緑素吸い、集団ストレス応答の活性化、および群れの反発に対するストレスの影響は、ここで説明するタイムラプスイメージング法を用いて可視化することができる。ここで説明するプロトコルは、(1)群れのための寒天プレートを準備する方法、(2)2種類のアッセイ(伝統的な群れのアッセイまたは集団ストレス応答アッセイ)のための培養P.エルギノーサ(図1)、(図1)タイムラプス画像の取得、および(4)ImageJを使用して画像をコンパイルして分析する方法を説明しています。

簡単に言えば、一晩培養したP.緑頭症は群がる寒天プレートの真ん中に見られ、ファージに感染したり抗生物質で治療したP.緑素吸い目は衛星位置で発見される。P.緑素吸い込みの進行は、湿度調節された37°Cインキュベーターに置かれた消費者文書フラットベッドスキャナーで監視されます。スキャナーは、群れの成長期間(通常は16〜20時間)にわたって定期的にプレートを自動的にスキャンするソフトウェアによって制御されます。この方法は6つの10 cmの群れの版の同時タイムラプスビデオを得る。画像は映画にコンパイルされ、ストレス誘発集団による群れの反発は、自由に利用できるImageJソフトウェアを使用して定量化される。異なる群れの実験間の一貫性と再現性を確保するために、特別な配慮がなされている。

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プロトコル

1. 緑素吸い込みタイムラプスイメージングのための群れの寒天プレートの準備

  1. Na2HPO 4 •7H 2 Oの64 g、KH22PO4の215g、および500 mL二重蒸留水(ddH2O)にNaClの2.5 gを加えることによって、ガラス瓶に5x M8最小培地1 Lを調製します。最終容積を1 Lに調整し、ddH2O. オートクレーブを追加して、液体培地を室温で殺菌および保存します。
  2. MgSO4の24.6 gを加えてガラス瓶に1M MgSO4(硫酸マグネシウム)100mL(硫酸2マグネシウム)を準備し、50 mL ddH2Oで最終体積を100 mLに調整し、さらにddH2.O.オートクレーブを加えて殺菌します。室温で保管してください。
  3. ガラス瓶に20gのカサミノ酸を20g加えて、20gのカサミノ酸を50 mL ddH2Oに加えて100mLの100mLを調製し、さらにddH2O.オートクレーブで最終量を100 mLに調整して殺菌します。室温で保管してください。
  4. 50 mL ddH 2 Oに20gのグルコースを加えてガラス瓶に100mLのグルコース2を調製し、0.22 μmフィルターで濾過して最終体積2を100 mLに調整します。室温で保管してください。
  5. 10個の群がる寒天プレートを作るためには、100 mLのddH2Oに寒天1gを加え、250 mLのエルレンマイヤーフラスコにddH2Oを加えて最終体積を160 mLに調整します。オートクレーブ処理による殺菌。
    1. オートクレーブ処理の直後に、寒天溶液を55°Cの水浴に15分間入れます。
    2. 水浴から寒天溶液を取り出し、5倍M8最小培地の40mL、1 M MgSO4の200 μL、20%グルコースの2mL、および20%カザミノ酸15の5 mLを加える。混合後すぐにステップ1.6に進みます。
      注:最終濃度は、寒天、1 mM MgSO 4、0.2%グルコース、および0.5%カザミノ酸です。4
  6. 一貫した容積のために25 mLピペットを使用して、直径10cmのペトリ皿ごとに20mLの群れの寒天溶液を加える。
    注:寒天溶液の固定されたボリュームは、ボリュームが寒天の乾燥時間と水分含有量に影響を与えるため、重要です。群れの寒天プレートを作るときは泡を避けてください。
  7. 寒天は、室温でベンチに1時間蓋をした単一のスタックに群がる寒天プレートを置くことによって固まるのを可能にします。除湿機をオンにして、次のステップの前に部屋の相対湿度を40〜50%1時間に下げます。
  8. 群れの寒天プレートを300フィート3分のラミナーフローフードで蓋をオフにして、室温で40〜50%の相対湿度で乾燥させます。蓋の内部を、層流フードに上に置いて乾燥させます。4 °Cで群れの寒天プレートを24時間まで保管してください。
  9. 黒の10cmのペトリ皿の蓋をサンドペーパーで蓋の内側を滑らかにしてイメージング用に準備します。包装箱の中に蓋を入れ、包装箱を化学フードの下に置きます。黒いスプレー塗料を使用して蓋の内側にスプレーします。蓋を乾かします。
    注: 追加の実験には黒いふたを再利用できます。スキャン中に光を反射しないように、蓋を塗ることが重要です。

2.緑素吸いの成長とめっき条件

  1. 400 mL ddH2O に 10 gの LB-ミラーパウダーミックスを加えて、リゾジェニーブロス (LB) を 400 mL 準備します。2%LB-寒天ペトリ料理の場合は、さらに8gの寒天を加えます。殺菌するオートクレーブ。
  2. 直径10cmのペトリ皿に20mLの溶融LB寒天培地を注ぎ、室温で一晩固めます。液体培地は室温で保存し、寒天プレートは4°Cで保管してください。
  3. 無菌ループまたは木製の棒を使用して-80°Cに保存された冷凍ストックからLB寒天ペトリ皿のストリークP.緑化吸い。ペトリ皿を一晩37°Cで逆さまにインキュベートします。LB-寒天プレートを4°Cで1週間保存します。
  4. 滅菌ループまたは木製スティックでペトリ皿から単一のコロニーを選び、それを2 mL LB培地に接種し、100rpmに設定されたローラードラムで37°Cで一晩(16〜18時間)飽和する培養物をインキュベートします。
  5. P20ピペットを使用してステップ2.4から一晩培養の一晩培養のパイプ5 μLを、スポッティングエリアの上方(10~45°C)2.5cmの角度(10~45°)でピペットチップに近づき、最初の停止までピペットダウンし、液体滴だけで寒天に触れることで、群がる寒天板の中心にスポットを当てる(図1B)。
    1. 寒天にダメージを与えるため、ピペットチップで寒天に触れないようにしてください。異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置するためにテンプレートを使用します (補助図 S1)。
    2. 従来の群れのアッセイの場合は、センタースポットのみを使用し、ステップ2.8にスキップします。集団ストレス応答アッセイについては、ステップ2.6(ファージ感染の場合)またはステップ2.7(抗生物質ストレス)を継続する。
  6. ファージ感染の場合、ステップ2.4から1 x 1012 pfu/mLファージDMS3vir 20の6μLでP.4の一晩培養の30μLを混合する。すぐに次の手順に進みます。
    1. Pのピペット6 μL。 ステップ2.6の緑素吸着混合物は、P20ピペットを使用し、ペトリ皿を中心とする半径2.8cmの半径同心円上の6等距離衛星位置でスポットを当て、スポッティング領域の上に2.5cm(10〜45°)のピペット先端に近づき、最初のストップ(液体1)にピペッティングダウンして、液体1(液体)で唯一の図(液体)でピペッティングを行い、液体1(液体)で唯一の図(液体)でピペットを触れる。
    2. 寒天にダメージを与えるため、ピペットチップで寒天に触れないようにしてください。一貫性を保つにはめっきテンプレートを使用します (補足図 S1)。ステップ 2.8 に進みます。
  7. 抗生物質治療の場合、ステップ2.4の30μLの一晩培養P.エルギノーサを6μLの3mg/mLゲンタマイシン、100mg/mLカナマイシンの10μL、または100mg/mLフォスフォマイシンの7.5 μLと混合する。すぐに次の手順に進みます。
    1. P20ピペットを使用してステップ2.7からP.aeruginosaを処理し、2.8cm半径半径2.8cmの同心円で、スポッティング領域の上方に2.5cmの角度(10〜45°)でピペット先端に近づき、最初の停止にピッティングダウンし、液体で1番目の液体(滴下)でピペットチップに触れる。
    2. 寒天にダメージを与えるため、ピペットチップで寒天に触れないようにしてください。一貫性を保つにはめっきテンプレートを使用します (補足図 S1)。ステップ 2.8 に進みます。
  8. 手順 1.9 で作られた黒いふたでクリアペトリ皿のふたを交換してください (図 2A)。
  9. 群れの寒天プレートを、湿度を75%に保つために、10 L水浴で37°Cに設定されたインキュベーターのスキャナーに群がる寒天プレートを置き、湿度を75%に維持します(図1E、図2B)。
    注意:群がる寒天プレート上の斑点のある細胞を邪魔しないでください。プレートを常に上に向けておきます。

3. スキャナによる画像取得

  1. フラットベッドドキュメントスキャナの40~60cm上のラックに黒いマット生地を取り付けることで、ペトリ皿の周囲光を低減します。ジップタイを使用して固定します(図2B)。
  2. スキャナは、スキャンソフトウェアと自動スクリプトソフトウェアを使用して制御されます。
    1. スキャン ソフトウェアで、[ホーム モード] を選択します (図 3A)。[イメージの種類] の下の[色] を選択して、カラーで画像をキャプチャします。画質を設定するには、[出力先]の[その他]を選択し、[解像度]を300 dpiに調整します。[ターゲット サイズ] で [元のサイズ] を選択して、画像の標準サイズを保持します。標準画質の場合は、[イメージ調整] のすべてのオプションをオフのままにします。
      注: 既定では、[ターゲット サイズ] は [元のサイズ] に設定されています。[ターゲット サイズ]の他のオプションを選択するには、最初に[プレビュー ] をクリックします。
  3. [スキャン] の右側にあるフォルダ アイコンをクリックして[ファイルの保存設定]を開き、イメージの保存パスを設定します(図 3A)。
    1. [場所] の [その他] を選択して、イメージを保存するフォルダの保存先を選択し、[参照] をクリックします。画像を保存するフォルダを選択します。
    2. [接頭辞]テキスト ボックスに画像に名前を付けます。イメージの命名シーケンスを開始するには、開始番号001 を設定します。[イメージ形式] の [種類] で [JPEG (*.jpg)] を選択し、[詳細] で[オプション] をクリックして調整して、ファイル形式を JPEG に設定します。圧縮レベルを 16 に調整し、標準にエンコードしてイメージ形式の品質を設定し、[ICC プロファイルを埋め込む] をオンにします。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じます (図 3B)。
    3. 最初のオプションをオフにし(「同じ名前のファイルを上書きする」)、次の3つのオプション(「次のスキャンの前にこのダイアログボックスを表示する」、「スキャン後に画像フォルダを開く」、「スキャン後にページの追加ダイアログを表示する」)をチェックします。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じます。
    4. [プレビュー] をクリックして、画質を確認します。プレビューウィンドウが表示され、スキャンアイコンが機能します (図 3C)。
  4. スクリプト ソフトウェアを使用して、イメージの取得を自動化します。提供されたスクリプトは、[スキャン]ウィンドウで[スキャン]をクリックし、[ファイルの保存設定]ウィンドウで30分間隔で[OK]をクリックします。
    1. タスクをクリックしてスクリプトをインポートする | Single_scan.tskとIdle_scanning.tsk (補足ファイル 1 および 2として提供される TSK ファイル) の両方をインポートして選択します。図 3Dを参照してください。
      注: Single_scan.tskは、[スキャン] ウィンドウの [スキャン] ボタンをクリックし、[ファイルの保存設定] ウィンドウで[OK] をクリックします。Idle_scanning.tskは30分ごとにSingle_scan.tskをアクティブにします。Idle_scanningtskの起動を変更してスキャンの頻度を変更できます。
    2. アイドルスキャン (インポート)とシングルスキャン (インポート) の両方を選択し、アイドルスキャン (インポート)を右クリックして、左クリックして有効(図 3D、補助図 S2)をクリックして、30 分間隔で自動スキャンを有効にします。
      注 : 自動スキャンは、ユーザーが手動でスクリプトを停止するまで実行されます。スクリプトを停止するには、[アイドル スキャン (インポート)]を選択し、[アイドル スキャン (インポート)]を右クリックして、[有効] をクリックします。チェック マークが削除されます。

4. タイムラプス画像のコンパイルと群れの反発の測定

  1. ImageJを使用してムービー編集や画像解析を行います。
  2. [ファイル] をクリックして、スキャンしたすべてのイメージを ImageJ にインポートする |インポート |画像シーケンスと画像を選択します。[シーケンス オプション]ウィンドウで、[RGB に変換] をオンにして、画像を色で保持します。画像数は、選択した画像の数を示します。
  3. 開始イメージを 1 にして、フォルダー内の最初の画像から開始し、イメージを 100% に拡大縮小して、元の画像のサイズを節約します。[仮想スタックを使用]をオフのままにします。[OK] をクリックして、イメージが読み込まれるのを待ちます (図 4A)。
  4. [編集] をクリックしてビデオ圧縮レベルを 100 に設定する |オプション |入力/出力.をクリックし、JPEG 画質を 100 に調整します。
  5. ファイルをクリックして .avi としてファイルを保存する |名前を付けて保存 |AVI.圧縮を JPEG に、フレーム レートを 5 fps に調整します (図 4B)。目的のフォルダーに .avi タイムラプスを保存します。
  6. 群れの反発距離を定量化するには、ImageJ で群れの期間の終わり近くに画像を開きます。[ファイル] をクリックします。 |画像を開いて選択します。[分析] をクリックしてスケールを調整する |[縮尺]と設定の [距離 (ピクセル単位)]を 118 に設定し、既知の距離を 1 に、ピクセル縦横比を 1.0 に設定し、長さの単位を cm に設定します (図 4C)。グローバルをオフのままにします。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じます。
  7. ストレートアイコンをクリックし、衛星位置のコロニーの中心から群れの人口の端まで測定します。分析を選択 |計測して、新しいウィンドウを計測して、計測値 (長さ) (図 4D) と共に表示します。
    注: 「+」を使用してズームインを近づけ、ズームアウトするには「-」を使用します。

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結果

P.緑素吸い声を上げ、細胞にストレスを与え、群がる寒天プレートを画像化するステップを図1に示す。37°CでLB-寒天プレートから2mLのLB-寒天プレートから野生型P.緑素吸着UCBPP-PA14株の単一コロニーを一晩37°Cで接種し、群がる寒天板の中央に5μLを発見した。このプレートのタイムラプスイメージングは、中心にコロニーの形で初期成長を明らかにし、その後、コロニーから放射状に腱を広げる(ビデオ1)。集合的ストレス応答アッセイでは、中心にP.エルギノーサを発見することに加えて、同じ一晩培養物の30μLが6 μLの1 x 1012 pfu/mL DMS3virまたは6 μLの3 mg/mLゲンタマイシンの比率で5:1および6μLの比で混合されます。群れは群がる寒天プレートの中心から周辺に移動し、ファージ(ビデオ2、左上プレート)に感染した細菌によって発されるストレスシグナルによって撃退されるか、またはゲンタマイシン(ビデオ2、

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ディスカッション

このプロトコルは、群れの寒天プレートの変動を最小限に抑え、P.緑素吸砂のタイムラプス画像を取得し、ストレスに応答するための簡単で低コストの方法を提供することに焦点を当てています。この手順は、培地組成および増殖条件を適応させることによって、他の細菌系を画像化するように拡張することができる。P.緑素吸塩の場合、M9またはFABの最小培地は群生16、21を誘導するために使用することができるが、21ここで提示されるプロトコルは、カザミノ酸、グルコース、および硫酸マグネシウム6とM8培地を使用する。P. 緑素吸う群,れは、鉄の入手可能性やアミノ酸22、23、24,23を含む栄養源などの中質組成物に敏感である。24したがって、群れの寒天プレートのた...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

J.-L.B.、A.S.、およびN.M.H-K.原稿を書き、改訂した。すべての著者は実験を設計しました。J.-L.B.は実験と分析を行った。この作品は、NIH賞K22AI112816とR21AI139968助成金によって支えられ、A.S.とカリフォルニア大学によって支えられました。N.M.H-K.ルンドベック・フェローシップR220-2016-860およびR251-2017-1070によって支えられた。資金提供者は、出版のために作品を提出する決定に何の役割も持っていませんでした。私たちは宣言する競合する利益を持っていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
Bacto寒天、脱水BD Difco214010LB寒天プレートおよびスウォーミング寒天プレート用
カサミノ酸BD Difco223050スウォーミングメディア用
D-グルコースッシャーケミカルD16500デキストロース。スウォーミング培地用
ホスホマイシン二ナトリウム塩東京化学工業F0889原液濃度:200 mg/mLddH2O
ゲンタマイシン硫酸塩Sigma-AldrichG1914に溶解 ストック濃度:3 mg/mL。ddH2O
Kanamycin sulfateSigma-Aldrich60615に溶解 ストック濃度:100 mg/mL。ddH2O に溶解
LB-MillerBD Difco244620LBブロスおよびLB寒天プレート用
硫酸マグネシウム七水和物Sigma-Aldrich230391スウォーミングメディア用
リン酸カリウム 一塩基性Sigma-AldrichP06625x M8 メディア用
塩化ナトリウムSigma-AldrichS98885x M8 メディア用
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物ッシャーケミカルS3735x M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labAFS27E.118PA14 strain
DMS3virO'Toole labDMS3vir20Bacteriophage
Supplies
酸化アルミニウムサンドペーパー3M150罰金黒い蓋用ブラック
ファブリックJoannPRD7089ブラックファブリック
スプレーペイントKrylon5592マットブラックブラック蓋用
ErlenmeyerフラスコKimax26500250mL
収納ボトルパイレックス13951L250 mL、500 mL、1,000 mL
8インチジップタイナーE173770黒のつや消し生地
ペトリ皿(100 mm x 15 mm)を取り付けるFB0875712100 mm x 15 mmポリスチレンプレート
木の棒フィッシャー23-400-102ストリーキングおよび接種用
細菌<ストロング>機器
オートクレーブ市場 フォージインダストリーSTM-E滅菌試薬用
25mLピペットUSA Scientific, Inc.1072-5410天プレートの群れのために20 mLをピペットで動かすには
除湿機FrigidaireFAD704DWD 70-pint部屋の相対湿度を約45%に維持するため
ImageJNIHv1.52a画像分析用ソフトウェア
インキュベーターVWR89032-09237°Cでの細菌の増殖用;C
Isotemp ウォーターバスフィッシャー15-462-21Q媒体用 55 >C
層流フードベイカー社SG603A乾燥プレート
用 P-20ピペットギルソンF123601スポッティング スウォーミング寒天プレート
ピペットコントローラーBrandTechaccu-jetウォーミング寒天プレート用
ローラードラムニューブランズウィックTC-7100rpmでの細菌の増殖用
スキャナーエプソンエプソンパーフェクションV370イメージングプレート用フォトスキャナー
スキャナー自動化ソフトウェアRoboTask Litev7.0.1.93230分間の内部イメージング
スキャナー画像取得ソフトウェアエプソンv9.9.2.5USイメージングプレート用ソフトウェア
フィフィブラックガラスガードベンダー のためフィッシャー ズ 寒 冷却 ス

参考文献

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