マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

角膜や結膜を含む眼表面構造は、外部の障害から他のより深い眼組織を保護します。角膜は眼の透明な前部であり、眼に光を向ける屈折レンズとしても、防護壁としても機能する。角膜上皮は角膜の最外層であり、表面細胞、翼細胞および基底細胞の別個の層から成っている。角膜のストロマは、角質細胞を埋め込んだ洗練されたコラーゲン状のラメラで構成されています。角膜内皮は、平らな六角形細胞の単層であり、そのポンプ機能¹を通じて比較的脱水状態で角膜間質を保つことによって角膜の透明性を維持する上で重要な役割を有する。リンブスは角膜と結膜との境界を形成し、角膜上皮幹細胞²の貯留部である。高血管化結膜は粘液と涙を作り出すことによって目を潤滑するのに役立^{つ 3}.

角膜表面構造の細胞ダイナミクスは、従来、組織学的解析またはインビトロ細胞培養によって研究されており、in vivo細胞ダイナミクスを十分にシミュレートできない可能性があります。非侵襲的なライブイメージングアプローチは、したがって、そのようなギャップを埋めることができます。高解像度、最小限の光ダメージ、より深いイメージング深さを含むその利点のために、MPMは^,生物学的研究^{4、5、6、7、85,6}の多様⁴な分野で強力なモダリティとなっています。^7,8角膜イメージングの場合、MPMは細胞内NAD(P)Hに由来する内在性自己蛍光からの細胞情報を提供する。フェムト秒レーザースキャン下での非中心対称型I型コラーゲン繊維に由来する第2高調波発生(SHG)信号は、追加の染色手順⁹を伴わないコラーゲン間質構造を提供する。以前は、私たちや他のグループは、動物やヒトの角膜^{,,99、10、11、12、13、14、1510,11}のイメージングのためにMPM^を15利用してきました。^13,1412

特定の細胞集団に蛍光タンパク質を示すトランスジェニックマウスラインは、細胞生物学において、発達、組織恒常性、組織再生、発がんなど様々な研究に広く用いられている。我々は、角膜^99、10、毛包¹⁰および表皮¹⁰の生体内イメージングに蛍光タンパク質で標識されたトランスジェニックマウス株を¹⁰MPMで用いた。TdTomatoとEGFPでタグ付けされた細胞核を有する二重蛍光マウス株は、R26R-GR(B6;129-Gt(ROSA)26Sor^{tm1Ytchn/J、#021847)16}および¹⁶mT-mG(GT(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP、#00767617)^{ACTB-tdTomato-EGFP17}R26R-GRトランスジェニックマウスラインは、H2B-EGFP融合遺伝子およびmCherry-GPIアンカーシグナル融合遺伝子を含む二重蛍光タンパク質レポーター構築物を含み、Gt(ROSA)26Sor遺伝子に挿入される。mT-mGトランスジェニック株は、細胞膜標的tdTomatoおよびEGFP蛍光クレレポーターマウスである。Cre組み換えの前に、tdTomato蛍光発現を有する細胞膜タンパク質は、様々な細胞に広く存在している。このトランスジェニックマウス株は、Cre励起なしでtdTomatoで核-EGFPと膜を可視化することを可能にします。2匹の雌(R26R-GR^+/+)と1匹の雄(mT-mG^+/+)トランスジェニックマウスを共に飼育し、実験に十分なマウスを産生した。R26R-GR +--;mT-mG+/-^+/-遺伝子型、二重蛍光マウス株を有する彼らの子孫は、この研究で使用された。^+/-前述の^99,1010のような1つの蛍光レポーターマウスラインと比較して、この二重蛍光レポーターマウス株は、画像化時間の取得を50%短縮します。

本研究では、イメージングプラットフォームとデュアル蛍光トランスジェニックマウスを用いて、眼表面のインビボイメージングに関する詳細な技術プロトコルを段階的に説明する。

すべての動物実験は、国立台湾大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)とチャンガン記念病院によって承認された手順に従って行われました。

1. 多光子顕微鏡のセットアップ

1. 水浸漬20x 1.00 NA目標を持つ直立顕微鏡をベースにしたシステムを構築します(図1A)。
2. Ti:サファイアレーザー(調整可能な波長)を励起源として使用してください。EGFPの場合は880 nm、tdTomatoの場合は940 nmのレーザー出力波長を設定します(図1A)。
3. SHG/EGFPとEGFP/tdTomatoの分離のための2つの二色性ミラー(495 nmおよび580 nm)を含める(図1A)。スペクトルは、SHG信号を分離し、バンドパスフィルタ434/17nm、510/84nmおよび585/40nmによってEGFPおよびtdTomatoを分離する(図1A)。
4. 画像品質を最適化し、光の漂白や組織の損傷を避けるために、レーザーパワーを、角膜イメージング用約35mW、四肢用50mWに設定します。レーザーが光学系を通過する前に、レーザーパワーを測定します。サンプルの正確なレーザーパワーは約8-9 mWです。完全な顕微鏡設計を 図 1Aに示します。
   メモ:レーザーパワーの上限は、光の漂白や組織の損傷を避けるために70 mWに設定されています。

2. ライブイメージングのための動物の準備

1. 実験には8-12週齢のマウスを使用してください。全身麻酔用に50-80mg/kgのタイルアミンHClとゾラゼパムHClを筋肉内に注入する。つまみで離脱反射への応答の欠如を確認します。安定した呼吸数のモニタリングを可能にするためには、十分な麻酔が重要です。
   注:8週以上のマウスは眼球が成熟しているため、お勧めします。
2. 加熱されたステージで麻酔下にマウスを置き、温度監視プローブをアヌスに挿入します。
   注意:プローブは、ヒーターの過熱や熱中症の誘導を避けるために、空気にさらされることなく肛門腔に完全に挿入する必要があります。

3. 眼表面の生画像化のための目保持

1. 眼表面のライブイメージングの場合、ヘッドホルダーを安定させるヘッドホルダーと眼ホルダーの2つの部分からなるカスタム設計のステレオタックスマウスホルダーを使用して、まぶたを後退させ、眼表面全体を露出させます(図1B-D)。
2. 耳の棒を外部聴覚の肉に挿入し、ヘッドホルダーの3点固定を維持する(図1B,D)。
3. 局所的に塩水に0.4%オキシブプロカイン塩酸塩の溶液を適用し、眼表面を麻酔するために3分間放置します。
4. 眼球が適切な手動眼瞼引き込みによって突き出されていることを確認してください。さもなければ、眼球の虚血および出血が起こり得る。
5. 眼のホルダーのポリエチレンチューブのループを眼瞼のマージンに沿って慎重に配置し、眼表面を露出させます。ポリエチレンチューブのループで覆われた先端を持つ5番目のデュモン鉗子で構成された眼球を安定させます(図1C,D)。
6. 眼球を安定した状態に保つために、眼ホルダーの遠位鉗子のノブを使用してスクリュー鉗子を取り付けます(図1D)。
7. 角膜表面に1.338の屈折率を持つアイジェルを浸漬媒体として塗布し、1時間ごとに眼表面の水分を維持します。さらに、眼ゲルの定期的な塗布は、イメージング中に角膜での曇りを避けます。
8. 中央角膜から周辺領域まで角膜表面全体を横切ってイメージングするために、ステッパー電動ステージにロックされたホルダーで眼球を回転させます(図1C,D)。
   注意: 過剰な量と不十分な量のアイジェルは、イメージング中の画像の品質に影響を与える可能性があります。したがって、表面を定期的に湿らせ続けるために1時間ごとに目ゲルを補うことがイメージングにとって重要である。

4. Zシリアル画像の取得

注: ドロップモーションのアーティファクトを減らすには、すべてのスタックの最初と最後のスライドを設定します。

1. 画像を撮影する前に、水銀光源でターゲットフィールドを画像化します。
2. ソフトウェアをオンにするには、顕微鏡ソフトウェアのシンボルをクリックします。
3. 正しいPMTゲインとデジタルゲインを選択して、眼表面の細胞構造を可視化します。
4. 最初のスライドと最後のスライドを設定して、スタックを取得します。
5. z ステップとして、イメージ解像度と z ステップの数値を入力します (例: 512 x 512 および 1 μm)。
6. Z シリアル イメージを収集するには、[ スタート] ボタンをクリックします。
7. 同じ領域でライブ画像を2回取得し、最初はSHG/EGFP信号収集用の880 nmの励起で、EGFP/tdTomato信号収集の940 nm励起で2番目に撮影します。
   注: 2 つのスタックの組み合わせでは、3 チャンネルイメージを提供します。画像解像度とスキャン形式のサイズはそれぞれ512 x 512ピクセルと157 μm x157 μmでした。

5. 画像処理と3D再構成

1. Z シリアル イメージをフィジー ソフトウェア¹⁸に読み込みます。
2. バックグラウンドノイズを低減するためにフィジーのプラグイン 中央値3Dフィルタ を選択します。
3. フィジーのパッケージ アンシャープマスクフィルタ を選択して、画像をシャープにします。
4. 画像の品質を自動的に最適化するには、明るさ/コントラストの[自動]をクリックします。
5. Z シリアル イメージをエクスポートできるようにイメージシーケンスとしてイメージを保存します。
6. ボリュームレンダリングを使用して3D再構築のために商用ソフトウェア(例えば、Avizo lite)にzシリアル画像をロードします。
7. すべてのMPM画像において、EGFP、tdTomato、およびSHG信号をそれぞれ擬似緑、赤、シアン色で示します。
8. スナップショットによって3D構造の画像をキャプチャします。

このライブイメージングプラットフォームを使用して、マウスの眼表面を細胞レベルで可視化することができる。眼表面の個々の単一細胞を可視化するために、細胞膜に発現する核およびtdTomatoに発現するEGFPを有する二重蛍光トランスジェニックマウスを用いた。コラーゲンが豊富な角膜間質は、SHG信号によって強調された。

角膜上皮において、表在細胞、翼細胞および基底細胞(図2)を可視化した。二重蛍光トランスジェニックマウスでは、基底層から角膜および四肢上皮の両方の表面層に単一細胞をマッピングすることができた(図2)。六角形の表在細胞を観察した(図2の白い矢印)。基底層から外層に向かう核間の間隔も核間の間隔も角膜上皮では増加した(図2)。tdTomato蛍光の細胞質シグナルは、ゴルジ装置を含む膜タンパク質が豊富な細胞内小胞系、小胞体が翼細胞に散乱したことを示した(図2)。

コラーゲン質間質の中で、星状角膜細胞は、二重蛍光トランスジェニックマウスにおける膜標的性tdTomato蛍光によって概説された(図3および図4の黄色の矢印)。コラーゲン間質に埋め込まれた角質細胞は、内皮細胞よりも緩やかに間隔を空けた。さらに、角膜間質における薄い分岐神経も、膜ターゲティングtdTomato信号(図3の白い矢印)によって可視化された。角膜内皮細胞の単層は、ハニカムパターンに連結された比較的均質な六角形の形状を示した(図4の白い矢印)。四肢上皮は上皮細胞の1~2層で構成された(図5)。二重蛍光レポータートランスジェニックマウス株はまた、我々は、結膜内の毛細血管を画像化することを可能にしました (図6A).毛細血管の3Dアーキテクチャは血管内皮を概説することによって再構築された(図6B,6C)。

図1:MPMと回転マウスホルダーの設定
(A) MPM の設定。(B)マウスホルダーのデザイン。マウスホルダーは、回転ヘッドホルダーとアイホルダーで構成されています。(C)マウスアイホルダーのデザイン。眼ホルダーは、角膜と結膜を露出させるためにプラスチックループでまぶたを引き込む。ヘッドホルダーとアイホルダーは、ステージ上で(B)をねじ込み、眼表面の正確で制御可能な回転とイメージングを可能にします。(D) 目ホルダーによる角膜イメージング用生きたマウスの写真。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:二重蛍光トランスジェニックマウスにおける角膜上皮の生画像化。
角膜上皮は、層ごとに画像化し、表在細胞、翼細胞、および基底細胞を含む。表面的なセルは白い矢印でマークされます。スケールバー= 50 μm(Z =上皮の上面からの深さ(μm))。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:角膜間質のライブイメージング。
角膜間質の中で、角質細胞(黄色の矢印)と神経線維(白い矢印頭)は、コラーゲン質素(疑似青色色)に埋め込まれた。スケールバー= 50 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:中央角膜における角膜内皮の生撮像
六角角膜内皮細胞の単層(白矢印)。スケールバー= 50 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:四肢上皮の生画像化
二重蛍光トランスジェニックマウスにおける四肢上皮の生画像は、空胞体核を示した。スケールバー= 50 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:結膜における血管網の生画像化と3次元再構成
(A)結膜間質の毛細血管を可視化した。スケールバー= 50 μm(B) 商用ソフトウェアを用いて行うキャピラリーネットワークの3D再構成スケールバー= 50 μm(C,D)パネルBに示す画像の拡大された3Dビューは、毛細血管(白と黄色の矢印)を概説した蛍光血管内皮細胞。パネルC = 6.26 μm、パネルD= 10 μmのスケールバー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。