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方法論記事

単一DNA分子からの超並列タンパク質合成のためのフェムトリットルドロップレットアレイ

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DOI：

10.3791/60945

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2020年6月20日

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1SUGAR Program, X-star, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

この記事について

サマリー

プロトコルの全体的な目標は、無細胞タンパク質合成に使用できる1cm2平面基板上に100万個以上の順序付け、均一、安定した、生体適合性のフェムトリットル液滴を準備することです。

要約

科学機器の空間分解能と検出感度の進歩により、小さな原子炉を生物・化学研究に応用することが可能です。高性能マイクロリアクターの需要に応えるため、フェムトリットル滴アレイ(FemDA)装置を開発し、その応用を超並列無細胞タンパク質合成(CFPS)反応に例示しました。2段階のオイルシールプロトコルを使用して、100万個以上の均一な液滴を指サイズの領域内で容易に生成した。すべての液滴は、親水性底部と疎水性側壁から構成されるフェムトリットル微小室に固定した。ハイブリッド親水性疎水性構造と専用のシール油および界面活性剤は、フェムトリットル水溶液を蒸発損失なしでフェムトリットル空間に安定的に保持するために極めて重要です。FemDA装置のフェムトリットル構成および簡単な構造は、最小限の試薬消費を可能にした。液滴反応器の均一な次元は、大規模な定量的および時間経過測定を説得力と信頼性を高くしました。FemDA技術は、CFPS反応のタンパク質収率を各液滴中のDNA分子の数と相関させた。装置の微細加工、フェムトリットル液滴の形成、顕微鏡画像データの取得・解析に関する手順を合理化した。最適化された低ランニングコストの詳細なプロトコルは、FemDA技術を、標準のクリーンルーム施設と従来の蛍光顕微鏡を自分の場所に持っているすべての人が利用できるようにします。

概要

研究者は、バイオ/化学反応を行うために原子炉を使用しています。作業効率を向上させながら試薬の消費量を減らすために、反応器のサイズを縮小し、実験スループットを高めるために多大な努力がなされている。どちらの側面も、重い作業負荷から研究者を解放し、コストを削減し、研究開発をスピードアップすることを目指しています。反応量とスループットの観点から原子炉技術の開発に関する明確な歴史的ロードマップを持っています: シングルビーカー/フラスコ/試験管, ミリリットルチューブ, マイクロリットルチューブ, マイクロリットル 8チューブストリップ, マイクロリットル 96/384/1536ウェルプレート, マイクロ流体ナノリットル/ピコリットル/フェムトリットル反応器71,,62,,3,,4,5, 5, 7 ,.過去数十年の半導体産業における集積回路チップ上のトランジスタの特徴サイズを縮小することに似ており、バイオ/化学マイクロリアクターは体積削減とシステム統合を経ています。このような小規模なツールは、細胞ベースまたは無細胞合成生物学、バイオマニュファクチャリング、およびハイスループットプロトタイピングとスクリーニング898、9、10、11、1210,11に大きな影響を12与えました。,この論文は、ユニークな液滴アレイ技術の開発に関する我々の最近の取り組みについて述べ、合成生物学および分子スクリーニングコミュニティ14の基礎技術であるCFPS13におけるその応用を実証する。特に、FemDAデバイスを誰もがアクセスできるように、最適化された低コストのプロトコルを意図的に提供しています。小型化された装置のための低コストで扱いやすいプロトコルは、大学の教育目的に貢献し、技術を広めるのに役立ちます。

FemDAは平面ガラス基板上の1cm2あたり106の超高密度でフェムトリットルの液滴を準備する。我々は、疎水性ポリマーCYTOP15をガラス基板上にコーティングし、あらかじめ定義された位置でCYTOPを選択的にエッチング(除去)し、基板上にマイクロチャンバアレイを生成した。これにより、得られたマイクロチャンバは、疎水性側壁(CYTOP)と親水性底部(ガラス)から構成される。パターン化された表面上に水と油を順次流させると、水を閉じ込めてマイクロチャンバーに密封することができます。親水性疎水性構造は、マイクロチャンバーの外の水を撃退し、個々のマイクロリアクターを単離し、フェムトリットル空間内の小さな水溶液を保持するために不可欠です。このユニークな性質は、油中水滴および脂質二重層マイクロコンパートメント16,17,17の調製にうまく適用された。試作装置16と比較して、まず、CYTOPポリマーの完全な除去とガラス底の完全な露出を実現するために、微細加工プロセスを最適化した。CYTOPはガラス、プラスチック、シリコーンなどの従来のマイクロリアクター材料よりも極端に低い表面張力(19 mN/m)を特色にする特殊なフルオロポリマーである。その良好な光学、電気、および化学的性能は、マイクロ,流体デバイス,18、19、20、21、22、23、24の表面処理にすでに利用されている。18,19,2021,2223,24FemDAシステムにおいて、CYTOP表面上の油の濡れ良好を達成するためには、油の表面張力は固体表面25のそれよりも低くなければならない。それ以外の場合、固体表面に接触する液体油は、表面上に広がるのではなく球状になる傾向があります。また、一般的なパーフルオロカーボンオイル(例えば、3M FC-40)16およびハイドロフル16オロエーテル油(例えば、3M Novecシリーズ)は、定量的測定に致命的であり、滴滴間の交差汚染の面で疑わしいCYTOPを溶解できることを発見した。幸いにも、我々は、低い(< 19 mN /m)表面張力を示す生体適合性および環境に優しい油を同定した。また、選択した油と機能に低濃度で溶解できる新しい界面活性剤(0.1%、以前に報告された人気のもの26、27),27よりも少なくとも10倍低い13を発見した。得られた水/油界面は界面活性剤によって安定させることができる。油の蒸発率が高いため、油とのフラッシュに続いて、マイクロチャンバーを密封する最初のものを交換するために別の生体適合性と環境に優しい油を塗布しました。第1油(アサヒクリンAE-3000 0.1重量%SURFLON S-386)を「フラッシュオイル」と呼び、第2のオイル(Fomblin Y25)をそれぞれ「シーリングオイル」と呼んでいます。

2段階のオイルシール戦略は、数分以内に、洗練された計装なしでフェムトリットルの液滴アレイの堅牢な形成を実現することができます。蒸発問題のため、ピコリットル体積28より小さいマイクロリアクターを生成することは困難と考えられている。FemDAは、マイクロリアクター/液滴の調製に使用される材料とプロセスを体系的に最適化することによって、この問題に取り組んだ。得られた液滴のいくつかの注目すべき特徴は、高い均一性(または単分散性)、安定性、およびフェムトリットルスケールでの生体適合性を含む。液滴体積の変動係数(CV)はわずか3%(顕微鏡画像の補正なし)で、世界で最も小さいCVであり、高度に平行かつ定量的な測定が保証されます。フェムトリットルの液滴は、室温で液滴間の交差汚染なしに少なくとも24時間安定しており、信頼性の高い時間経過測定に役立ちます。生体適合性に関しては、これまで困難または非効率的な29,30,30と考えられていたフェムトリットル液滴中の単一コピー鋳型DNAから様々なタンパク質を合成することに成功しました。FemDAで合成できるタンパク質が他の液滴系で合成できない理由を解明する価値があります。FemDAは単なる技術的進歩ではなく、タンパク質収率(液滴の蛍光強度に反映される)を各液滴中の鋳型DNA分子の数に相関させる、これまでにない定量的測定を実現しました。その結果、FemDAベースCFPSからの液滴の蛍光強度のヒストグラムは、等しいピークからピーク間隔のガウス分布の合計によってうまく適合することができる離散分布を示した。また、異なる数のDNA分子を含む液滴の発生確率は、ポアソン分布31に完全に適合した。これにより、各液滴における異なるタンパク質収率を、離散分布に基づいて正規化することができる。この重要な機能により、他のマイクロリアクタープラットフォームでは利用できない、見かけの強度から酵素活性情報を分離することができます。既存のマイクロ流体細胞/液滴選別システムは、全自動選別に熟練しており、サンプルを濃縮するのが得意であるが、分析的側面32、33,33において比較的広いまたは長い尾のヒストグラムしか出力できない場合もある。当社の高い定量性と生体適合性のFemDAシステムは、マイクロリアクター開発の分野で新しいベンチマークと高い分析基準を設定します。

液滴の調製に使用できる油および界面活性剤は依然として非常に限られた34である。FemDAに設立されたアサヒクリンAE-3000とSURFLON S-386の組み合わせは、水相と油相13との間の物理化学的界面の成長兵器の新しいメンバーである。FemDAの新しい界面は、物理的に安定しており、化学的に不活性であり、そして多種類のタンパク質13に対する複雑な転写、翻訳、および翻訳後修飾機械と生物学的に適合する。代わりに液滴の設定で合成できないタンパク質を見つけることはかなり魅力的であろう.また、試薬のコスト削減は、ナノリットルおよびピコリットル反応器システム35,36,のそれよりもフェムトリットル滴系においてより明らかである。特に、微小液滴発生システムではチューブや外部供給によって主に引き起こされる大きなデッドボリュームが、私たちのFemDAには存在しないことがよくあります。配列フォーマットは、動きの速い物体の単一のスナップショットだけでなく、すべての単一のリアクタ37に対して繰り返し、詳細な微視的特徴付け(いわゆる高コンテンツ分析に類似)によっても好まれる。フェムトリットルスケールは、指サイズの領域に100万基以上の原子炉を統合することを可能にしましたが、同じ数のナノリットル原子炉(存在する場合)は平方メートル面積を超える必要があり、そのようなシステムを製造または使用することは間違いなく実用的ではありません。

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プロトコル

1. フェムトリットルマイクロチャンバアレイ基板の微細加工

メモ:クリーンルームで以下の微細加工実験を行います。クリーンルームに入る前に、手袋とクリーンルームスーツを着用してください。

  1. クリーニングカバーガラス基板
    1. カバーガラスをカバーガラス染色ラックにセットします。カバーガラスを8 M水酸化ナトリウム(NaOH)で室温(RT)で15分間超音波処理します。
      注意:高濃度のNaOHは、皮膚や目に非常に危険です。スプラッシュなしで穏やかに処理します。
    2. NaOH溶液からラックを取り出し、カバーガラスを水で10回リンスします。カバーグラスを純水に入れておいてください。
      注:アルカリ廃棄物を指定タンクに廃棄します。NaOHソリューションは、元のボトルにリサイクルし、最大5回使用することができます。
    3. カバーガラスの各部分をエアブローガンで乾かします。
    4. 乾燥したカバーガラスを200°Cのホットプレートで5分間焼き、ガラス基板の上側の向きを次の取り扱いプロセス中に一貫させておきます。
  2. ガラス表面のシラナイゼーション
    1. ドライ染色ラックのクリーニングカバーガラスをリセットします。
    2. PTFEビーカーに150mLのエタノールを加えます。0.075 mL(3-アミノプロピル)トリエトキシシランを取り出し、すぐにエタノール(すなわち0.05 vol%)に注射するために1 mLシリンジを装備した針(22G x 70 mm)を使用してください。注射器を数回引っ張って押して、注射器の内側をすすきます。溶液を針でかき混ぜて均質にします。
      注:(3-アミノプロピル)トリエトキシシランは、タイトなシールで2年間室温と1気圧圧力で保存することができます。絶対エタノールは、使用後に密封する必要があります。期限切れの試薬は使用しないことをお勧めします。
    3. カバーガラスを0.05vol%アミノシラン溶液に1時間RTでインキュベートします。
    4. 純水を使用してカバーガラスを5回リンスします。カバーグラスを純水に入れておいてください。
      メモ:指定タンクに廃棄物を捨てます。
    5. カバーガラスの各部分をエアブローガンで乾かします。
    6. 乾燥したカバーガラスをすべてアルミホイルの上に置きます。ホットプレートのカバーガラスを80°Cで5分間焼きます。
  3. スピンコーティングCYTOPパーフルオロポリマー
    1. スピンコートのカスタマイズされた真空チャックにカバーガラスを置きます(図1A)。真空スイッチをオンにして、ガラス基板を固定します。
      注:真空チャックの設計は、長方形(24mm×32mm)および薄い(0.13-0.17mm)基板(図1A)上の粘性ポリマーの均一なコーティングのために重要です。真空チャネルに接続する複数の穴(48ホール、直径1mm)を備えた長方形のサンプルステージは、中央の穴が1つあるラウンドステージよりもうまく機能することがわかりました。
    2. ガラス基板の中央にA型CYTOPポリマーの70-90 μLをドロップします。直ちにポリマーをスピンコートする(図1B)。
      メモ:スピンコーティング条件(3,400 rpm、30 s)は3μmの厚さを提供します。粘性液体用に設計されたマイクロピペットを使用してください。マイクロピペットを直立に持ち、ポリマーが基板にほぼ完全に円を落とすようにします。プランジャーが下方に移動すると、気泡がピペットチップの内側に発生することがよくあります。気泡とCYTOPの最後の一滴をドロップしないでください。
    3. ガラス基板の角を保持する指でコーティングされたガラスを拾い、アルミホイルの上に置きます。
    4. ステップ 1.3.1~1.3.3 を繰り返して、カバーガラスの残り部分をすべてスピンコートします。
    5. コーティングされたガラスを80°Cで30分間焼き、200°Cで1時間焼きます。
      注:この処理はCYTOPを完全に治し、CYTOPをガラス表面に共有結合します。必要に応じて、長時間のベーキングプロセス中に潜在的なほこりを避けるために、アルミ箔で作られた蓋でベーキングエリアを覆います。
    6. CYTOPコーティングされたカバーガラスをホットプレートから取り出し、RTに冷却します。不均一なコーティングを示す基材を廃棄します。
      注:きれいにコーティングされたCYTOPの表面は、不規則な虹のようなパターンなしで平らに見えるはずです(図1C)。適切な角度からの目視検査は、平面性とコーティング品質を迅速に判断することができます。プロトコルはここで一時停止することができます。
  4. スピンコーティングフォトレジスト
    1. スピンコーターの真空チャック(ステップ1.3.1を参照)にCYTOPコーティングされたカバーガラスを置きます。真空スイッチをオンにしてカバーガラスを固定します。
    2. 基板の中央にフォトレジストの0.2〜0.3mLをドロップします。60sの場合は、フォトレジストを6,000rpmで直ちにスピンコートします。
      注:気泡でフォトレジストの最後の一滴を落とさないで下さいます。スピンコーターがより高いスピン速度をサポートする場合、スピン速度は7,500 rpmまでであり、より薄いコーティングを達成することができます。CYTOPの低い表面エネルギーは、フォトレジストのほとんどがその表面に付着するのを防ぎます。AZ P4903フォトレジストが利用できない場合、AZ P4620フォトレジストは良い代替手段です。
    3. 基板の角を保持する2本の指でコーティングされた基板を拾います。エタノールを浸したクリーンワイパーを使用して、基板エッジ(しばしばエッジビーズ除去またはEBRと呼ばれる)の近くで余分なフォトレジストを拭き取ります(図1D)。アルミニウム箔の上に基板を置きます。
      注: EBR にはアセトンをお勧めしません。
    4. ステップ 1.4.1-1.4.3 を繰り返して、CYTOPコーティングされたカバーガラスの残りの部分に対してフォトレジストをスピンコートします。コーティングされたガラスのすべての部分をピックアップし、それが適切にコーティングされているかどうかを確認するためにそれを検査します。
      注:きれいにコーティングされたフォトレジストの表面は、不規則なパターンなしで平らに見えるはずです(図1D)。適切な角度からの目視検査は、平面性とコーティング品質を迅速に判断することができます。不均一なコーティングを示す基質は、アセトン、2-プロパノール、およびH2Oを順次洗浄することによりリサイクルし、再利用することができる。
    5. コーティングされた基板をホットプレートで5分間110°Cで焼きます。
    6. ホットプレートからコーティングされた基板を取り外し、RTに冷却します。フォトレジストの水分補給のために40%~60%の相対湿度で30分間放置します。
      注:H2Oは、次の光化学反応のために必要です。焼き付けたフォトレジストはフォトレジスト内部のH2O含有量を失った。水分補給プロセスはH2Oが空気から吸収されることを可能にする。相対湿度が20%以上、80%を超える相対湿度は、水分補給プロセスには適していません。
  5. フォトリソグラフィ
    1. 水分補給の待ち時間(ステップ1.4.6を参照)の間に、マスクアライナーを起動します。光源を温める。クロムフォトマスクをロードします。
      メモ:取扱説明書に従ってマスクアライナーを操作します。EB施設が利用可能であれば、フォトマスクは電子線(EB)リソグラフィを介して製造することができる。また、フォトマスクは現地の会社に外注することができます。
    2. 水分補給された基板(ステップ1.4.6を終えた後)をチャックに積み込みます(図1E)。
    3. 露出パラメータを設定します。真空接触モードで13 mW/cm2(hライン)のUV強度2で25sの基板を露出させます。次に、基板を取り外し、カバーガラス染色ラック(ステップ1.1.1で使用したのと同じラック)にセットします。
    4. ステップ 1.5.2 ~ 1.5.3 を繰り返して、水分補給された基板の残りの部分を露出させます。
  6. 開発
    1. 露出したフォトレジストを溶解するために5分間の基板を開発する(図1F)。その間、4分の時点で一度、開発者のラックを軽く振ります。
      注: 開発者は AZ 300 MIF でした。代替アルカリ性の開発者(例えば、AZ 400 K)は、一般的に開発に適用可能であるが、開発条件(例えば、時間、温度、攪拌)の最適化を必要とするべきである。現像容器としてガラスビーカーを使用しないでください。
    2. 純水を使用して基板を10回リンスします。カバーグラスを純水に入れておいてください。
      メモ:指定されたタンクに開発者を捨てます。
    3. 空気吹銃で基板の全ての部分を徹底的に乾燥させます。
  7. 反応性イオンエッチング
    1. 乾燥した基板(ステップ1.6.3から)を反応イオンエッチング(RIE)機の反応室に設置します。
      メモ: 施設のメンテナンスルールに従って、RIEマシンは常にオンになるか、または毎回シャットダウンすることができます。スイッチがオフの場合は、マニュアルに従ってスイッチをオンにします。
    2. O2プラズマを用いてフォトレジストを発見したCYTOPをエッチングする(図1G)。
      注:RIE条件は以下の通りでした。O2ガス流量:50 sccm;チャンバー圧力: 10.0 Pa;RF電力:50 W;エッチング時間:27分エッチング時間はCYTOPの3μmの厚さを完全にエッチングするために最適化されました。
    3. 反応室からあらゆる基板を取り出し、カバーガラス染色ラックに置きます。
      注:施設のメンテナンスルールに従って、反応室は、実行のたびに反応室を清潔に保つために短いO2プラズマ洗浄プロセス(例えば、エッチング時間:5分)を必要とすることがあります。
  8. フォトレジストの除去とクリーニング
    1. 残りのフォトレジストを溶解するためにRTで5分間アセトンで基板を超音波処理します。
    2. RTで5分間2-プロパノールで基板を超音波処理します。
    3. 純水を使用して基板を5回リンスします。RTで5分間基板を超音波処理し、さらに5回純水を使用してサンプルをリンスします。基板を純水に入れておいてください。
    4. エアブローガンで基板の全ての部分を乾かします(図1H)。
      注:基板はプラスチックペトリ皿に保管することができます。作製された基質は、少なくとも1年間はRTで構造的に安定である。プロトコルはここで一時停止することができます。
    5. 3次元(3D)レーザー走査共焦点顕微鏡、白色光干渉法(またはコヘレンス走査干渉法)、または走査電子顕微鏡による、調製された基板の表面プロファイルを特徴付ける。それぞれのソフトウェアを使用して、得られたマイクロチャンバの直径と深さを測定します。
      注:サンプルは非接触および非破壊的な3Dレーザー走査の共焦点顕微鏡または白色光干渉計との特性評価の後の他の実験のために再利用することができる。プロトコルはここで一時停止することができます。

2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルの調製

注意:PDMSを扱うためにラテックス手袋を着用しないでください。代わりに、ポリエチレン(PE)手袋を着用してください。

  1. マイクロチャネルマスターの作成
    1. ダブルコートされた接着剤カプトンフィルムテープをデスクトップカッターを使用して、定義された(3 mm x 19 mm)マイクロチャネル形状に切り取ります。
      注:カプトンテープは7602#25(寺岡製作所)で、チャンネル高さ135μmでした。STIKAデスクトップカッターは、Adobe Illustrator ファイルの図面に従って切断を実行するために、Adobe Illustrator のプラグイン (ローランドの web サイトから入手可能: https://www.rolanddga.com) を使用します。プロトコルはここで一時停止することができます。
    2. ペトリ皿の平らな底にすべてのカットカプトンテープを貼ります。標準的な90のmmのペトリ皿はテープの12個を収容できる。
      注: レリーフ構造は、PDMS のレプリカ成形のマスターとして機能します。テープとペトリ皿の基板の間に挟まれた気泡がある場合は、テープ表面をトゥイザーで軽く押します。あるいは、古典的なソフトリソグラフィを適用して、シリコンウエハ38上にマスターを準備することができる。プロトコルはここで一時停止することができます。
  2. テープパターンペトリ皿のPDMS樹脂を硬化させる
    1. 新しいPE手袋を着用し、SYLGARD 184シリコーンエラストマーの硬化剤の2.5 gを、使い捨てのプラスチックピペットを使用して指定されたプラスチックビーカーに移す(図2A)。
    2. 新しい手袋に交換し、上記のプラスチックビーカーに使い捨て50 mLの注射器を使用してSYLGARD 184シリコーンエラストマーのプレポリマーベースの25 gを移す。
      注:ここで手袋を交換して、硬化剤がベースに交差する可能性を防ぎます。
    3. 脱気ミキサーを使用して混合物を混合して脱気します(プログラム:3分混合後2分脱気)。
      注:脱気ミキサーが利用できない場合は、手動で攪拌(約15分間)混合物を真空チャンバーで脱気することができます。
    4. PDMS混合物をテープパターンのペトリ皿に注ぎます(図2B)。ペトリ皿をミニ真空チャンバーにセットし、PDMS混合物を1〜3時間脱気する(図2C)。
      注:1時間後にPDMS混合物に空気が残っている場合は、真空チャンバーからペトリ皿を取り出し、空気送風機を使用して気泡を壊し、ペトリ皿を真空チャンバーに戻して、脱気プロセスを継続します。
    5. ペトリ皿を一晩60°Cのオーブンに入れ、PDMSを治す(図2D)。
      注:温度を上げると硬化時間が短くなりますが、物理的な変形なしにポリスチレンペトリ皿で許容できる最高温度は約60°Cです。
  3. PDMSチャネルのレプリカ成形
    1. ペトリ皿から硬化したPDMSエラストマーを剥がします(図2E)。
    2. フラットケーブルカッターを使用して、PDMSチャンネルブロックの全ての部分を切り落とします(図2F)。
    3. PDMSエラストマーを、チャネル側に向いたカッティングマットの上に置きます。バイオプシーパンチを使用してチャネルの両端に穴を開けます(図2G)。
    4. スコッチテープでPDMSチャンネルの表面を清掃します。その後、使用前にきれいに保つためにスコッチテープの別の部分にPDMS樹脂を包みます。準備したPDMSチャンネルをきれいなペトリ皿に保管してください。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。

3. フェムトリットルマイクロチャンバアレイ装置の組み立て

  1. ペトリ皿の内側の壁に沿って水浸しのきれいなワイパーを置き、簡単な加湿室を作ります。スコッチテープで覆われたPDMS樹脂を加湿室に入れ、パラフィンフィルムを使用してチャンバーを密封します。少なくとも3時間インキュベートするが、1日以下。
    注:PDMSは、ガスが樹脂39を通過することを可能にする多孔質材料です。PDMSの多孔質構造は、平衡に達するまで周囲からの水分子の吸収につながります。この前処理は、PDMSの細孔を水蒸気で満たし、PDMSチャネルの端に隣接する水滴の蒸発を大幅に抑制することができます。
  2. PDMS樹脂からスコッチテープを取り出します。PDMSチャネルを基板のマイクロチャンバアレイ領域に配置する(図2H)。
    注:PDMS樹脂は、CYTOP表面に可逆的に接着します。PDMS ブロックをトゥイザーで軽く押して、PDMS 樹脂と基板の間にある気泡があれば、気泡を取り除きます。
  3. PDMSチャンネルの穴の1つ(出口として)200 μLの非濾過ピペットチップを挿入します。
    注:PDMSとCYTOPの間の接着強度は限られています。PDMS樹脂の物理的変形やPDMSチャンネルの剥離を表面から避けるため、ピペットチップを深く挿入しないでください。

4. 組み立てられた装置への負荷反応溶液

  1. 氷の上にアルミニウムマイクロチューブスタンドを置きます。アルミスタンドの1.5 mLマイクロチューブにフラッシュオイル(ASAHIKLIN AE-3000オイルと0.1重量%SURFLON S-386界面活性剤を混合)プレチルしてください。
  2. 氷の上に別のアルミニウムブロックを置きます。
  3. CFPS反応液の調製
    1. PCRチューブにCFPS反応液を用意します。CFPSキットのアリコート成分、希釈された鋳型DNA(蛍光タンパク質mNeonGreen40およびエシェリヒア・コリアルカリホスファターゼ41)溶液、および特定のニーズに応じたその他の必要成分(例えば、RNase阻害剤、蛍光原性基質、シャペロン)を混合する。
      注:CFPSに使用するテンプレートDNAは、対応するCFPSキットの指示に従って準備する必要があります。このデモでは、T7 ベースの式システム42を適用しました。FemDAデバイスの試薬消費量は非常に少ないので、10 μLはPDMSチャネル全体を満たすのに十分な大きさです。
    2. mNeonGreen蛍光タンパク質合成の場合、次の順序で成分を混合する:溶液Aの6 μLアリコートに2.7 μLのヌクレアーゼを含まないH2Oを加える(CFPSキットから)。RNase阻害剤の0.3 μLを追加します。希釈されたテンプレートDNA溶液の1.5 μLを追加します。混合物を簡単に混合し、溶液Bの4.5 μLアリコート(CFPSキットから)に移します。
      メモ:総体積は15μLです。すべてのアリコートの量は最終的な混合物の総体積に比例するため、総体積が10μL未満の場合、成分アリコートの体積(<0.2μL)が非常に小さすぎることがあります。
    3. アルカリホスファターゼ合成の場合、以下の順序で成分を混合する: 1.2 μLのH2Oから6 μLの溶液Aを加える。RNase阻害剤の0.3 μLを追加します。0.6 μL の二硫化結合エンハンサー 1 および 2 (キットから) を加えます。5 mM 6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸(DiFMUP)の0.3 μLを加える;1.5 μL の DNA 溶液を追加します。混合物を4.5μLの溶液Bに簡単に混合して移す。
      注:アルカリホスファターゼのアッセイでは、フッ素化基質DiFMUPは、末端リン酸基の酵素的切断時に高い蛍光6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン(DiFMU)を生成することができます。
  4. 200 μLの非濾過ピペットチップを使用して、10 μLの混合物を作成します。PDMS チャンネルの入口穴(ステップ 3.3 を参照)にピペットチップを挿入します。プランジャーを押し下げて、流出口からオーバーフローするまで(ステップ3.3で別のピペットチップが挿入されている)まで、ソリューションをチャネルに注入します。
  5. ピペットチップからピペットを分離し、これらの2つのピペットチップを入口と出口に挿入したままにします。
    注:ピペット処理中に気泡が発生しないようにしてください。PDMSチャネル内の溶液の逆流を防ぐためにピペットチップからピペットを分離するまで、プランジャーから親指を離さないようにしてください。

5. CFPS用フェムトリットル滴アレイ(FemDA)の生成

  1. 組み立てた装置のセット全体を、冷やされたアルミニウムブロックに移します(ステップ4.2を参照)。微小室内アレイ領域が、半透明(図2I)から透明に素早く変わることを注意深く確認する(図2J)。
    注:CFPS反応溶液はマイクロチャンバにまっすぐに入ることができません。水中の空気の溶解度は温度に反比例する。トラップされた空気は、デバイスがRTから低温に移動した後、溶液に溶解します。透明性の変化は、溶液がマイクロチャンバに入るかどうかを判断する便利な視覚的指標です。
  2. 冷蔵フラッシュオイルの30 μL(ステップ4.1参照)を引き出し、すぐに上開口部から入口挿入ピペットチップにオイルを移します。フラッシュオイルはチャネルに移動し、マイクロチャンバの外側にある過剰な反応溶液を押し出します。すべてのマイクロチャンバーは、フラッシュオイルによって分離されます。
    注:反応溶液とフラッシュオイルの間の移動インタフェースが目に見えるように、人々はチャネル内の流体の動きを観察するのに役立ちます。押出された溶液は、前のチューブに集め、4°Cで保存し、別のFemDAデバイスまたは平行バルク反応(マイクロチューブまたはマイクロタイタープレート)のために再利用することができます。
  3. 30 μLのシーリングオイル(Fomblin Y25)を200 μLの濾過ピペットチップにプリドローします。ピペットを直立した場所に掛けます。
  4. 同時に、挿入された2つのピペットチップ(ステップ3.3と4.4を参照)をデバイスから取り外します。すぐにデバイスをアルミニウムブロックからパラフィルムに移動します。
    注:ピペットチップを取り外す期間中に、アルミニウムブロック上のデバイスを固定する(ただし、チャネル領域から離す)トゥイーンを使用してください。
  5. すぐに、シーリングオイルを含むピペットチップ(ステップ5.3を参照)をPDMSチャネルの入口に挿入し、出口から溢れるまでオイルをチャネルに注入します。
    メモ:デバイスをRTに移動するとすぐにこの手順を実行します。チャネル内の逆流を防ぐために、シール油が出口からあふれるまで、プランジャから親指を残さないようにしてください。流出口から流れ出た直後にフラッシュオイルが蒸発し、蒸発損失が極めて少ないため、次のシール油が出口に蓄積します。
  6. ピペットチップからピペットを分離し、デバイスからピペットチップを取り外します。クリーンワイパーを使用してPDMS表面を洗浄し、それぞれ入口と出口にシール油の新しい滴を適用します。フェムトリットル液滴は、個々のマイクロチャンバーに油によって密封される。
    注:マイクロピペットチップを取り外す期間中に基板上のPDMSチャンネルを固定する(ただし、チャネル領域から離す)トゥイーンを使用してください。
  7. カバーガラスの下面に溜まった水分を拭きます。準備済みの FemDA デバイスは、インキュベーションおよび顕微鏡イメージングの準備が整いました。

6. 顕微鏡イメージング

  1. 反転蛍光顕微鏡を起動します。カメラの安定化(冷却)を待ちます。60xまたは100x油浸し対物レンズを使用してください。FemDAデバイスを電動ステージにセットします。イメージング パラメータを設定します。
    注: イメージング パラメータには、ファイル パス、イメージング チャネル、フィルタ、露光時間(一般的に 100 ミリ秒で十分です。カメラの仕様に応じて短い時間または長い時間も可能)、および光強度が含まれます。
  2. 焦点面を見つけます。対物レンズの Z 軸の位置を調整し、内部オートフォーカス システムを使用して焦点面を固定します。対象領域 (ROI; つまり、x、y 軸) を設定します。
    注:主要な顕微鏡メーカー(ニコン、オリンパス、ツァイス、ライカ)はすべて、顕微鏡とオートフォーカスシステムを統合するためのオプションを提供します。この自動焦点システムは、自動多領域イメージング中に焦点面を一定に保つために必要です。ROI は PDMS チャネルの FemDA エリアをカバーします。
  3. 蛍光画像をキャプチャします。すべての ROI に対して、焦点が焦点を合わせなっていない明視野(BF)画像の単一フレームをキャプチャします。異なるチャンネルをイメージングする際に、ROIの順序と座標を変更しないでください。

7. 画像データ解析

注:フィジー(http://fiji.sc)に基づいて自家製プラグイン(「FemDA」という名前)を使用して画像データを分析し、各液滴43の蛍光強度を抽出します。オペレーティング システムに応じて、正しいバージョンのフィジーをインストールします。フィジーは、ビルドインプラグイン「バイオフォーマット」を使用して、ほとんどの画像ファイル形式(ニコン顕微鏡のnd2ファイル、ツァイス顕微鏡からのcziファイルなど)をサポートしています。

  1. プラグインのインストール
    1. プラグインファイル(対応する著者への問い合わせ時または以下の機関リンクを介して利用可能です:https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ)をコピーして、フィジーの「プラグイン」フォルダに貼り付けます。
    2. フィジーソフトウェアを起動します。プラグイン 「FemDA」は、フィジーのドロップダウンメニュー「プラグイン」にあります。
  2. 画像データ前処理
    1. 焦点が合っていない BF イメージを開きます(ステップ 6.3 を参照)。[プロセス] をクリックして 、背景を減算します。をクリックして、画像データの各フレームの連続した連続した背景を滑らかに削除します (図 4B)。[プロセス] をクリックして 、フィルタ |画像データの各フレームのノイズを低減する中央値(図4C)。
    2. [イメージ |調整 |画像データの各フレームの背景(マイクロチャンバの外側の領域を示す)から前景(マイクロチャンバーを示す)をチェックして分離するしきい値(図4A-Cの拡大挿入)。
      注: [しきい値]ウィンドウのドロップダウン リストから適切なアルゴリズムを選択して、マイクロチャンバー領域とすべてのマイクロチェンバーのエッジのみを前景として識別し、ハイライト表示できるようにします。特に、ハイライトされたエッジのほとんどは、ギャップのない連続する必要があります。
  3. 液滴座標決定
    1. プラグインをクリックして |フェムダ |FemDA分析は、カスタマイズされたプラグインのグラフィックユーザーインターフェース(GUI)を開く(図4Dの上半分)。
    2. 1つのマイクロチャンバーのピクセルのおよその最小および最大の数を入力します。マイクロチャンバの予想される最小および最大の円形(0:任意の形状、1:完全な円)を入力します。開始フレームと終了フレームのフレーム番号を入力します。
    3. GUI で[ROIを生成] をクリックしてすべてのマイクロチャンバを検出すると、正常に検出された ROI がポップアップ ウィンドウROITableに表示されます。
    4. ウィンドウFemDA 分析に戻り、ボタンの[ROI マスクの適用]ボタンをクリックして、フレーム上のマイクロチャンバーが正しく検出されているかどうかを確認します (図 4Dの左下)。[なし] が表示されていない場合は、一部を変更し、[ROI の生成] と[ROI マスクの適用] を繰り返します。はいの場合は、次の手順に進みます。
      注: 前景と背景のコントラストが不十分なため、しきい値のアルゴリズムによって ROI (図 4Dの下半分を参照) として識別できないマイクロチャンバが非常に少ない場合があります。統計的な観点からは問題ありません。
  4. 蛍光強度抽出
    1. 蛍光画像を開き、前面に持って行きます。もう一度[ROI マスクを適用]をクリックして、決定した ROI を蛍光画像(図 4Dの右下)に適用します。
    2. ポイント画像を分析するワンショット(mNeonGreenデータで例示)またはタイムコースデータを分析するためのタイムラプス(アルカリホスファターゼデータで例示)のいずれかを選択します。
    3. [上のピクセル数]ボックスに入力100を入力すると、各 ROI の上位 100 ピクセルのみが、対応する液滴の平均強度の計算に使用されます。「上のピクセル数」に0を入力すると、各 ROI のすべてのピクセルが、対応する液滴の平均強度を計算するために使用されます。
      注: BF と蛍光画像の間に数ピクセルのドリフトが存在する場合があり、これは ROI 内の一部のピクセルが蛍光画像の背景に属している可能性があることを意味します。したがって、プラグインは、各液滴の平均強度の計算のためのトップの強度ランク付けピクセルの数を指定するオプションを提供します。
    4. 終点画像の解析(つまり、ステップ 7.4.2 でワンショットを選択)、ボタン測定強度をクリックして、検出されたすべての液滴の平均強度を計算します。ROITableは蛍光画像からの新しいデータで更新されます。一方、ヒストグラムは新しいポップアップ ウィンドウのヒストグラムに表示されます (図 4E)。
      注: [ビン番号]ボックスでビンサイズを変更すると、ヒストグラムの表示を最適化できます。ガウス分布の和に合わせると、開発された GUI で実現できます。フィジーのポップアップログウィンドウにはフィッティング結果が表示されます。あるいは、ボタンをクリックしてデータをエクスポートし、テキストとして保存し、他のソフトウェアでさまざまな統計分析を実行します(図4F、G)。
    5. 時間経過画像の解析 (つまり、ステップ 7.4.2でタイムラプスを選択) の場合、ポップアップウィンドウはヒストグラムではなく強度時間コースで、特定の時間ポイントと時間強度プロットに対応するヒストグラムが含まれています (図 5)。テキストデータは、ポップアップウィンドウの[ファイル]メニューを使用してエクスポートすることもできます。

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結果

マイクロファブリケーションプロセスは、基板洗浄、表面機能化、CYTOPコーティング、フォトリソグラフィ、ドライエッチング、フォトレジストストリッピング、最終洗浄から構成されています。重要なことに、提示されたプロトコルは、マイクロチャンバの内部の疎水性CYTOPポリマーを完全に除去することを可能にした図3A)、標準的なカバーガラス基板上に高度に平行な親水性疎水性構造を作製した。オイルシールプロトコルの助けを借りて、得られた液滴の均一な次元をマイクロチャンバに蛍光溶液を封入することによって検証した(図3B)。開発されたソフトウェアを用いて抽出された蛍光強度は、液滴サイズの良好な指標である。蛍光強度のCVは、3%、配列全体にわたる液滴サイズの狭い分布を反映した(図3C)。共焦点顕微鏡からの再構成された3D画像はまた、時間の経過とともに一貫した液滴体積を示した(図3D、補足ムービー1)44。<...

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ディスカッション

FemDAの高い均一で安定した生体適合性の液滴に基づく定量的な測定は、離散分布を可能にし、我々の研究のユニークな特徴は他のものとは異なる。本論文では、微細加工と液滴形成プロセスを体系的に最適化し、詳細に説明した。確立されたプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。

まず、矩形薄ガラス基板上に高粘性CYTOPポリマーの均一なコーティングが得られる基板の品質を大きく決定する。高い倍率を持つ対物レンズの一般的に短い作動距離(ステップ6.1を参照)を考えると、薄いカバーガラスを使用する必要があります。薄くて柔軟な基材上の高品質のスピンコーティングは、一般的に難しいです。私たちはまだすべての可能な設計をテストしていませんが、同じ長方形の次元を持つマルチホール真空チャックがスピンコーティングにうまく機能したことを発見しました。カバーガラス基板の中心にCYTOPポリマーをドロップし、すぐにスピンコーティングを開始することが重要です(ステップ1.3.2を参照)。難易度は、基板の形状にはあまり関係がないが、ポリマーの粘度である。CYTOP製品ラインは、市販のパッケージのいくつかの異なる濃度を提...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、JSPSKAKENHI助成番号JP18K14260と海洋研究開発機構の予算によって支援されました。作者化設備を提供してくださった出口茂(JAMSTEC)と久田哲郎(JAMSTEC)に感謝します。高井健(JAMSTEC)の商用ソフトウェアサポートに感謝します。東京大学武田戦館スーパークリーンルームにて、文部科学省(MEXT)の「ナノテクノロジープラットフォームプログラム」に支えられ、グラント番号JPMXP09F19UT0087を実施しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(3-アミノプロピル)トリエトキシシランSigma-Aldrich440140
1 mL シリンジテルモSS-01T
2-プロパノール関東化学EL グレードEL: 電子使用用。
3Dレーザー走査型共焦点顕微鏡レーザーテック・オプテリックス ハイブリッド他の類似顕微鏡(キーエンスVK-X1000、オリンパスLEXT OLS5000など)も適用可能です。
50mLシリンジテルモSS-50LZ
6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸サーモフィッシャーサイエンティフィックD6567ジメチルスルホキシドに5mMの原液を調製
アセトン関東化学ELグレードELグレード EL:電子使用用
純度99.8%。
送風機宝山Z-263
アルミブロックBIO-BIKAB-24M-02
アルミマイクロチューブスタンドBIO-BIKAB-136C
ASAHIKLIN AE-3000AGC(試験体)AGCにお問い合わせいただければ、無料の試験サンプルをご用意しております。
BEMCOT PS-2 ワイパー小津028208
プランジャー付きバイオプシーパンチ改BPP-10F
カバーガラス松波ガラスNo.1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness)サイズカスタマイズ。
カバーガラスステンラック中山803-131-11
クレシア テクノワイプ クリーンワイパー日本製紙 クレシアC100-M
カッティングマットGEヘルスケアWB100020
CYTOPAGCCTL-816AP
脱気ミキサーThinkyAR-100
卓上カッターローランドSTIKA SV-8
開発者AZ Electronic MaterialsAZ 300 MIFAZ Electronic Materials は Merck.
他のアルカリ開発者も適用できる可能性がありますが、開発条件 (時間、温度など) の最適化が必要です。
両面粘着 カプトンフィルムテープ寺岡製作所7602 #25
エタノール関東化学ELグレードEL用:電子用.
純度99.5%
フィジーバージョン:ImageJ 1.51n
フラットケーブルカッターTokyo-IDEALMT-0100
FomblinオイルソルベイY25、またはY25 / 6無料テストサンプルは、ソルベイへのお問い合わせに応じて利用できる場合があります。Fomblin Y25/6は、Y25がすぐに利用できない場合の代替手段です。
ホットプレートAS ONETH-900
インジェクションニードルテルモNN-2270C22G × 70mm
倒立蛍光顕微鏡ニコンエクリプス Ti-E落射蛍光仕様、CCDまたはsCMOSカメラ、電動ステージ、オートフォーカスシステム、高NA対物レンズが必要です。
KaleidaGraphSynergyバージョン: 4.5
マスクアライナーSUSSMA-6真空接触モードが利用可能である限り、他のマスクアライナーも適用可能です。
MICROMANピペットGILSONE M250Eキャピラリーピストンチップ:CP250
Microsoft ExcelMicrosoftバージョン:16.16.15
ミニ真空チャンバーを1つとしてMVP-100MV
ヌクレアーゼフリー水NIPPON GENE316-90101
ParafilmAmcorPM-996
PCRチューブNIPPON GeneticsFG-021D/SP
ペトリ皿AS ONEGD90-15直径90mm、高さ15mm。
フォトレジストAZ エレクトロニックマテリアルAZ P4903AZ エレクトロニックマテリアルズは、メルクに買収されました。AZ P4620 は代替手段です。
プレートリーダーBioTekPOWERSCAN HT
ポリエチレン手袋AS ONE6-896-02商品名:Saniment。
PURExpress in vitroタンパク質合成キットNew England BiolabsE6800S or E6800L無細胞タンパク質合成反応用。
反応性イオンエッチングシステムSamcoRIE-10NR他のRIEシステムも適用可能ですが、RIE条件(ガス流量、チャンバー圧力、RF電力、エッチング時間など)の最適化が必要です。
RNase阻害剤New England BiolabsM0314S
スコッチテープ3M810-1-18D
水酸化ナトリウム溶液富士フイルム和光純薬194-095758 M濃度; 危険。
スピンコーター押金SC-308
サーフロン S-386 界面活性剤AGC(試験体)AGCにお問い合わせいただければ、無料の試験サンプルをご用意しております。
SYLGARD 184シリコーンエラストマーダウSylgard184化学組成:ポリジメチルシロキサン。デフォルトの混合比は、塩基:硬化剤=10:1(m/m)です。
ピンセットIdeal-tek2WF。SA.1
2A
超音波洗浄機ONEASU-2M
真空チャック押金(カスタマイズ)材質:デルリン、複数の穴(48穴、各直径1mm)の長方形サンプルステージ、カバーガラスのサイズに合わせてサイズをカスタマイズ(24mm以上、32mm)。
ズ AS

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