AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

1980年代¹の発明以来、原子間力顕微鏡(AFM)は、サブナノメートル空間分解能、サブピコニュートン力分解能、および様々な溶媒および^温度条件2、3、4、5、6、7で測定する可能性を特徴とする自然科学において最も重要なイメージング技術の1つとなっている。^,3,4,5,6,7

イメージング^,8,9とは別に、AFM は単一分子力分光法 (SMFS) を行い、単一のポリマーと表面の接着相互作用、単一ポリマーの物理的性質、およびタンパク質の展開機構^{7,,10,,11,12,,13,,14,,15,,16.}通常のSMFS実験では、機能性のあるカンチレバー先端が表面に接触し、AFM片持ち角先端のフィシソルブでポリマーがこの表面に接触するようにします。表面からAFM片持ち先端を引き込み、AFM片持ち面のたわみの変化が力伸長曲線⁴に至る力に変換される。伸縮力、脱着力および脱離長などの物理的パラメータは、引っ張り速度、表面のドウェル時間、表面へのくぼみ深さ、温度、溶媒^17、18,18および固体基質、ポリマーフィルムまたは支持脂質二重層^{19、20、21、2220,}のような異¹⁹なる表面などの異なるパラメータに依存するように決定することができる。^21,22さらに、ポリマーは異なる空間方向でプローブすることができ、このようにポリマー^{23、24、25、2624,25}の摩擦特性^を調^べた。²³

このような研究には、調査したポリマーをAFM片持ち体先端に共有結合することが不可欠である。したがって、AFMカンチレバー先端に結合した1種と同じポリマーを有する単一分子事象の高^,収率は、AFM片持ち^27、28、ナノフィッシング実験^{30、31、32,31}の場合のようなAFM片持ち^{3227、28、28}可変付着点²⁹または異なるポリマー(異なる輪郭長を有する)の較正による結果の偏りを防ぐ。また、他のポリマーとの相互作用、ならびに平均化効果は、^{広く18、28を28}防止することができる。AFM片持ち先端へのポリマーの共有結合については、異なる種類の化学修飾が適用され、その多くはハーマンソン³³によって本にまとめられる。アミンおよびチオールベースのリンク反応ならびにクリック化学は、AFMカンチレバー先端機能化^{34、35、36、37、38、39、40、41、42,35,36,37,38,39,40,41}において最も一般的に使用される方法^を42表す。Beckeら⁴⁰は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)/NHS化学を使用して、AFMカンチレバーチップにタンパク質を結合する方法を示しています。しかし、前記の機能グループは、クロスリンクする傾向があり、機能^43、44,44の損失を招く。また、カルボディイミドは、溶液⁴³において加水分解を速くする傾向を示す。マレミドおよびチオール基は、一般的により安定であり、架橋反応を示さない。提示されたプロトコルは、参照^35,,39で提供されている以前に公開されたプロトコルの最適化です。

ここでは、輪郭長や疎水性などの特性に関係なく、多数の異なるポリマーに容易に調整することができる信頼性の高い官能化プロトコルが提示される。3つの異なるポリマーが例として選ばれました:親水性ポリエチレングリコール(PEG)およびポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNiPAM)、ならびに高モルマス疎水性ポリスチレン(PS)。適切なリンカー分子を有する共有結合能力を提供するために、3つのポリマーを機能末基としてテレキレートチオール部分を特徴とするポリマーを選択した。リンカー分子自体は、典型的には、2つの活性部位を有する短いPEGポリマーであり、一方の端にシラン基、もう一方の端にマレイミド基である。前者は、AFM片持ち弁当先端と後者に対して、官能化された高モルマスポリマーのチオール基との結合反応に対する共有結合を可能にする。さらに、不活性PEGリンカー分子は、プローブポリマーとAFMカンチレバー先端とAFMカンチレバー先端と下層表面との間の望ましくない相互作用を防止するパッシベーション層として機能する。

注: 図1を参照して、概略図の概要を確認してください。

1. 試薬のセットアップ

注:このプロトコルに使用されるポリマーは、マレイミドポリエチレングリコールトリエトキシシラン(シラン-PEGマル、 5 kDa、チオールポリエチレングリコールチオール(HS-PEG-SH、35 kDa)、チオール終了ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNiPAM-SH、637 kDa)およびチオール終了ポリスチレン(PS-SH、1.3 mDa)

1. 原子移動ラジカル重合を介して明確かつ高モル質量PNiPAM-SHを調製し、続いて、文献¹⁸に記載されているように、チオール部分の導入のための機能的エンド基の変換および還元を行う。詳細な構造については、図1を参照してください。
2. 化学物質を貯蔵するために、大気の酸素および湿気への暴露を避けるために窒素の大気が付いている乾燥した手袋システム内のより小さいアリコートを準備する。PEGおよびPNiPAMは、吸湿^,性^{45、46および46}PEG、PNiPAMおよびPSの機能的末端群が周囲条件^{33、47、4847}に保存されると³³容易に酸化することが知られている。⁴⁸すべての化学物質は-20°Cで保管する必要があります。
3. 分析グレードの溶剤以上を使用してください。また、単一分子実験はすべての汚染に非常に敏感であるため、AFM片持ちチレバーチップとガラス製品をすすぐには超純水を使用してください。

2. 機器のセットアップ

注:ステンレス鋼またはガラス製のピンセットやビーカーを使用してください。反転ピンセットを使用して安全なグリップ(例えば、低いばね定数を有するR3 SA)を使用します。

1. RCA(超純水、過酸化水素、アンモニア(5:1:1))溶液を調製し、ガラス製品とピンセットを洗浄します。
2. 容器をビーカーに入れ、ガラス製品またはピンセットが完全に覆われるまでRCAで満たします。
3. ステップ2.2からビーカーを80°Cで1時間加熱します。
4. 刺激臭がもはや確認できないまで、その後、超純水で容器を洗い流します(少なくとも3回)。
5. オーブン(120°C)で乾燥したガラス製品とピンセット。

3. チップ機能化

注:すべてのステップは、有機蒸気の吸入を避けるためにヒュームフードで行われるべきです。さらに、手袋、実験室のコートおよび目の保護は要求される。汚染を避けるために、すべてのステップにニトリル手袋またはラテックス手袋を使用してください。トルエンを使用する場合は、溶剤耐性手袋を着用してください。特に指定がない限り、すべてのステップはRTで行われます。

1. AFMカンチレバーチップMLCT-Bio-DCに酸素プラズマを適用して表面活性化を行います。
   注:さらなる機能化ステップのためのプラズマ処理の効率は、プラズマチャンバ内の酸素含有量に応じてスケールします。
   1. AFMカンチレバーチップをプラズマチャンバー(40 kHz、600 W)に入れるには、清潔にしたピンセットを使用してください。
   2. カスタム変更活性化プログラムを使用する: 排気 (0.1 mbar) – 酸素での洪水: 0.2 mbar (4分) – プラズマプロセス (電力: 40%, 持続時間: 2 分, プロセス圧力: 0.2 mbar).
   3. 空気からのAFMカンチレバーチップへの汚染物質の吸着を防ぐために、部屋を換気し、すぐにステップ3.2.2で続けます。
2. シラニゼーションとペジリゼーション
   注: タイミングはステップ間の重要なパラメータです。待ち時間の間にできるだけ新鮮なソリューションを準備します。マレイミド基は、水性媒体中で加水分解を受け、チオールは溶液^33、47,47においてAFM先端官能化反応を妨げるジスルフィドに酸化され易い。
   1. 溶剤耐性プラスチックまたはガラスチューブでトルエン(1.25 mg/mL)にシラン-PEG-マル溶液を調製し、平らなペトリ皿に6mLの溶液を注ぎます。
      注:SMFS実験で複数のプローブポリマーの結合が観察された場合、シラン-PEGマルと非機能的なシラン-PEGを混合すると、アンカーポイントの数を減らすことができます。異なる質量(すなわち、輪郭の長さ)を有するパッシベーション層PEGの調整のために²⁷を使用することができる。
   2. ステップ3.1.3の直後にAFMカンチレバーチップをシラン-PEGマル溶液(ペトリ皿あたり最大10チップ)で60°C35で3時間インキュベートする³⁵。
   3. ペトリ皿をオーブンから取り出し、溶液を少なくとも10分間冷まします。
   4. 各AFMカンチレバーチップを慎重にリンスします。空気溶剤界面を通過する際に、例えば溶液に浸漬するときにこれらのチップをわずかに傾けることによって、AFM片持ち面でキャピラリー力の影響を軽減します。
      1. PEGおよびPSポリマーの場合、トルエンで3回リンスします。
      2. PNiPAMポリマーの場合、トルエンで1回、エタノールで2回リンスします。
   5. コントロールAFM片持ちチレバーチップとして少なくとも2つのAFM片持ちチレバーチップを選択し、ステップ3.3をスキップして、次のようにして溶媒の極性を高めるためにそれらをリンスします。
      1. PEGおよびPSポリマーの場合、エタノールで2回、超純水で1回リンスします。
      2. PNiPAMポリマーの場合、超純水で2回リンスします。
         注:コントロールAFM片持ちチップは、ポリマーの取り付け(ステップ3.3)を除くすべての機能化手順を経ています。それらは機能化プロセス、AFMの片持ちのチップホールダーシステム、表面およびSMFS実験のために使用される溶媒の清浄度を証明するために役立つ。
3. 共有ポリマーアタッチメント
   注:AFMカンチレバーチップはマレインミド基で完全に覆われると予想されていますが、マライミドは水中で加水分解を受け、非アクティブなPEGs⁴⁷につながるため、単一のプローブポリマーの結合部位はごくわずかです。これらの非アクティブな PEG は、上述のように、パッシベーション層として機能します。
   1. 3 mLペトリ皿の次のポリマー溶液の1つでステップ3.2.5の直後にAFMカンチレバーチップをインキュベート。それぞれのポリマーが適切に溶解しない場合は、40°Cの水浴を使用し、溶液をよく攪拌する。
      注:チオール末止めポリマーの使用は、シラン-PEG-malのマレイミド基との反応を妨げるジスルフィド結合の形成につながる可能性があるため、特に水溶性ポリマー³³の水溶液バッファーにステップ3.3が適用される場合には還元剤が推奨される。
      1. PEGおよびPSポリマーの場合、トルエン中の濃度1.25mg/mLを60°Cで1時間使用してください。
      2. PNiPAMポリマーの場合、エタノール中の1.25mg/mLの濃度をRTで3時間使用してください。
         注: SMFS実験で複数のプローブポリマーの結合が認められる場合、ポリマーの濃度を低減する必要があります。
   2. 各AFMカンチレバーチップを慎重にすすいでください。
      1. PEGおよびPSポリマーの場合、トルエンで2回、エタノールで2回、10分後に超純水で1回、冷却します。
      2. PNiPAMポリマーの場合、エタノールで2回、超純水で2回リンスします。
   3. 実験に使用するまで、4°Cの超純水で満たされた小さな(1 mL)ペトリ皿に各AFMカンチレバーチップを別々に保管してください。

4. 表面の準備

1. 酸化シリコンウェハ
   注: このサーフェスは、PEG および PNiPAM を使用する SMFS に使用されました。
   1. ダイヤモンドナイフを使って、酸化シリコンウエハを小さく切ります。
   2. シリコン酸化物をマイクロ遠心チューブに別々に入れ、これらのチューブにエタノールを充填します。
   3. シリコン酸化物片を10分間超音波処理します。
   4. 酸化ケイ素をエタノールで2回リンスし、窒素流で慎重に乾燥させます。すぐに酸化ケイ素片を使用してください。
2. 疎水性アルカンチオールの自己組み立て単層(SAM)
   メモ: このサーフェスは、PS を使用した SMFS に使用されました。MS の詳細については、文献^39,49を参照してください。^39,
   1. 4.1.1 ~ 4.1.4 の手順を実行するには、ゴールドコーティングされたシリコン ウェーハ (A [100]、5 nm チタン、100 nm ゴールド) を使用します。
   2. 表面片を1-ドデカンチオール溶液(2mM)で18時間インキュベートします。
   3. 作りたてのサームをエタノールで2回リンスします。
   4. 直接使用する窒素流を使用してSAMを乾燥させるか、後で使用するために4日間までエタノールでそれらを保存します。

5. データ取得

注:ここに示すすべての測定は温度変化のための暖房および冷却のサンプル段階を使用してCypher ES AFMと超純水で行われた。一般的に、液体で測定する機能を提供するすべてのAfMを使用することができます。

1. 機能化されたAFMカンチレバーチップをAFMに挿入します。
2. 調製した表面を液体での測定に適したサンプルホルダー(例えば、高解像度複製化合物101RFまたはUV硬化性接着剤)に接着します。
   注:これらの結合剤は、極性溶媒の多数に対して非常に不活性で耐性があります。非極性溶媒(例えば、トルエンまたはヘキサン)または高温に対する接着剤の抵抗は、使用前に確認する必要があります。
3. AFMカンチレバーチップとプローブサンプルを液体に浸します。
   注:溶媒の低下(約100 μL)はAFMの片持ちチップホルダーに付託することができます。AFMカンチレバーチップを溶媒で覆うことは、空気溶媒界面を通過するサンプル表面に近づくと、AFMカンチレバーに作用するキャピラリー力を低下させます。
4. 必要に応じて温度を調整し、システムを平衡にします。
   注:温度変化はアルミニウムまたは金のような反射コーティングが付いているAFMの片持ち弁持ちのバイメタル効果のためにAFMの片持ちの偏向をもたらすかもしれない。偏向信号のそれ以上の変化が観察されないまで、平衡化は表面(数μm)から離れて行われるべきです(MLCT-Bio-DCの場合は最大15分)。
5. 機能化の老化の影響を排除するために、温度をランダムに変化させます。適用される温度がAFMカンチレバーの不可逆的な曲がりにつながらないようにしてください。
   注: 溶剤の特性に対する温度の影響(蒸発や粘度の変化など)は、実験を妨げる可能性があります。提示例では、温度は、溶媒として水を取る10Kのステップ(例えば、278Kから318K)の範囲にわたって変化した。
6. 表面に近づき、硬い表面(酸化ケイ素など)に力延長曲線を取ることによってInvOLS(逆光レバー感度)を決定します。このためには、光検出器の偏向信号(V)対ピエゾ距離を取り、線形関数を使用してAFM片持ち角先端の下層部(反発的なレジーブ)へのインデントを表す部分の傾きを決定する。エラーを減らすために、少なくとも 5 つの値の平均をとって、最終的な InvOLS 値を取得します。詳細については、文献^44,39を39参照してください。
   メモ: InvOLS は硬い表面でのみ確実に決定できます。ソフトサーフェスまたはインタフェースでの実験の場合は、硬いサーフェスを柔らかいサーフェスの近くに配置してください。その後、InvOLSキャリブレーションは、AFMセットアップを分解することなく、柔らかい表面実験の前後に行うことができます。
7. ばね定数の決定のために、AFMカンチレバー先端と表面の間の魅力的な、または反発的な相互作用(数μm)の間の高さにAFMのカンチレバーを動かします。次に、電力スペクトル密度(PSD)対周波数がプロットされる熱ノイズスペクトルを記録します。以下のステップは、通常、商用AFMソフトウェアの自動組み込み機能によって行われます:まず、取得した熱ノイズスペクトルは、PSD、例えば、単純な高調波発振器(SHO)に関数を合わせることによって分析されます。フィットは、第1と第2の共振の間の最小まで行われます。第2に、PSD対周波数プロットの適合部の下の面積は、AFM片持ちの平均二乗変位を垂直方向に表す決定される。最後に、等分割定理は、AFM片持ち力定数^28,50,を得るために使用^される。
   注:適切な周波数範囲は、AFMカンチレバーの第1の共鳴ピークを含んで使用されるべきです。信号対雑音比を得るためには、可能な限り高い周波数分解能を持つ少なくとも10個のPSDを蓄積する必要があります。
8. 実験を開始します。力拡張曲線をグリッド状の方法(例えば、20 x 20 μm²の領域の場合は10 x 10ポイント)にして、局所的な表面効果(不純物、転位など)を回避し、異なる表面積を平均化することで、力のマップを記録します。
   注:典型的なパラメータは、十分な解像度を確保するために、1 μm/sの引き上げ速度と5kHzのサンプリングレートです。引き上げ速度が変化する場合は、サンプリングレートを調整する必要があります。リトラクト距離は、測定されたポリマーの輪郭または脱着長(予想される長さの約2倍)に合わせるべきです。
9. 単一のポリマーが表面に付着するように、表面に向かって歩入時間を変更します(通常は0-5 s)。
10. 実験の最後に InvOLS とばね定数の判定を繰り返して、システムの一貫性と安定性を確認します。
    注: ポリマーと表面の密着性を高めるために、実際の実験の後にキャリブレーションを行って機能を維持することができます。

6. データ評価

注:データ評価のために、Igor Proに基づくカスタム作成ソフトウェアを使用して、次の手順を実行しました。

1. 記録された InvOLS と確定ばね定数を乗算して、生の偏差信号 (ボルトのボルト) をフォース値 (ニュートン) に変換します。
2. 真の伸び(先端面距離⁾⁴を得るために、ピエゾ要素が垂直方向に駆動する距離からAFMカンチレバーの偏向(InvOLSで生の偏向信号を乗算した後)を差し引く。
3. 最後のイベントの後に線形関数をベースラインにフィットさせ、フォース延長曲線から同じ関数を引くことで、ドリフトのために得られた力延長曲線を修正します。適合部は、AFM片持ち先端と下地表面との間に魅力的な相互作用も反発的な相互作用も観察されない表面からの十分な延長を表す必要があります。次に、ベースラインはゼロ軸に設定されます。
   注: 金のような反射率の高いサーフェスでの測定の場合、干渉が現れる場合があります。これらは、表面からのレーザー光の部分的な反射およびAFMカンチレバーの裏側からの結果である。したがって、得られた力延長曲線は、垂直延長に沿った弦波力信号アーティファクトを示す可能性があります。これは、最終的な力の値を妨げるアーティファクトです。これらの力延長曲線を考慮するために、修正が可能です(図2)。
4. 干渉が力延長曲線に現れる場合は、非特異的接着のピークと同じ正弦波アーティファクト(すなわち、振幅と位相)を示す代表的な力延長曲線(引き込み曲線)を選択する(図2)。A
   注: 干渉の低周波パターンを得るために、代表的な力延長曲線を滑らかにします。
5. 修正する力延長曲線を選択します (図 2B)。
6. 手順 6.4 から両方の力延長カーブをオーバーレイします。6.5.両方が同じ正弦波アーティファクト(すなわち、振幅と位相)を表示することを確認する(図2C)。
7. (平滑化された)代表力延長曲線を、正しい力延長曲線から差し引いて正弦軌道ベースラインではなく直線に導く(図2D)。
   注: 代表曲線の非特異的接着ピークは、修正するカーブに現れる単一分子イベントとは異なるように注意してください。実際には、代表曲線の選択は、適切な補正のために重要です。

以下の例は、ポリマーPEG、PNiPAMおよびPSの単一分子伸縮および脱離の結果を示す。すべてのAFM片持ちの先端は、上記のプロトコルで機能していた。PEGおよびPNiPAMは、温度変動を伴うSiOxで測定した。PEGおよびPNiPAMの結果として生じる温度依存性延伸曲線の詳細については、コルバーグら18異なる力延長モチーフが一定の力の高原である(例えば、水中44,27,39,5127,のメチル終結アルカンチオールの自己組み立て単層からPSを脱離する場合)を参照してください。39,51

例1:水中のペグとPNiPAMのストレッチ
水中の温度依存性の延伸挙動は、一方の端でAFM片持ち先端に共有結合し、もう一方の端でSiOx表面にフィジセル化した単一のPNiPAMおよびPEGポリマーを使用して測定した。キャリブレーションおよびクリーンコントロール実験(力延長曲線の2%未満は単一分子事象を示す)の後、各AFM片持ち体について少なくとも2つの力マップが記録された。温度依存実験は、各温度で少なくとも1つの力マップを記録することによって行った。わずか数のストレッチイベントしか出現しなかったとき、それぞれのAFM片持ち体は廃棄され、次のAFM片持ちは(通常、MLCT-Bio-DCのC、B、DおよびEの順序で)取られた。PEGの例示的なデータについては、500の測定された力延長曲線のうち95(19%)で単一のストレッチイベントが観察された。PNiPAMの場合、600本の力伸延曲線のうち252本が伸縮パターン(42%)を示した。力延長曲線の比較を改善するために、すべての温度に対して単一のマスターカーブが生成されました。この目的のために、立体構造変動および溶媒効果が無視できる500pN以上に延伸事象を有する曲線のみが52を選択した。最終的に考慮したストレッチの数は、278 Kで3、PEGで318 Kで7、PEGで4、278 Kで4、PNiPAM18の場合は318 Kで3でした。

マスターカーブを生成する手順を図 3に示します。選択した力延長曲線Figure 3(図3A)は、長さL0(500 pNの力での延長)に再スケールされます。接着ピークは、表面とAFM片持ち線先端との間の非特異的接着の大きなばらつきを示すが、ポリマーの伸張挙動には影響しない。再スケールされた力延長曲線をマージした後、図3Cに示すように、二公称スムージングによって平均化されます。このため、ガウスフィルタは、平滑化パラメータ2053に等しいレベルで、パスカルの三角形から導出された正規化係数を使用してデータを畳み込みます。最後に、図3Dに示すように、すべての温度に対してマスターカーブが得られます。拡大すると、力延長動作に対する温度の影響が最も顕著になる範囲が表示されます。

PEG (A) と PNiPAM (B) の温度挙動の比較は図 4にあります。PEGについては、温度上昇に伴う延伸力の低下が認められた。温度を278から318Kに上げると、100pNでの再スケール延長の約5%の増加が観察された。PNiPAMの場合、逆の温度依存シフトが明らかになる可能性があります。温度が278から328Kに増加した場合、100pNでの再スケーリング延長の約1%の減少が観察された、加えて、任意の与えられた力の値の曲線の下の面積を決定することによって、力延長マスター曲線から伸縮自由エネルギーを得ることができる。これは、分子動力学(MD)シミュレーション18の助けを借りて、伸びる自由エネルギーのエネルギーを抽出するために使用することができます。

例2:水中のSAM表面からのPSの脱離
水中のSAM表面からのPSの脱離は、脱着力と長さを決定し、それによって疎水性相互作用を定量化するために使用することができる。較正後、少なくとも2つのフォースマップを、表面の2つの異なるスポットで記録した。ポリマー付着が成功すると、力伸長曲線は一定の力のプラタスを示し、特徴として、図5AAおよび図5Cを参照してください。プローブ結合のダイナミクスがAFM片持ち先端の引き上げ速度(準平衡)よりもはるかに速い場合には、高原様脱離が観察される。高原状の力伸力曲線の脱着力は、力伸力トレース54を統合することにより、接着自由エネルギーを直接提供する。それらは、静電、分散および疎水性相互作用、ならびに液体環境における表面上の単一ポリマーの摩擦特性を決定するために使用されてきた42、4、23、51、54、55。,23,51,54,55,

一定の力の各高原は、分離力と脱着長を決定するためにシグモアダル曲線を取り付け、その後ヒストグラムでプロットした。ヒストグラムにはガウスが取り付けられ、最大値と標準偏差が抽出されました。より良い概観図を得るため、図 5Bおよび 図5Dに示すように、脱離力と長さの値は散布図にまとめて表示されています。

水中のSAM上のポリスチレンの場合、決定された脱離力は、以前に得られた値19,23,23に対応する。脱離長がポリマー輪郭長51と相関するように、脱離長分布は、その官能末端基を介してAFM片持ち先端に対するそれぞれのポリマーの共有結合の証拠として使用することができる。したがって、脱着の長さは指紋として機能します。

AFM片持ち板先端に付着した複数のポリマーについて、力伸力曲線56において、高原(離散段階)のカスケードが観察され得る。各高原は、異なる延長でのポリマーの脱離を表す。図5Cおよび図5Dで行われた実験は、AFM片持ち先端に同時に結合した2つのポリマーの典型的なケースを示した。最終的な破裂に適合させることで、脱着長の双値分布を見つけることができ、脱離力は狭い分布を示した。この場合、より小さい脱離長は、図5Cに示すように、単一の高原として、または長い高原上の追加の高原として、力伸長曲線の90%に見つけることができる。より高い脱離長は、得られた力延長曲線の37%で発見された。したがって、脱離長分布は、AFMカンチレバー先端に付着した異なるポリマーの数を決定するために使用することができる。一般に、脱離長値の狭い分布は、1つと同一の単一ポリマーが得られた力延長曲線でプローブされたことを示す良好な指標である。同時に、それぞれの力延長の重ね合わせを用いて、1つのポリマーと同一のポリマーが測定されたかどうかを決定することができる。

単一のPSポリマーの共有結合を証明した後、このPSポリマーを用いたさらなる実験は、様々な基質(固体表面ならびにポリマーフィルム)、溶媒条件、温度、引っ張り速度またはドウェル時間を行うことができる。

図1:先端機能化プロセスの概略図。AFMカンチレバー先端の化学修飾を含む(1)血漿活性化後(2)のライアナイゼーション/PEGylationおよび(3)ポリマー付着。さらに、使用されるポリマーの詳細な化学構造、すなわちPEG、PNiPAMおよびPSが示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:力延長曲線の干渉の除去(A) 伸張に沿って、単一分子伸張イベントを持たない、内弦波力信号アーティファクトを示す力延長曲線を見つける。(B) 正弦波人工物から補正する単一分子事象を持つ力延長曲線を選択します。(C) 曲線の弦波アーティファクトが本当に一致しているかどうかを制御するために、曲線を重ね合わせる。(D) 力延長曲線(A)を(B)から差し引くことにより、直線基線を持つ力延長曲線が得られる。接着ピークはさらなる分析には使用できませんが、力延長曲線は、単一分子事象の領域ではるかに正確な力値につながるアーティファクトに対して補正されるようになりました(ここでは、+0.2μmの拡張)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:298KにおけるPEGの力延長曲線からのマスター曲線の決定。(A)298 Kの実験データ、7つの力延長曲線を用いた。500 pN(B)の力で長さL0に再Bスケーリングした後、力延長曲線をマージし、マスターカーブを得る二公称スムージングによって平均化することができます(C)。再スケールされたカーブはドットとして指定され、マスターカーブは実線で表示されます。最後に、得られた異なる温度のマスターカーブを比較することができる(D)。ズームインは、力延長動作に対する温度の影響が最も顕著である範囲を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:PNiPAMとPEGの温度依存のマスター曲線の比較。PEGの場合、温度を上昇させると100pN(中力範囲)で再スケールされた延長の増加が観察Aされ(A)、PNiPAMの場合は逆の温度依存シフトが明らかにされる(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:水中のSAM上のPSの力延長曲線の解析(A) 例示的な力延長曲線 (青) と高原のシグモイドフィット (紫).また、矢印は、高原の決定力(赤)と長さ(緑)を示します。シグモイド適合によって得られた脱着力と脱離長の値は散布図に表示され、結果のヒストグラムはガウスが合う。(B)決定された平均脱離力及び脱離長値は、(112±6)pN及び(659±7)nmであり、ここで、力伸長曲線の93%がこのような単一のプラトー事象を示す。(C)AFM片持ち線先端に付着した2つのポリマーに対する例示的な力延長曲線(青色)を同時に行う。Cここで、脱離力は平均力値(117±5)pNの単一性分布を示し、一方、(656±9)nmおよび(1050±16)nmの平均長さ値に至る脱離長に対してバイモーダル分布を見つけることができる。(D)サンプリングされた力伸張曲線の 90% は、単一のプラトー事象のみを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。