この実験では、マウスを血管を染色できるローダミンBイソチオシアネート-デキストランで尾静脈に注射します。肝臓が露出して固定された後、肝臓の特定の部分を選択して、多光子顕微鏡を用いて生体内の深部組織を観察することができる。
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この記事について
サマリー
要約
マウス肝組織の血管内ダイナミクスを観察することで、マウス肝臓の組織関連疾患に関するさらなる詳細な観察と研究を行うことができます。マウスは、血管を汚すことができる染料を注入されます。生体内でマウス肝臓を観察するために、フレーム内に露出して固定する。肝臓組織における血管の2つの3次元画像は、多光子顕微鏡を用いて得られる。選択した部位の組織の画像は、長期的な変化を観察するために継続的に取得されます。肝臓組織の血管の動的変化も観察される。多光子顕微鏡は、深部組織切片または器官における細胞および細胞機能を観察するための方法である。多光子顕微鏡は組織の微細構造に対する感受性を有し、生体内で高い空間分解能での生体組織のイメージングを可能にし、組織の生化学的情報を捕捉する能力を提供する。多光子顕微鏡は肝臓の一部を観察するために使用されるが、画像をより安定させるために肝臓を固定することは問題である。この実験では、特別な真空吸引カップを使用して肝臓を固定し、顕微鏡下で肝臓のより安定した画像を得る。また、この方法は、色素でそのような物質をマークすることにより、肝臓の特定の物質の動的変化を観察するために使用することができます。
概要
血管は、人体の様々な臓器組織に栄養素を提供し、物質を交換することができます。同時に、多くのサイトカイン、ホルモン、薬物および細胞はまた、特定の場所への血管輸送を介して機能する。肝臓組織の血管変化を観察することは、肝臓組織の血流の分布および物質の輸送を理解するのに役立ち、また、ある血管関連疾患の解析に役立つ1,2。
マウスの肝臓の血管を観察する方法はたくさんあります。中でも、光学顕微鏡検査は、不透明血管組織3を観察する上で多くの制限を有する。多光子顕微鏡は、非侵襲的な高分解能4を有する生きた肝臓の血管を画像化するために使用することができる。血管の3次元画像が得られるだけでなく、この技術は、その中の生物学的効果を観察するために組織を整理するのにも役立ちます。さらに、コンピュータ断層撮影や磁気共鳴画像5のように、組織全体をマイクロ血管ではなく画像化することができる。
多光子顕微鏡検査は、より少ない光毒性6で、深部の生体組織における散乱蛍光シグナルを効果的に検出するために使用することができる。したがって、生体組織の活性を確保....
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プロトコル
すべての動物のケアと手順は、ヒースと幸福のための中国南方病院の方針に従っていました(アプリケーションNo:NFYY-2019-73)。
1. マウスの準備
- マウスを麻酔します。
- 注射器にペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)を準備します。
- マウス(8週齢の雄C57BL/6)を左手でつかみ、腹が上向きになり、頭が尾よりも低くなるようにします。75%アルコールで腹部の皮膚を消毒します。
- 右手に注射器を持ち、3~5mmずつ針で腹部白線を突き刺す。注射針と皮膚が45°の角度であることを確認し、ペントバルビタールを腹腔にゆっくりと注入します。 シェービング後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液と交互に3回消毒する。
- 正しい反射の欠如によって麻酔が成功したかどうかを確認してください。
- ローダミンBイソチオシアネート-デキストランを尾静脈に注入する。
- 10 mg/mL ローダミンBイソチオシアネート-デキストランをシリンジに100 μL用意します。
- 75%のアルコールでマウスの尾を拭きます。
- 尾を左手で持ち、右手の注射器を静脈に平行な針で持ち、100μLの染料を注入します。
- 注射後に綿棒で出血を止める。
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結果
肝臓における血管の分布は、多光子顕微鏡を用いて得られた 図1に示されている。血管は、幹から発せられる複数の枝に分かれ、周囲の空間に分布する。血管の外周は赤く、内腔は暗く、内部には多くのものがあります。画像が鮮明であるほど、観察の平面に近くなります。色素が周囲の組織を貫通して他の物質を染色するため、周りにいくつかの赤い斑点もあります。 ビデオ1では、赤い血管の中を動く細胞である可能性のある赤以外のものがあります。ビデオの最後に、これらのもののいくつかは暗くなります。これはおそらく、固定肝臓が時間の経過とともに十分に固定されていないためです。この方法では、2時間のイメージングが可能です。
図1:多光子顕微鏡下の肝臓組織の血管。血.......
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ディスカッション
特定の生体組織を観察することは、組織17内の物質の変化、局在、および生物学的影響を理解する有効な手段である。この実験では、呼吸や心拍による動きの問題を解決できる臓器イメージングフィクスチャで肝臓を固定し、観察に多光子顕微鏡を使用することが重要です。この方法を用いて、生体内の肝臓の内部組織を多光子顕微鏡で観察し、血管を蛍光標識してその位置や立体構造を明確に観察する。この方法は、物質を蛍光標識し、生体組織内の物質に動的に従うことによって特定の効果を観察し、さらなる可視化を提供するために使用することができる。
多光子顕微鏡は、組織化された組織環境で細胞イベントから情報を収集するための不可欠なツールとなる新しい技術から進化してきました。しかし、特定の組織や臓器の観察に効果的に行うことができるように、安定した画像を生成するために臓器を固定する必要があります。呼吸や心拍からの動きのアーティファクトは、肝臓が直接画像化されるのを防ぐことができるので、真空吸着の原理を使用して臓器を固定し、画像の揺れを防ぐ身体器官の備品が使用されます。真空チャックはま.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は中国国立自然科学財団(81772133、 81902444)、広東自然科学基金(2020A1515010269、2020A15011367)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034、201903010072)、軍事医療イノベーションプロジェクト(170ZZ)
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mLシリンジ x 2 | 湖南省ピナン医療機器技術 | YA0551 | |
| 5 W 加熱パッド | BiolinkOptics 技術 | BL336 | |
| 75% 無水エタノール | 広東省 光華科学技術 | 1.17113.023 | |
| 吸収性綿球 | 健康衛生王国 | ||
| マウス 手術器具 | RWD ライフサイエンス | SP0001-G | はさみとピンセットを含む |
| 多光子顕微鏡 | オリンパス | FV1200MPE | |
| 臓器イメージングフィクスチャ | BiolinkOptics Technology | BL336 | 吸盤、ホース、負圧ポンプ、ブラケットを含む |
| ローダミンBイソチオシアネート–デキストラン | Σ | R9379 | |
| シェービングマシン | レイワ | RE-3201 | |
| ペントバルビタールナトリウム | Σ | P3761-25G |
参考文献
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report. Medicine (Baltimore)
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再版と許可
