ラットの運動皮質におけるレーザー誘発脳損傷

世界的に、脳卒中は第2の主要な死因であり、障害の第3位の原因^である。脳卒中はまた、重度の障害につながり、多くの場合、医療スタッフや親戚からの余分なケアを必要とします。したがって、障害に関連する合併症を理解し、より肯定的な結果の可能性を改善する必要があります。

動物モデルの使用は、病気を理解するための最初のステップです。最良の研究成果を得るために、一般的なモデルには、単純な手法、手頃な価格、高い再現性、および最小限の変動性が含まれます。虚血性脳卒中モデルにおける決定因子としては、脳浮腫容積、梗塞サイズ、血液脳関門(BBB)の破壊の程度、および神経学的重症度スコア²を介して一般的に評価される機能障害が含まれる。

げっ歯類モデルで最も広く使用されている脳卒中誘導技術は、中大脳動脈(MCA)を一過性または永久的に^{閉塞させる3}.この技術は、ヒトのものと同様のストロークモデルを生成する:それは、ストローク領域を囲む陰茎を有し、高度に再現性があり、虚血持続時間および再灌流⁴を調節する。それにもかかわらず、MCAO法には若干の合併症がある。この技術は、多くの場合、追加の結果につながる視覚皮質および一般的な温熱の機能不全を伴う頭蓋内出血およびipsi側性の腎不全への傷害を起こしやすい^{55、6、7。6,7}他の制限には、誘発された脳卒中の高い変動(虚血の可能性のある拡張から、外部頸動脈領域のような意図しない領域に起因する)、MCAの閉塞が不十分、および早期再灌流が含まれる。また、異なる株や大きさのラットは、様々な梗塞容^積8を示す。前述のすべての欠点に加えて、MCAOモデルは、カテーテル法のための最小血管サイズの要件の点で技術的に限られているため、深部脳領域で小さな単離されたストロークを誘導することはできません。これにより、代替モデルの必要性がますます重要になります。別の方法、フォトトロンボシスは、MCAO手順に代わる可能性があるが、効率⁹を改善しない。このテクニックは、光でストロークをターゲットにし、以前のモデルでいくつかの改善を提供します。しかし、光血栓症は、二次的な併発に関連する侵襲的な頭蓋切り出しを必要とする^。

ここで示す欠点の観点から、ここで提示されるプロトコルはげっ歯類の脳損傷を誘発するための可能な代替レーザー技術を提供する。レーザー技術の作用機序は、生体組織に与えるレーザーの光熱効果に基づいており、身体組織による光ビームの吸収と熱への変換につながります。レーザー技術を使用する利点は、その安全性と操作の容易さです。レーザーが出血を止めるために熱を生成する能力は医学において非常に重要であり、与えられた満点で異なるビームを増幅する能力は、レーザーが目標点¹⁰の邪魔になる健康な組織を破壊することを避けることを保証する。このプロトコルで使用されるレーザービームは、そのエネルギーを放出したり、破壊を引き起こすことなく、骨などの低液体媒体を通過することができます。脳組織などの高い液体培地に到達すると、エネルギーを使って標的組織を破壊します。したがって、この技術は、脳の適切な領域でのみ脳損傷を誘発することができる。

ここで提示された技術は、照射のレベルを調節する能力の膨大な量を示し、最初から意図された脳損傷の選択されたバリエーションを生み出した。皮質と線条体の両方に影響を与える元のMCAOとは異なり、レーザー技術は脳損傷の影響を調節することができ、意図した運動皮質にのみ傷害を誘発した。本明細書において、レーザー誘発性脳損傷プロトコルおよびラットの大脳皮質に対して行われる処置の代表的な結果の概要が提供される。

以下の手順は、欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われました。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました.

1. 動物の選択と準備

1. この処置のための異常な病理学なしで300から350 gの重量を量る65の雄のスプレイグ・ドーリーのラットを選ぶ。サイズが小さいほど、MCAO の手順に技術的な問題が生じる。
2. ケージごとに3匹のラットを割り当て、少なくとも3日間適応させてください。

2. MCAO手続き

1. MCAO の 25 匹のラットを選択し、手順 11 に関連する死亡率を¹⁰~ 20% に設定します。
2. 前述の詳細¹²で説明したように、標準の手法を使用して MCAO を実行します。

3. レーザー誘発脳損傷実験手順

1. レーザー群としてマークされたグループに20匹のラットを割り当て、別の対照群に20匹のラットを割り当てる(シャム操作)。
2. レーザー群ラットを、次のようにして50J X10 ポイントでレーザー照射を行う。
   1. 自発的な換気を可能にする酸素中の2%イオブルランの混合物とラットを麻酔する。引き出し反射の欠如を確認するために鉗子で尾をつまんで十分な麻酔深さを確認してください。
   2. 直腸温度調節加熱パッドを用いた実験手順を通して、ラットのコア体温を37°Cに維持する。
   3. 70%のアルコールと0.5%のクロルヘキシジングルコン酸塩で、剃毛で地元の毛髪を除去し、消毒します。消毒ステップをさらに2回繰り返します。
      注意:外科的切開の大きさは約3cmであるべきである。切開部の周りに少なくとも2cmの毛を取り除きます。
   4. 立体性ヘッドホルダーにラットを置き、頭皮を横に反射し、ブレグマとラムダの間の領域を露出させるために3cmの切開を行います。
   5. 鼻コーンを通して麻酔を維持する。
   6. ネオジムYAG(Nd-YAG)レーザー(ピーク波長1064 nm)を使用して、50J X 10 ポイントを1sパルス持続時間で、右半球の上の頭蓋骨の露出領域に投与する。
   7. 装置のレーザー発生部分が露出した領域から2mmの距離にあることを確認し、レーザー光線を生成します。異なるエネルギー/表面の組み合わせを慎重に評価した後、50J X 10 点 を選択した。この組み合わせは効率的であり、第2^の10未満の投与後に頭蓋骨の骨破壊を引き起こさない。
      注:2 mmは、レーザー光の端子(通す光ケーブルから)と頭蓋骨の間の距離です。焦点レンズを使用する場合、距離は、損傷の所望の領域にビームを焦点を合わせるためにレンズの傾斜の角度を考慮して計算する必要があります。適切なトレーニングと眼の保護を含むレーザー装置を使用する際には、適切な安全性を確保してください。
   8. 装置からラットを取り除き、3-0シルク外科縫合糸で頭皮を閉じます。
   9. 麻酔を中止し、ラットをケージに戻して回復します。0.25%ブピバカインを局所投与し、手術直後に術後の痛みを軽減する。
      メモ:正しく実行すれば、手順全体は5分未満で完了するはずです。
3. 麻酔後の回復中に苦痛の兆候についてラットを観察してください。麻酔から出現する前に、術後鎮痛のために0.01mg / kgの筋肉内ブプレノルフィンを与え、少なくとも48時間12時間ごとに反復用量を続ける。
4. 被験者はラットをレーザーに施すことなく同じ条件に制御する。

4. 神経学的重症度スコア(NSS)

1. 43点スコア¹³を用いて、レーザー誘発性脳損傷後の神経学的重症度スコア24時間を評価する。以前^{に詳述したように}、より重度の障害のためにより高いスコアを割り当てる神経学的欠陥、行動障害、ビームバランスタスク、および反射神経のために動物をテストする。

5. 傷害後の操作

1. NSS評価後、ラットを20%酸素および80%のCO2(インスピレーションを介して)にさらして安楽死させ、ラットにヘパリン化されたリン酸緩衝生理食塩(PBS、0.9%NaCl)を経線的に浸透させる。
   注:機関動物の世話と使用委員会のガイドラインに従って、CO₂ が所定のレートで提供されていることを確認してください。このステップはまた、5%イソフルラン麻酔下で行うことができる。
2. 脳を収穫し、以前のプロトコル¹¹に記載されているようにさらなる検査の準備をする。
3. 頭蓋骨からの分離後の脳全体の視覚検査を通じてくも膜下出血(SAH)を評価する。必要に応じて、顕微鏡や拡大鏡をこの目的に使用してもよい。

6. 脳損傷の評価

1. TTC染色による脳梗塞容積と脳浮腫の決定
   注:2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色は、脳梗塞検出¹¹のための便利な手順です。
   1. 収穫した脳を6つのコロナスライス、それぞれ2mmの厚さに切り離します。
   2. 0.05%TTCで37°Cで30分間、各脳からスライスのセットをインキュベートします。
   3. 染色後、1600 X 1600 dpiの解像度で光学式スキャナーでスライスをスキャンします。
   4. 固定脳スライスの染色されていない領域は梗塞¹²と定義される。
   5. 画像処理ソフトウェア(例えば、フリーウェア 画像J)を用いて、6つのコロナスライスのそれぞれについて、非梗塞領域、ipsi-および対角半球を測定する。
   6. 梗塞の体積を脳全体の割合として計算する:
      
   7. カプラン法を使用して脳浮腫を計算します。
      
2. 血液脳関門(BBB)破損の程度を決定する
   注:レーザー誘発脳損傷後のBBB破損24時間後を評価します。
   1. カニューレートされた尾静脈を介してラットに4mL/kg生理食液を静脈内に混合した2%のエバンスブルーを投与し、溶液を1時間循環させる。
   2. ラットを20%酸素と80%の_CO2(インスピレーションを介して)24時間後に曝露して安楽死^させる。
   3. 次のように、血管内局在性染料を収穫する:
      1. 外科用ピンセットと手術用はさみでラットの胸部を開きます。
      2. 右心房から無色の灌流液を得るまで110mmHgを用いて左心室を介して0.9%生理食動物を温化して動物を浸透させる。
   4. 脳を収穫し、2ミリメートルのスライスにロストロショードそれらをスライス。
   5. 左脳スライスを右部分から分離して、負傷した半球と負傷していない半球を別々に評価します。
   6. 重さを量り、モルタルと害虫を用いて均質化し、次いで脳組織を50%トリクロロ酢酸で24時間インキュベートする。
   7. ホモジナイズされた脳スライスを10,000×gで× g20分間遠心分離する。
   8. 1:3で96%エタノールの1.5mLと遠心脳からの上清の1mLを混合し、620 nm励起波長(10帯域幅)および680 nmの発光波長(10nm帯域幅)で蛍光検出器を使用して血液脳関門破損を評価する。
      注: ラットの両方のグループは、BBBの内訳を決定するために同じプロトコルを受けます。

制御または実験群のいずれにも死亡またはSAHが登録されなかった(表1)。MCAOグループは死亡率とSAHの両方の20%の割合を有していた。

両群のラットにおける相対体温変化も同様であったが、両群のばらつきの違いにもかかわらず(表1)。

レーザー(16 ±1.1)とMCAO(20±1.5)モデルの両方で、シャム操作対照群(1±0.3)と比較して有意に悪いNSSがあった。 表 1;0.01)。

レーザー誘発脳損傷はまた、恥操作対照群(2.4%±0.3対0.5%±0.1)と比較して、標的半球における梗塞容積の有意な増加を引き起こした。 表 2 および 図 1Ap<0.01)、マンホイットニーU検定に従って。しかし、レーザーモデルの梗塞容積はMCAO技術(2.4%±0.3対9.9%±2.9)に比べて小さかった。

脳浮腫は、脳損傷後24時間決定した 、図1B および 表2に示されている。レーザー誘発脳損傷モデルと恥手術対照群(3.4%±0.6対0.7%±1.2)の間には脳浮腫に差はなかった。レーザーモデルとMCAO技術(3.4±0.6対7±2.6†)の間には脳浮腫に有意な差があった。データは平均±SEMとして提示される。

シャム操作対照群と比較して、レーザー誘発脳損傷およびMCAO技術はいずれも、損傷を受けなかった半球でBBB破損を有意に増加させた(563 ng/ g ± 66および1176 ng/ g ± 168、それぞれ141 ng/g 14; 図 2A および 表 2p<0.01)および目標半球(2204 ng/g ±280および2764 ng / g ±256、対134 ng / g ±11; 図 2B および 表 2;0.01)。

ラットの脳の組織学的検査を 図3に示す。

表1: NSS、体温、くも膜下出血、死亡率の評価

表2:BBBの故障、梗塞帯、脳浮腫の評価 * = p < 0.01

図1:MCAOモデルおよびシャム作動制御と比較して、損傷後のレーザーモデル24時間における脳損傷の評価。 (A) 梗塞容積の評価レーザーモデルでは、恥の制御(*p<0.01)と比較して梗塞容積が増加しました。しかし、レーザーモデルの梗塞容積はMCAOモデル(*p<0.01)に比べて小さかった。(B) 脳の全浮腫の評価MCAOモデルでは、レーザーモデルまたはシャム操作制御と比較して脳浮腫が増加しました。レーザーモデルとシャム作動制御の間に脳浮腫に違いはなかった。データは逆半球に対して % として測定され、平均値 ± SEM として表 されます。

図2:BBBの内訳が、シャムコントロールと比較した程度。(A) コントララテラ(非負傷)半球。レーザーモデルとMCAOモデルの両方が、シャム作動制御群(*p<0.01)と比較して、負傷していない半球におけるBBB破損の有意な増加につながった。(B) イプシテララル (負傷) 半球.レーザーおよびMCAOモデルのipsilateral BBBの内訳は、シャム操作制御(*p<0.01)と比較して異なっていました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:偽、レーザー、MCAO群からのラットの脳の組織学的検査。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。