方法論記事

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

DOI：

10.3791/60989

⸱

2020年4月2日

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経化学的および行動異常の根本にある可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎の形態変化の可能性を評価するために重要な錐体ニューロンを標識し、分析するプロトコルを提示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

樹状棘の大きさや形は、その構造的可塑性に関連していると報告されています。錐体ニューロンと樹状棘の形態構造を同定するために、弾道標識技術を利用することができる。本プロトコルでは、錐体ニューロンはDilC18(3)色素で標識され、ニューロンの再構成ソフトウェアを用いて神経の形態と樹状脊椎を評価するために分析されます。神経構造を調べるため、樹枝解析とSholl解析が行われ、樹状分岐の複雑さと神経細胞の複雑性に関する推論をそれぞれ描くことができます。樹状脊椎の評価は、脊椎を4つのカテゴリ(すなわち、薄い、キノコ、スタビー、フィロポディア)に分類する再構成ソフトウェアに不可欠な自動補助分類アルゴリズムを使用して行われます。さらに、樹状脊椎形態の変化を評価するために、さらに3つのパラメータ(すなわち、長さ、頭の直径、および体積)も選択される。弾道標識技術の広い応用の可能性を検証するために、インビトロ細胞培養からの錐体ニューロンに正常に標識された。全体として、弾道ラベリング法は、高度な再構築ソフトウェアと組み合わせて、ラットの異なる脳領域のニューロンを視覚化するのにユニークで有用であり、研究者は基礎となる可能性のあるメカニズムを解明することができます神経認知機能障害.

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2000年、Gan et al. は、種々の親油性色素を組み合わせた神経系における個々のニューロンおよびグリアに対する迅速な標識技術を説明し、異なる色11,22を有する多くの脳細胞の同時標識を可能にする。最近では、脳スライスのニューロンに蛍光色素(Dil)を導入したシーボルトら3によって弾道標識技術が説明された。多目的な染色技術、弾道標識は、複数の動物種で、年齢の広い範囲にわたって利用される能力のために高く評価される。さらに、免疫染色と組み合わせて、脳細胞3の亜集団を同定することができる。従来の技術(例えば、ゴルジ・コックス銀含浸、マイクロインジェクション)4と比較して、弾道標識は樹状棘を含む形態学的特徴をより明確に区別する機会を与える。5

興奮性錐体ニューロンは、単一の大きな尖形樹状突起、複数の短い基礎樹状突起、および樹状脊椎の数千人によって特徴付けられる6。錐体ニューロンは、前頭前野(PFC)および海馬を含む高次認知処理に関連する複数の脳領域で発見される。PFCでは、錐体ニューロンは層II/IIIおよび層Vで観察され、それぞれが独特の形態を示す。具体的には、PFCの層II/IIIの錐体ニューロンは、層V6の錐体ニューロンよりも短い有端樹状突起および枝分かれが少ない。海馬内では、錐体ニューロンはCA1とCA3の両方の領域に位置し、それぞれが異なる形態を示しています。具体的には、CA1領域における錐体ニューロンは、より特徴的な尖体樹状突起を呈し、分岐は、CA3領域6に対して、ソーマから遠く離れた場所で生じる。

PFCと海馬の両方の錐体ニューロン上の樹状脊椎は興奮シナプス7の主要な部位である。樹状脊椎の形態学的特徴は、古典的に3つの主要なカテゴリ(すなわち、薄い、頑固、またはキノコ8)に特徴付けられるが、興奮性シナプス9の大きさに関連している。細い棘は、長くて細い首、小さな球根の頭部、およびより小さなポストナプティクス密度によって特徴付けられるが、より不安定であり、弱い接続を開発する。しかし、より大きな樹状脊椎の頭部を有するキノコ脊椎は、より強いシナプス接続を形成することが認められ、その大きなサイズに起因する効果がある。鋭い対照的に、頑固な棘は脊柱首を欠き、頭頸部容積比8にほぼ等しい。海馬内では、分岐した脊椎も観察され、それによって脊椎は同じ樹状脊椎頸部10から出現する複数の頭部を有する。したがって、樹状脊椎の形態学的変化は、機能性および構造的能力を反映する可能性がある。さらに、樹状脊椎の大きさと形状が構造的可塑性に関連していることを実証した研究は、小さな棘が学習と注意に関与しているのに対し、より大きく、より安定した脊椎は、記憶11を含む長期的なプロセスに関与しているという考えにつながる。さらに、樹状突起に沿った樹状脊椎の分布は、シナプス接続性5,1212と関連している可能性がある。

したがって、本方法論的論文には3つの目標があります:1)成功率(すなわち、ニューロンが選択基準を満たし、分析に適しているニューロン)で利用された弾道標識のプロトコルを83.3%5、12、13と複数の脳領域(すなわち、PFC、側坐核、海馬)にわたって提示する。5,12,132)この技術の一般化性と、インビトロで成長したニューロンへの応用を実証する。3) 神経再建ソフトウェアで利用される方法論と、そのようなデータから引き出すことができる推論を詳述する。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました(連邦保証番号:D16-00028)。

1. DiI/タングステンビーズチューブの準備

  1. 100 mgのポリビニルピロリドン(PVP)を10 mLのddH2O. Vortexで軽く溶解します。
  2. PVP溶液(材料表を参照)でチューブを充填し、20分間放置します。次いで、10 mLシリンジを用いて、他端のチューブを通してPVP溶液を抜き出す。
  3. 170 mgのタングステンマイクロキャリアビーズと250 μLの塩化メチレンを組み合わせます。タングステンビーズサスペンションを徹底的にボルテックス。
  4. 6 mgの親油性の DilC18(3) 色素と 300 μL の塩化メチレンを組み合わせます。ボルテックス DilC18(3) 染料溶液を徹底的に.
    注:ヒュームフードでステップ1.3~1.4を実行します。
  5. ガラススライド上にタングステンビーズサスペンションのピペット250 μL。懸濁液が空気乾燥するまで待ちます(〜3分)。
  6. タングステンビーズ懸濁液層の上部に300 μLのDilC18(3)染料溶液を加えます。DiIC18(3)染料溶液とタングステンビーズ懸濁液をピペットチップで十分に混ぜ、空気乾燥(〜3分)にします。
  7. 乾燥したら、カミソリの刃を使用して混合物を2つの1.5 mL遠心分離管に分割します。チューブを水で満たします。
  8. 水浴中のソニッケート(アンプI、100%)均質になるまで(〜5分)。超音波処理器の先端がビーズの懸濁液とチューブの上にあることを確認します。
  9. 2つの1.5 mLの均質化混合物を15 mLの円錐形の管に組み合わせます。さらに3分間混合物を超音波処理します。
  10. タングステンビーズ-DilC18(3)染料混合物を10 mLのシリンジを使用してPVPコーティングチューブに引き込みます。チューブを準備ステーションに供給します(資料表を参照)。
  11. 準備ステーションで1分間回転させます。10 mLのシリンジを使用して、チューブからすべての水を慎重に取り除きます。
  12. 窒素ガスをオンにし、窒素の流れを毎分0.5リットル(LPM)程度に調整し、準備ステーションでチューブを回転させ、窒素で30分間乾燥させます。
  13. 準備ステーションからチューブを取り外し、チューブカッターを使用して13mmの長さ(カートリッジの積み込みサイズに合わせる)に切ります。暗闇の中でシンチレーションバイアルで13ミリメートルの長さを保ちます。

2. 脳切片の準備

注:成人オスF344/Nラットは、食物および水へのアドリビタムアクセスを伴う12/12光:暗いサイクルの下で制御された環境に収容されたペアであった。すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのガイドで国立衛生研究所によって確立されたガイドラインを使用して世話をされました。

  1. 5%セボフルランを使用してラットを深く麻酔する。
  2. ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経が存在しない場合は、次の手順に進みます。
  3. 化学発煙フードの中のサフィンの位置でラットを固定します。
  4. 胸部中線に沿って皮膚を通して切開を行います.ダイヤフラムを分離し、はさみで胸を開きます。左心室に20G×25mmの針を挿入します。
  5. すぐに右心房をはさみで切ります。5mL/minの流量で100mMPBSの50mLをパーフューズします。100 mM PBSで緩衝された4%パラホルムアルデヒドの100 mLをパーフューズ。
  6. 灌流直後にラットの脳全体を取り除く。
  7. 4%パラホルムアルデヒドで10分間脳全体を後置します。
    注:標識に影響を与えるので、4%パラホルムアルデヒドに30分以上後置しないでください。
  8. ラットの脳マトリックスを使用して500μmの厚いコロナセクションをカットします(材料表を参照)。最初のカットを行い、ブレードを所定の位置に保ちます。2番目のブレードを使用して2回目のカットを行い、最初のブレードを垂直に取り外し、ブレード表面に組織を保持します。
  9. 脳スライスを24ウェルプレートに入れ、各ウェルに100mM PBSの1mLを入れる。すべてのスライスが切り取られるまで、この手順を繰り返します。

3. 脳部の弾道表示と可視化

  1. 各ターゲットウェルからPBSを取り除きます。
  2. カートリッジにDiI/Tungstenビードチューブを積み込み、アプリケータに入れてください。
  3. 2つのメッシュスクリーンの間にフィルターペーパーを入れます。アプリケーターをヘリウムホースに接続します。ヘリウムの出力圧力を90ポンド/平方インチ(psi)に調整します。
  4. サンプルとメッシュ画面の間の距離 1.5 cm のターゲット ウェルの中央に、アプリケータを縦に置きます。DiI/タングステンビーズチューブを発射します。
    注:撮影前に、必ずすべてのPBSをターゲットウェルから削除してください。
  5. 次の DiI/Tungsten ビーズチューブでカートリッジをロードします。残りのスライスのチューブからDiI /タングステンビーズを連続して発射します。
  6. 24ウェルプレートに100mMのPBSを充填します。500 μL の新鮮な 100 mM の PBS 3x で洗浄します。PBSで洗っている間にスライスをひっくり返させないでください。
  7. 新鮮な100 mM PBSの500 μLを加え、3時間暗闇の中で4°Cでスライスを保ちます。
  8. 細かいブラシを使用してガラススライドに脳のスライスを転送します。
    注:3つの脳セクションは、各ガラススライドに転送することができます。
  9. 各セクションに1mLのアンチフェード実装メディアを直ちに追加します。脳のセクションの上に22ミリメートル×50ミリメートルのカバースリップを置きます。暗闇の中でガラスのスライドを2日間乾燥させます。
  10. 共焦点顕微鏡システムをオンにし、60×の目的に切り替えます。
  11. 共焦点顕微鏡システムは、60×(A/ 1.4、オイル)の倍率と0.15 μmのZ平面間隔(ピンホールサイズ30μm、バック投影ピンホール半径167nm)を持たるように設定します。543 nmの波長を使用して、目的のニューロンの画像を取得します。
  12. 脳領域の境界とニューロンの形態学的特徴に基づいて、標的ニューロンタイプのZスタック画像を取得します。
    注:各動物から少なくとも3つの画像を取得します。

4. 細胞培養による方法論の利用

  1. 出生後1日目にF344/Nラットから一次皮質ニューロンを分離し、以前に報告された方法論14を用いる。
  2. 1週間の35ミリメートルガラス底皿の一次皮質ニューロンを培養します。培養培地の半分を、分離後3日目に新鮮なニューロン成長培地で変更します。100 mM PBS の 1 mL でガラス底皿 2x を洗います。
  3. 4%パラホルムアルデヒドを室温で15分間固定します。手順 3.2 ~ 3.6 を繰り返して、セルにバリスティックラベルを付けます。
  4. 100 mM PBS 3xの1 mLで洗浄してください。500 μLの新鮮な100 mMのPBSを加え、暗闇の中で4°Cで3時間保ちます。
  5. 200 μLのアンチフェード取り付けメディアを追加します。
  6. ステップ 3.10 のパラメーターを使用して、各ターゲットニューロンの Z スタック 画像を取得します。

5. 神経細胞解析と樹状脊椎定量

  1. 実験者の偏見を防ぐためにコード番号を使用して盲目のニューロン。
  2. 関心のある脳領域に基づいてニューロンの選択基準を確立します。
    注:ニューロンの選択基準には、連続樹状染色、低バックグラウンド、細胞内の色素クラスター、細胞外空間へのDiI色素の最小限の拡散、ピラミッド型ニューロンの正しい形態が含まれます(図1)。
  3. オープンニューロン再構成ソフトウェア(添付のビデオ1を参照してください)。
  4. 左上隅にある [ファイル フォルダ] をクリックして、イメージ ファイルを読み込みます。
  5. 「相馬」をクリックし、画像上のニューロンのソーマをマークします。
  6. [ツリー] をクリックし、[ユーザーガイド] を選択します。
  7. 関心のあるすべての樹状枝をトレースします。
    注:1つの天端樹状突起と複数のバジラー樹状突起によって特徴付けられる錐体ニューロンの場合、唯一の尖体樹状突起がトレースされます。すべての接続ブランチが互いに接続されていることを確認します。
  8. 「背骨」をクリックします。
  9. 検出パラメータを定義し、[すべて検出] をクリックします。
    注:脳のスライスの場合、脳領域全体で利用される一貫したパラメータは、2.0(外範囲)、0.3(最小高さ)、100%(検出器感度)、および10(最小カウント)です。細胞培養の場合、検出器感度を高くし、最小カウントを減らす必要があります。
  10. 「すべて分類」を選択して、脊椎を分類します。
    注:樹状脊椎は、ニューロン再構成ソフトウェア15に不可欠なアルゴリズムを使用して分類される。
  11. トレースを保存するには、左上隅にあるディスク イメージを選択します。
  12. 神経および樹状脊椎形態学的解析を行う。
    1. オープンニューロン再構成定量解析ソフトウェア (添付ビデオ2を参照してください。
    2. [ファイル] および [ データファイルを開く] をクリックしてイメージを読み込みます。
    3. 「解析」および「分岐構造解析」をクリックして、神経形態と樹状脊椎形態を解析します。
    4. 神経形態の場合は、「樹木の合計」をクリックし、「樹状突起合計」のボックスを選択します。
    5. 樹状脊柱の形態の場合は、[脊椎] をクリックし、[脊椎の詳細] のボックスを選択します。
    6. 出力テーブルを右クリックし、[ファイルに保存] を選択して、出力をテキスト (.txt) ファイルとして保存します。
    7. 「分析」 および 「Sholl 分析」 をクリックします。
    8. 開始半径を 10 μm に設定し、半径インクリメントを 10 μm に設定します。
    9. ボックスの [樹状突起]をクリックし、[表示] をクリックします。
    10. 出力テーブルを右クリックし、[ファイルに保存] を選択して、出力をテキスト (.txt) ファイルとして保存します。

6. データ分析

  1. 神経形態(すなわち樹状分岐の複雑さ)データを分析する。
    1. 各分岐オーダーで樹状突起の数を加算し、樹状突起の総数で除算します。100 を掛けて、各分岐オーダーにおける樹状突起の数の相対度数を計算します。
  2. Sholl 解析データを分析して、ニューロンアーバーの複雑さと樹状脊椎の接続性を調べます。
    1. 各半径の交点数の平均値と標準誤差を計算します。
    2. 各半径の脊椎の種類(すなわち、細い、頑固な、キノコ)に依存する脊椎の数を合計し、その脊椎の種類の脊椎の総数で割る。100 を掛けて、各半径の脊椎の数の相対度を計算します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図2Aでは、ラット脳切片の海馬領域における典型的な錐体ニューロンを、1つの大きな頭突きといくつかの小さな基底樹状突起を特徴とする弾道標識技術によって同定された。図2Bは、相腫が検出された後の神経再建定量解析ソフトウェアにおけるニューロンを示し、樹状枝を追跡し、脊椎を検出した。その後、神経再建定量解析ソフトウェアを用いてデータを分析し、樹状分岐の複雑性を評価する機会を提供した(図2C)および神経細胞の樹状突き複雑度(図2D)。

図2Cでは、「ツリー合計」出力から集められた遠心分岐順序法を利用して、各樹状突起および割り当てられた分岐順序に沿って横断されたセグメント数をカウントした。各分岐オーダーにおけるセグメントの相対的な頻度を、分岐オーダー 1 から 15 について調べた。樹状枝の分布の分...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、ラット脳とインビトロで成長したニューロンの両方のニューロンに対する汎用性の高い標識技術について説明する。さらに、神経変態と神経再建定量解析ソフトウェアを用いて、神経形態や樹状脊椎を評価する方法論を報告する。神経形態と樹状脊椎の評価は、樹状分岐の複雑さ、ニューロンの樹状樹状の複雑さ、樹状脊椎形態、シナプス接続性の変化を決定する機会を提供します。

プロトコルを実施する際には、研究者はいくつかのステップに特別な注意を払う必要があります。まず、4%PFAの後固定が長すぎる場合、親油性膜の完全性を損ない、色素が細胞外に漏れる原因となります。第二に、ニューロンのみを対象とする脳スライスにおける弾道標識の特異性と比較して、インビトロの一次皮質ニューロンの標識は、脳スライスにおける弾道標識がニューロンの種類(すなわち、錐体ニューロン、中型スピニーニューロン、顆粒細胞)に特異的ではないので、グリアの非特異的標識を導入する。従って、Bregma座標、形態学的評価、または特定のセルマーカーは弾道標識法と組み合わされなければならない。第三に、脳のスライスの厚さは200〜500 μmの間...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者の誰も宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、NIH助成金HD043680、MH106392、DA013137、およびNS100624によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20Gx25mm PrecisionGlideの針BDの305175
24健康な細胞培養版Costar3562
35 mmガラス底皿MatTekP35G-1.5-20-C
の抗生物質-抗真菌性の解決Cellgro30004CI100X
B-27の補足生命技術17504-04450X
バレルライナーBIO-RAD165-2417
ホウシグマB9876
ホウ酸シグマB0252
カートリッジホルダーBIO-RAD165-2426
共焦点イメージングソフトニコンEZ-C1version 3.81b
共焦点顕微鏡ニコンTE-2000E
カバーガラスVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
F344 rat(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
グルコースVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Helios 拡散スクリーンBIO-RAD165-2475
Helios 遺伝子銃キットBIO-RAD165-2411
Helios 遺伝子銃システムBIO-RAD165-2431
ヘリウムホースアセンブリBIO-RAD165-2412
アイリス鉗子世界の精密機器15914
アイリスはさみ世界の精密機器500216
塩化メチレンッシャーサイエンティフィックD150-1
ニューロベース ミディアムライフテクノロジーズ 21103-049
Neurolucida 360 ソフトウェアMBF バイオサイエンス樹状突起脊椎分析
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127-500G
パラホルムアルデヒドΣP6148
Poly-L-LysineSigmaP9155
PolyvinylpyrrolidonFisher Scientific5295
ProLong Gold 褪色防止試薬フィッシャーサイエンティフィックP36930マウント媒体
ラット脳マトリックス、300-600g、コロナル、0.5mmテッドペラ15047
ボフルランメリット獣医供給347075
重炭酸ナトリウムライフテクノロジーズ25080
スーパーフロストプラススライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-154%
シリンジキットBIO-RAD165-2421
テフゼルチューブBIO-RAD165-2441
トリプシン-EDTALife Technologies15400-054
チューブカッターBIO-RAD165-2422
チューブ準備ステーションBIO-RAD165-2418
タングステン M-25 マイクロキャリア 1.7 & マイクロ;mBIO-RAD165-2269
バンナス はさみ世界の精密機器500086
株式会社豆 フィセ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
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