多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

サマリー

ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

要約

定位外科は現代の神経科学研究室で不可欠なツールです。しかし、到達困難な脳領域を正確かつ正確に標的にする能力は、特に正中線に沿って脳構造を標的とする場合には依然として課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状脳および第3心室の回避と、選択的および離散的な脳核を一貫して標的とする能力が含まれる。さらに、より高度な神経科学技術(例えば、光遺伝学、光測定、2光子イメージング)は、脳への重要なハードウェアの標的移植に依存しており、空間的な制限は一般的な障害である。ここで提示される、角度付きコロナアプローチを用いたげっ歯類の脳構造の定位的な標的化のための変更可能なプロトコルである。1)マウスまたはラットモデル、2)様々な神経科学技術、および3)複数の脳領域に適応することができる。代表的な例として、光遺伝学的阻害実験に対するマウス視床下部心室核(VMN)の標的化に関する定位座標の計算が含まれる。この手順は、光感受性クロリドチャネル(SwiChR++)をクレ依存的なマウスモデルにコードするアデノ関連ウイルス(AAV)の二国間マイクロインジェクションから始まり、続いて光ファイバーカニューレの斜めの両側移植が行われます。このアプローチを用いて、インシュリン誘発低血糖に対するグルコース対調節応答に対するVMNニューロンのサブセットの活性化が必要であることを示す。

概要

行動、摂食、代謝の神経制御は、高度に複雑で統合的で冗長な神経回路の調整を伴う。神経科学分野の駆動目標は、神経回路構造と機能の関係を解剖することです。古典的な神経科学ツール(すなわち、病変、局所薬理注射、および電気刺激)は、行動および代謝を制御する特定の脳領域の役割に関する重要な知識を発見しているが、これらのツールは特異性および可逆性の欠如によって制限される^。

近年の神経科学分野の進歩により、高い時空間分解能を持つ細胞型特異的な方法で回路機能を問い合わせて操作する能力が大幅に向上しています。例えば、光遺伝学² および化学遺伝学^的3 アプローチは、自由に動く動物の遺伝的に定義された細胞タイプにおける活動の迅速かつ可逆的な操作を可能にする。光遺伝学は、神経活動を制御するために、光感受性イオンチャネル、いわゆるチャネルロドプシンの使用を含む。この技術の鍵は、オプシンを活性化するチャネルロドプシンおよび光源の遺伝子送達である。遺伝子導入の一般的な戦略は、1)離散ニューロンでCre-recombinaseを発現する遺伝子操作マウスと、2)チャネルロドプシンをコードするCre依存性ウイルスベクターの組み合わせによるものである。

光遺伝学は、神経活動を制御するためのエレガントで非常に正確な手段を提供するが、この方法は、定義された脳領域へのウイルスベクターおよび光ファイバー配置の正常な立体的マイクロインジェクションに依存する。立体的な手順は現代の神経科学研究室では一般的であるが(そして、この手順を記述するいくつかの優れたプロトコルがある)4、5、6、中線に沿って一貫して再現的に離散的な脳領域を標的にすることができる(すなわち、心座視下部、恒常性機能の調節に不可欠な脳領域⁷⁾は、追加の課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状の座頭座、第3心室、および隣接する視床下部核の回避が含まれる。さらに、阻害研究に必要なハードウェアの二国間注入には有意な空間的制限がある。これらの課題を念頭に置いて、本明細書では、このプロトコルは、角度付きの定位的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための変更可能な手順を提示する。

プロトコル

すべての手順は、国立衛生研究所、動物のケアと使用のためのガイドに従って承認され、ワシントン大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)と環境安全衛生の両方によって承認されました。

1. 角度付き座標の計算

1. コロナ脳アトラスを使用して、斜辺が対象のターゲット領域を通過するように直角三角形をマークします。代表例(図1)では、視床下部心室核(VMN)は、コロナ中線から15°の角度で標的化されています。
   注: 図 1 に示されている回転軸の位置 (つまり、側面 C の長さ) は任意であり、任意の脳領域を対象とするように変更できます。これは直感に反しているように見えるかもしれませんが、プロトコルの後のステップでは、この点が回転の定位中心に合うように z 軸の頭部の位置を調整します (セクション 6 を参照)。ただし、ヘッドホルダー装置の物理的な制約により、コロナ回転角度15°を超えないようにすることをお勧めします。
2. 必要な角度(a)と辺Bの推定長さを設定し、三角法を使用して側面AとCの長さを計算します。このステップは、回転中にヘッドを適切に配置するために重要です。
   注: 図 1の例では、アトラスグリッド線を使用して側面 B の長さを近似し、長さが 7.576 mm になります。この情報は、辺 A の長さを計算するために使用されます。
   
   この例では、2.03 mm は、頭が 15 度回転したときに光ファイバーカニューレが脳に入る正線からの R/L 距離を示しています。
   1. 必要に応じて、D/V 座標を近似するために、側面 C の長さを計算します。
      
      注: 1) 斜辺の長さ (C) は射出深度を表しませんが、D/V 座標を決定するのに役立ちます。したがって、D/V 座標を最適化するためにテストインジェクションを実行することをお勧めします。2) VMNを対象としたこの例では、角度のないマイクロインジェクション(A/ P = -1.4、R/L = 0.4 0°、D/V = -5.7)の2つの座標と、角度付き光ファイバー移植用(A/P = -1.4、R/L = 0.0、15°、D/V-5.4)の2つの座標が得られます。

2. 角度付き手順のためのステレオタックスの準備

1. 定位フレームとマイクロマニピュレータがキャリブレーションされていることを確認します(完全なプロトコルについてはKopfのマニュアルを参照してください)。
2. ヘッドホルダーベースプレートのソケットに中央の高さゲージを配置します。
3. ツールホルダーの中央のスコープを固定し、スコープを見下ろします。十字線が位置合わせされ、ゲージの十字線に焦点が合わされるまで、マイクロマニピュレータの位置を調整します。
   注: このステップでは、スコープはヘッドホルダーの回転中心の焦点面に配置されます。いったん確立された後は、残りのステップ中にマイクロマニピュレータを移動しないでください。
4. イヤーバーをホルダーに配置し、両側のインジケータ線が0になるように中央に配置します(図3A)。
5. ヘッドホルダーの内側横および前後部ノブ(図2)を使用して、中央の高さゲージの十字線の上にあるX面とY面のイヤーバーを中央揃えにします(図3A)。
6. Z 軸のイヤー バーの位置を揃えるには、ホルダーからイヤー バーを取り外し、中央の高さゲージを取り外します。イヤーバーを交換し、0でもう一度中央に配置します。
7. スコープを見下ろす。垂直シフトノブ(図3B)とコロナチルトノブをそれぞれ使用して、スコープのクロスヘアがコロナ回転中ずっとイヤーバーの間を中央に配置されるまで、イヤーバーを下方向に回転させます。
8. ステレオタックスは現在、キャリブレーションされ、準備ができています。ヘッドホルダーの位置を調整しないでください。

3. 注射・注入用材料の調製

1. すべての器具、手術器具、材料が滅菌され、ステレオタックスの隣の無菌外科分野に置かれていることを確認してください。
2. バイオセーフティレベルおよび関連する機関バイオセーフティ規制要件に従って、ウイルス構造を取り扱い、保管します。
3. 適切な取り扱いの練習と個人的な保護具を使用するように注意して、注射器にウイルスを引き出します。

4. 麻酔

1. 手術前にマウスの体重を記録します。
2. イオブルランを使用してマウスを深く麻酔します。
3. ひるむ応答がなくなるまでつま先ピンチテストを実行して、マウスが深く麻酔されていることを確認します。動物が強い反射神経を示し続ける場合は、濃度および/または麻酔の持続時間を増加させます。
4. 手術中にしっとりと保つために、各目に眼軟膏を塗布します。
5. 頭皮を耳のすぐ後ろから、髪の毛のクリッパーで目のすぐ後ろに剃ります。
6. マウスにIACUC承認鎮痛薬を提供します。
7. 外科処置を通して動物を絶えず監視し、熱的サポートを提供する。

5. 外科的処置

1. 上部切歯を咬切り棒の隙間に入れ、舌が咬棒の下であることを確認してヘッドホルダーに入れる。
2. 耳の棒を外耳の肉にそっと挿入して、耳の棒を優しく挿入して、耳の棒が対称的に配置されるようにします(通常、大人のマウスでは3から4の間)。このステップは、ヘッドが安定し、回転に向けて中心を保つために重要です。
3. 無菌は、ベタジンとアルコール綿棒の3つの交互スクラブ、または代替機関承認の外科的部位製剤で剃った切開領域を調製する。
4. 動物の上に外科用ドレープを置いて、無菌の外科フィールドを維持し、術後感染のリスクを減らす。
5. 頭皮の矢状中線に沿って切開を行うことによって頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨の表面を静かにこすって筋膜を取り除き、縫合糸を露出させます。
   注:縫合線を視覚化するのが難しい場合は、無菌綿先端アプリケータを使用して頭蓋骨に過酸化水素を適用して縫合体の視覚化を改善することができます。
6. 中央のスコープをホルダーに配置し、十字線をブレグマの中央に配置します(図4、左パネル)。マイクロマニピュレータをゼロにします。
7. ブレグマ-ラムダ(B-L)距離に、十字線をλに移動します。
   注: 縫合線が正線に沿って直線に沿っていない場合は、bregma とラムダの両方を通して「最適な線」を使用して正線を確立することをお勧めします。ただし、上記の手順に従う場合、スコープレチクルの初期配置は、耳のバーの中間に、B-L正線縫合糸を近似する必要があります。
8. B-L距離が4.21mmより大幅に小さいか大きい場合は、割り当てられたブレグマを段階的に調整して、4.21mm±0.2mmのB-L距離を得ます。
9. 中央揃えのスコープを配置インジケーターに置き換えます。プローブをラムダとブレグマに置き、ヘッドホルダーの後側チルトノブを矢状平面(上または下向きの機首)に調整し、センタリングスコープを使用してブレグマを再割り当てします。
10. アライメントインジケータを使用して、コロナチルトノブを使用してコロナ平面のレベルを設定します。頭蓋骨の表面変形を考慮して、ロストラル/尾軸全体の複数のポイントで測定します。
11. コロナチルトノブのダイヤル上の位置は0°回転位置です。

6. 角度の付いた座標に対する回転の中心軸の位置合わせ

1. ツールホルダの中央のスコープを固定し、マイクロマニピュレータをセクション 1 から計算された座標に配置します。角度付き注入のR/L座標は、側面Aの長さに対応することに注意してください。
   1. 図 1の例では、VMN をターゲットとする光ファイバー配置の角度付き座標は、(A/P = -1.4、R/L = 0°コロナ回転で [2.03] 、コロナ回転が 15° の [0.00] 、D/V = -5.4) です。
2. スコープを見下ろし、この座標をマークします(VMN の例ごとに、中間線から R/L 2.03 mm をマークします。 図4、中央パネル)。このマークは、頭が回転するとカニューレが脳に入るポイントを表します。
3. マイクロマニピュレータを正中線に重ね合わせ(R/L = 0.00)します。コロナチルトノブを使用して、セクション1で計算された角度に頭を回転させます。
   1. スコープの十字線が既にマークに沿っている場合は、セクション 7 に進みます。
   2. スコープの十字線が基準マークに合っていない場合は、垂直シフトノブ(図 2)を使用して Z 軸のヘッド位置を調整し、十字線がマークにできるだけ近づくまで調整します。
4. ヘッドを 0° コロナ位置まで戻します。ステップ 6.3 で垂直シフトを調整した場合は、センタリングスコープを使用して bregma を再割り当てします。
5. ヘッドを回転したときにクロスヘアが一貫して基準マークに当たるまで、手順6.3と6.4を繰り返します(図4C)。
6. この時点で、セクション 1 で設定された任意の回転ポイントが、回転の定位中心に合わせて配置されます。

7. マイクロインジェクション

1. ホルダに立体訓練を入れ、マイクロマニピュレータを最初の射出座標に操作します。
   1. VMN をターゲットにする例では、A/P = -1.4、R/L = 0.4 でドリルヘッドがレベルである間にドリルします。
2. ビットが頭蓋骨のすぐ上になるまでドリルを下げます。ドリルをオンにし、ビットが頭蓋骨(硬膜ではなく)を通り抜けるまで穏やかに下げます。
3. 対側注射部位について繰り返します。
4. 滅菌ニードルドライバーを使用して、27〜30Gの針(例えば、無菌0.5mLインスリン注射器の)に90°ベンドを導入し、曲がった針を使用してデュラマーターを優しく突き刺します。
5. 注:出血が発生した場合は、無菌綿チップアプリケーターで圧力をかけ、出血が止まるまで無菌水で洗浄してください。
6. 注入する準備ができたら、慎重に定位ホルダーに充填されたハミルトン注射器を配置します。
   メモ: 新しいツールに切り替えた後、マイクロマニピュレータの座標が適用されなくなりました。バリ穴の中心を、新しい注入のターゲットとして使用します。
7. 針をバリ穴の上に慎重に配置します。
8. 針を下げて、バリ穴の中央の硬膜にわずかに触れます。CRITICAL: ステレオチックセンタリングスコープとドリル用のマイクロマニピュレータの座標が維持されるように、マイクロマニピュレータをZ軸でのみゼロにします。
9. 針がバリ穴の端に偏向しないように注意深く見て、ゆっくりと針を脳に下げます。D/V射出座標まで0.05mmの腹側まで下げ続け、1分待ちます。この余分なステップは針の取り外しのウイルスの背流れを最小にする小さい「ポケット」を作成する。
10. ゆっくりと針をD/V座標に上げ、注入を開始します。
    注: 流量と体積は、ターゲット領域と実験計画によって異なります。VMNニューロンの光遺伝学的サイレンシングでは十分なカバレッジが望まれるため、200 nLのウイルスが1nL/sの割合で注入されます。
11. マイクロインジェクションの後、退出中のウイルスの流出を最小限に抑えるために注射部位で10分待ちます。
12. マイクロピペットを脳から1mm/分のおよその速度でゆっくりと引き出します。
13. 針が頭蓋骨から取り出されたら、少量のウイルスを排出して、針が血液や組織で詰まっていないかどうかを確認します。続行する前に、無菌綿チップアプリケーターを使用してウイルスを除去してください。
14. 反対側の手順 7.6 ~ 7.12 を繰り返します。
15. マイクロインジェクションバリ穴を骨ワックスで密封して治癒を改善する(図5B)。

8. 光ファイバー移植

注:ウイルス注入後、両側光ファイバーカニューレは、セクション1ごとに計算された角度で埋め込まれます。これらの座標は、セクション 6 から頭蓋骨に既にマークされている必要があることに注意してください。

1. 角度付き座標について、手順 7.1 ~ 7.4 を繰り返します。
2. ヘッドを 0°のレベルに戻します。
3. 次に、ハンドドリルを使用して、骨ねじ用の4つの追加の穴を生成します:2つは前に配置し、2つは後に配置する必要があります(図5A)。これらは、頭蓋に光ファイバーを貼り付けるアンカーとして機能します(図5D)。
   注:頭蓋骨の上に座っている光ファイバーのフェルール部分を収容するために、角度付きの座標バリ穴から十分に離れた穴を配置してください。
4. 可能な限り穏やかに、小さなフラットヘッドドライバーを使用して、頭蓋骨にしっかりと座っているが、脳に浸透しないように骨ねじを設定します。
5. 光ファイバーカニューレをカニューレホルダーにクランプし、立体ホルダに入れる。
6. 計算された角度にヘッドを回転し、マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに再度示します。傾斜したバリ穴の中心を埋め込み対象として使用します。
7. バリ穴の中央にある硬膜に触れるまで光ファイバーを下げます(図5C)。マイクロマニピュレータを z 軸にゼロにしてから、光ファイバーを D/V 角度の座標 (VMN の例ごとに -5.4) までゆっくりと遅くします。
8. シアノアクリル酸ゲルを使用して光ファイバーフェルールをイプシラアンカースクリューに接続し、マイクロピペットチップを備えた加速剤を塗布します(図5D)。
9. シアノクリレートゲルが完全に硬化したら、カニューレホルダーを緩め、光ファイバーのフェルールがクリアになるまで上げます。
10. 反対側の角度の座標に対してステップ 8.5 ~ 8.9 を繰り返し、ヘッドをレベル付けします。さらにセキュリティを強化するために、シアノクリレートゲルと加速器を使用して2つの角度光ファイバーカニューレとの間に追加の接続を行います(図5D)。
11. 歯科用セメントの小さな、比較的薄い量を準備します。頭蓋骨の表面に塗布し、光ファイバーカニューレのアンカーネジとベースを徹底的に覆うようにします。光ファイバーパッチケーブルでの後の交配のために、フェルールを十分に清潔にしておきます。
12. セメントが乾燥したら、本位戦術装置からマウスを取り外します。
13. サーマルサポート付きの回復ケージにマウスを置きます。それがアラート、モバイル、およびグルーミングが表示されたら、それが回復し、ホームケージに転送することを許可します。

9. 手術後のケア

1. 行動、姿勢、活動、グルーミングについて、手術後3日間毎日動物を監視し、食物摂取量と体重の記録を保持します。
2. 動物が痛みや健康状態の悪さの一般的な指標を示す場合は、獣医師のサービスに相談してください。
3. 行動研究を開始する前に、回復とウイルス発現のために少なくとも2週間マウスを許可する。

10. 光遺伝学

1. 光遺伝学研究のパフォーマンスについては、 Sidorら 8 を参照してください^。
2. 研究の完了時にウイルス発現と繊維の配置を検証する。

結果

このプロトコルは、血糖制御における視床下部VMNニューロンの役割を問い合う光遺伝学的研究を行うための外科的処置を説明する^9。最初に利用されたのは、抑制性チャネルロドプシンウイルスのVMNへの二国間マイクロインジェクションに対する標準的な(非角度)定位的アプローチであった。角度付きアプローチも適していますが、対象となる脳領域をターゲットにするのに十分であり、簡単で信頼性の高い一貫したアプローチであるため、標準(非角度)アプローチが選択されました。しかし、VMNが正中線に近いことを考えると、空間制約は二国間光ファイバーの非角度移植を可能にせず、光ファイバーを正確に角度で埋め込む外科戦略の開発を必要としなかった(図6)。

この手術戦略を用いて、蛍光レポーターと融合した修飾チャネルロドプシンアニオン伝導チャネルを発現するCre依存型AAVを、二国間でNos1-creマウスのVMNに対して「SwiChR++」ウイルス¹⁰と呼ぶ。その後、正...

ディスカッション

最近の神経科学の進歩は、脳神経回路の活動と機能に関する高度な洞察と理解を支えています。これには、生体内の離散ニューロン集団とその投影部位を活性化または沈黙させる光遺伝学的および化学遺伝学的技術の適用が含まれる。最近では、遺伝子組み換えカルシウム指標(GCaMP、RCaMPなど)および他の蛍光バイオセンサー(ドーパミン、ノルエピネフリンなど)の開発が含まれており、自由に動く動物における定義された細胞型における神経活動のインビボ記録に関する。しかし、これらの技術の効果的な雇用は、関心のある地域をターゲットにするために成功した立体的手術に依存しています。これらの方法を記述するいくつかの確立されたプロトコルがありますが、多くの脳領域を標的にするのに適していますが、正中線に沿って深部脳領域を標的にすることは、重要な追加の課題を表しています。ここで実証は、角度付きの定型的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための詳細な外科的技術である。重要なことに、この技術は、多様な神経科学技術(光遺伝学、化学遺伝学、光測定法のアプローチ)に適応し、適用することができます。

このアプローチを用いて、ニ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
光ファイバーカニューレ	ドーリックレンズ	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	カスタマイズ可能な
Kopf モデル 1900 脳定位固定装置	Kopf	モデル 1900
Kopf モデル 1900-51 センターハイトゲージ	Kopf	モデル 1900-51
Kopf モデル 1905 アライメントインジケーター	Kopf	モデル 1905
Kopf モデル 1911 脳定位固定装置	Kopf	モデル 1911
Kopf モデル 1915 センタリングスコープ	Kopf	モデル 1915
Kopf モデル 1922 60 度非破裂イヤーバー	Kopf	モデル 1922
Kopf モデル 1923-B マウスガス麻酔ヘッドホルダー	Kopf	モデル 1923-B
Kopf モデル 1940 マイクロマニピュレーター	Kopf	モデル 1940
Micro4マイクロインジェクションシステム	World Precision Instruments	--
マウス、骨ネジ	、プラスチック、	00-96 X 1/16
脳定位カニューレホルダー、1.25mmフェルール	トールラボ、	XCL
外科用ドリル、	セルポイント、サイエンティフィック	、イデアルマイクロドリル