外科用マウスモデルにおける変形性関節症の標準化組織形態評価

サマリー

現在のプロトコルは変形性関節症に伴う形態学的関節変化の定量化のための厳密で再現可能な方法を確立する。このプロトコルの適用は、疾患の進行を監視し、変形性関節症における治療介入を評価する上で価値がある。

要約

米国で最も流行している関節疾患の1つである変形性関節症(OA)は、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす。現在までに、軟骨変性を遅くまたは阻害することができるOAのための既存の治癒療法はありません。現在、OA病理を理解し、OAを効率的に減速、停止、または逆転させることができる新しい治療アプローチまたは薬剤を発見するための広範な研究機関があります。したがって、関節軟骨、滑膜、軟骨下骨のOA関連の病理学的変化を正確に評価するために、定量的かつ再現可能なアプローチを持つことは非常に重要です。現在、OAの重症度と進行は、主に変形性関節症研究協会インターナショナル(OARSI)またはマンキンスコアリングシステムを使用して評価されています。これらのスコアリングシステムの重要性にもかかわらず、半定量的であり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、初期の疾患状態または早期治療段階における軟骨の微妙な、まだ重要な変化を正確に評価できないことである。ここで説明するプロトコルは、コンピュータ化された半自動化された組織形態測定ソフトウェアシステムを使用して、OAにおける関節変化の評価のための標準化された厳格で再現可能な定量的方法論を確立します。このプロトコルは既存のシステムに強力な付加を提示し、継手の病理学的変化のより効率的な検出を可能にする。

概要

米国で最も流行している関節障害の1つであるOAは、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす^{1,1、2、3。32}関節軟骨は、摩擦を最小限に抑え、動きを容易にし、関節圧迫⁴に耐えるように設計された、ジ関節関節の特殊な結合組織である。関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックスの2つの主要成分で構成されています。軟骨細胞は、細胞外マトリックス⁴の開発、維持、修復において主要な役割を果たす特殊な代謝活性細胞である。軟骨肥大(CH)は、OAの開発の主要な病理学的徴候の一つである。細胞サイズの増加、プロテオグリカン産生の減少、および最終的に軟骨変性^{55、6、76,7}につながる軟骨マトリックス分解酵素の産生増加を特徴とする。また、関節の軟骨下骨および滑膜の病的変化は、OAの発達および進行^{898、9、10、11、1210,11}において重要な役割^を12果たす。^,現在までに^,、軟骨変性^{1、2、3、13、142,3,13}を阻害する既存の治癒療法はありません。¹¹⁴したがって、OA病理を理解し、OAを遅くしたり停止したりすることができる新しい治療アプローチを発見することを目的とした広範な進行中の研究があります。したがって、関節の軟骨、滑膜、および軟骨下骨におけるOA関連の病理学的変化を正確に評価できる定量的かつ再現性のあるアプローチの必要性が高まっています。

現在、OAの重症度と進行は、主にOARSIまたはマンキンスコアリングシステム¹⁵を使用して評価される。しかし、これらのスコアリングシステムは半定量的なものであり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、疾患の間、または遺伝子操作または治療介入に応答して関節に起こる微妙な変化を正確に評価できないことである。軟骨、滑膜、または軟骨下骨^{,,16、17、18、19、20、2117}の組織形態測定分析を記述する¹⁶文献には散発的な報告がある。^19,20,2118しかし、これらの関節成分の厳密かつ再現性のある組織形態分析のための詳細なプロトコルはまだ欠けており、現場で満たされていないニーズを生み出しています。

組織形態測定解析を用いたOAの病理学的変化を研究するために、手術用OAマウスモデルを用いて、内側半月板(DMM)の不安定化を介してOAを誘導した。マウスOAの確立されたモデルの中で、 DMM は傷害の外傷性メカニズムを含むため、我々の研究のために選択されました^{22,,23,,24,,25, 26.,26}半月靭帯損傷(MLI)または前十字靭帯損傷(ACLI)手術と比較して、DMMは、ヒト^{,22、24、25、26,24,}におけるOAの発達と同様に、OAのより緩やかな進行を促進^する。²⁵マウスは、関節軟骨、軟骨下骨、および滑膜の変化を評価するためにDMM手術後12週間で安楽死させた。

このプロトコルの目的は、OA に伴う共同変更を評価するための、標準化された厳格で定量的なアプローチを確立することです。

プロトコル

12週齢の雄C57BL/6マウスはJax Labsから購入した。すべてのマウスは、12時間の明暗スケジュールの部屋で、マイクロアイソレーターケージあたり3〜5匹のマウスのグループに収容された。すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、ペンシルベニア州立大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 心的外傷後変形性関節症(PTOA)外科モデル

1. 腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)/キシラジン(10mg/kg)の組み合わせを使用してマウスを麻酔し、痛みの軽減のために腹腔内注射を介してブプレノルフィン(1mg/kg)を投与し、膝の上に髪を剃る。手術を開始する前に、ペダル反射の欠如を確認してください。
2. 前に説明したとおりに、内側半月板(DMM)手術の不安定化を行う^22,,23.
   注: より詳細な外科プロトコル情報^,22,23についてはGlassonらおよびSinghらの参考文献を参照してください。
   1. 右膝関節の近位脛骨高原に遠位膝蓋骨から3mm縦切開を行います。縫合糸を使用して膝蓋腱を置き換える。
   2. 関節カプセルを腱に開き、裂歯脂肪パッドを動かして、間隔部領域、半月板間隔管、および半月靭帯²³を可視化する。
   3. 内側半月靭帯を経裂してDMMを完了し、関節^22,23,23を不安定にする。ステープルまたは縫合糸で切開部位を閉じます。
3. 同様の手順に従って偽の手術を行うが、内側の月隔靭帯の横断を行わない。
   注:マウスは、DMMまたは偽の手術のいずれかを受けるために無作為化されました。先に発表された文献によれば、マウスはDMM手術^{22、23、24の12,23}週間後に有意なPTOA^を24発症する。

2. マウス安楽死とサンプルコレクション

1. マウス安楽死
   1. DMMの12週間後、腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)/キシラジン(10mg/kg)の組み合わせを使用してマウスを麻酔する。
   2. 胸郭に沿って皮膚を通して中線切開を行い、肋骨ケージを引き込んで、心臓を灌流固定²⁷に露出させる。
      注:適切なげっ歯類の固定のためのプロトコルの追加情報、および適切な機器アセンブリと手順²⁷のビデオ描写については、Gageらのリファレンスを参照してください。
   3. メーカーのプロトコルに従って、灌流装置をセットアップします。
   4. 血液が取り除かれ、肝臓が青白くなるまで、左心室を通してヘパリン化された生理的な生理を浸透させることによってマウスを安楽死させる。完全なマウス固定が達成されるまで、10%中性緩衝ホルマリンでマウスを浸透させます。
      注:正常に浸透したマウスは硬くなります。自動ポンプシステムを使用した平均灌流時間は5~7分です。
2. サンプルの収集と準備
   1. 大腿骨中および脛骨中で骨を切断して膝を分離し、周囲の筋肉組織を解剖する。
   2. 膝関節を室温で10%中性緩衝ホルマリンに24時間保存し、その後4°Cで6日間保存して固定を続けます。
   3. 穏やかな揺れ²⁸で室温で1週間のEDTA脱灰バッファーに試料を貯蔵することによって骨を脱灰する。デケイシングバッファー溶液を 3 日ごとに変更します。
      注:脱灰バッファーは、850 mLの蒸留水と15 mLの氷酢酸の溶液に140 gの超純EDTAテトラナトリウムを溶解して調製しました。この緩衝液を、溶液に氷酢酸を滴下添加して7.6に平衡化した。pH=7.6に達すると、バッファーは蒸留水で1Lの総体積に持ち込まれた。脱灰バッファーは、新鮮な調製し、調製の1週間以内に使用した。
   4. 50%エタノールで膝を洗浄し、その後、70%エタノールをそれぞれ15分間洗浄し、次いで埋め込み処理を行います。
      注:流体移送処理は、ペンステートミルトンS.ハーシー医療センターの分子および組織病理学コアによって行われました。最適なサンプル処理に関する推奨事項については、機関の組織学のコアを参照してください。
   5. パラフィンブロックの底面に面した関節の内側の側面を用いて、マウスの膝をパラフィンに埋め込みます。埋め込み時に関節の脛骨側にわずかな圧力を加えて、脛骨および大腿骨の表面ができるだけ同じ平面に近づくようにします。

3. ミクロトーム断面とスライド選択

1. ミクロトーム断面
   1. サンプルブロックの正しい向きを確認するために、マイクロトームのブロックホルダーの平面調整ノブを使用してください。
   2. 大腿骨の遠位面、脛骨の近位領域、および内側半月板の前角と後角がセクションコレクションのために同じ平面に現れるようにパラフィンブロックに直面する(補足図1A)。内側半月板の前角と後部角が互いに分離し始めると、スライド上のセクションの収集を開始します。
   3. 構造物のサイズを比較することにより、脛骨、大腿骨、およびメニシが同じ平面に表示されることを確認します。脛骨と大腿骨は、両方のメニスカル角の大きさと形状が似ている、同等の大きさでなければなりません(補助図1A)。構造体が対応する構造体と比べて大きすぎる場合は、追加の面が必要であることを示します。重要なのは、関節スペースがそのまま残っていることを確認することです。
   4. 5 μmセクションの内側関節コンパートメントを通してパラフィン埋め込みマウス膝の矢状切片を取り、スライド上のセクションを収集します。パラフィンブロックあたり約30個のセクションを収集します。
2. スライドの選択
   1. 5 番目のセクションから始まるサンプルごとに、50 μm 離れた 3 つの代表的セクションを選択します (スライド 5、15、および 25)。選択したスライドは、その後の染色、OARSIスコアリング、およびヒストモルフォメトリクス分析に使用されます。
      注: 合計 30 個のセクションがあるブロックから、サンプル全体を明確に表すために、セットの最初のスライド (スライド 5 ~ 10)、中央 (スライド 15 ~ 20)、および終了 (スライド 25 ~ 30) を選択します。サンプル間の深さの類似レベルからスライドを選択します。

4. ヘマトキシリン、サフラニンオレンジ、高速グリーン染色

1. 選択したスライドを3種類のキシレンでデパラフィン化します。100%エタノールの2つの変化、95%エタノールの2つの変化、および70%エタノールの1つの変化でスライドを水和する。
2. 7分間ヘマトキシリンでスライドを汚し、10分間流水で洗い、1.0%氷酢酸で10分間1.0%の氷河酢酸を洗い流し、サフラニンOで5分間、0.5%の氷河酢酸に浸してすぐに洗い流します。
3. 蒸留水の2つの変化でスライドし、空気を乾燥させます。
4. 3つの変更の3つの変更のスライドをそれぞれ5分間クリアし、キシレンベースの取り付けメディアとカバースリップで取り付けます。
   注:ヘマトキシリンは、骨髄の領域を識別するための核染色剤として機能します。サフラニンOは、軟骨、プロテオグリカン、ムチン、およびマスト細胞顆粒を染色するために使用されます。速い緑は骨のためのカウンターステインとして使用される。

5. スライドイメージング

1. 顕微鏡とコンピュータベースのイメージングソフトウェアに取り付けられた利用可能なカメラを使用して、Safranin-OとFast Green染色スライドを画像化します。
2. イメージングソフトウェアを開き(材料表を参照)、膝関節の関心領域(ROI)をイメージングウィンドウの中央に配置します。回転顕微鏡スライドステージを使用する場合は、脛面が撮像領域の横軸の幅に及ぶようにスライドを位置合わせします。
3. サンプルのセットをイメージする前にカメラのホワイトバランスを設定します (補足図 2)。4倍および10倍倍率の関節コンパートメントを画像化し、脛骨および大腿骨下骨の両方が各画像ROI内に含まれていることを確認する(補助図1A、B)。 BOARSI スコアリングに使用する 3 つの選択した各レベルのイメージを保存します。
   注意:カメラのホワイトバランスを設定する方法は、使用するソフトウェアとカメラシステムによって異なります。通常、カメラタブまたはメインイメージングメニューに移動し、下にスクロールして[ホワイトバランスを設定]を選択します。[ホワイトバランスの設定]を選択すると、小さなカーソルまたはアイコンが表示されます (補助図 2A)。カーソルを使用して、画像/サンプル内の、ジョイントスペースなどの汚れのない領域を選択して、ホワイトバランスを設定します。

6. 変形性関節症研究会国際(OARSI)スコア¹⁵

1. 選択した3つのサフラニンOとファストグリーンの染色スライドを、すべてのサンプルからランダムにします。
2. 3人の観察者と盲目の方法でOARSIスコアリングを実行します。簡単に説明すると、ランダム化された順序で一度に 1 つの画像を表示し、各サンプルに選択した 3 つのレベルのいずれかに関連付けて、3 つの観測者が各画像をスコア付けできるようにします。
   注: グレーディング・スケール¹⁵の詳細な説明については、OARSI スコアリング表を参照してください。
3. 各観測点の各スコアを使用して、各セクションの平均スコアを計算します。3つの代表的なセクションの平均スコアを取ることによって、サンプルあたりの平均スコアを決定します。

7. ヒストモルフォメトリック解析

メモ:膝関節のライブ画像は、顕微鏡カメラを使用してタッチスクリーンモニターで見られ、スタイラスを使用してROIを手動でトレースします。ヒストモルファトリーソフトウェアの組み込みアルゴリズムは、定義されたROIで指定されたパラメータ(下記のプロトコルを参照)を定量化します。重要なことに、OARSIスコアリングで使用される同じサフラニンOとファストグリーン染色されたセクションは、ヒストモルフォメトリック分析に使用されます。

1. ソフトウェアのセットアップと測定の準備
   1. 顕微鏡、カメラ、コンピュータ、およびタッチスクリーンモニタをオンにします。ソフトウェアアイコンをクリックして、ソフトウェアプログラムを起動します。顕微鏡のステージにスライドを置き、観察します。
   2. 測定ウィンドウ内でサンプルを中央に配置します。測定グリッドが、顕微鏡で使用されている目的に合わせて適切な倍率に設定されていることを確認します(補足図3)。
   3. 画面上部の[ファイル] タブに移動し、[設定の読み取り]まで下にスクロールします。[設定]ウィンドウを開き、測定するパラメータに適した設定ファイルを選択します。
   4. 画面右側のリストから測定するパラメータを選択します (補足図 3)。特定の組織のROIを測定するために、以下に説明する手順に従って画像をトレースするためにスタイラスまたはマウスカーソルを使用してください。各測定が完了したら、右クリックして測定を終了し、次のパラメータに進みます。
      注: 測定するパラメータのリストは、説明された ROI を測定するためにソフトウェア会社と協議して設定された、個別の優先ファイルを使用して作成されます。完全なセットアップに関する詳細については、ディスカッションを参照してください。
   5. すべての測定を完了し、ソフトウェア画面の下部にある[概要データ]タブに移動します (補足図 3)。画面ウィンドウをクリックするか、キーボードのInsertキーを押すか、データをコピーして別のスプレッドシートに貼り付けます。
      注: ランダム化および盲目の方法でヒストモルフォメトリック解析を実行します。すべてのサンプルのパラメータ測定をすべて完了したら、データを整理し、各サンプルの3つのスライドからの測定値を平均化します。
2. 合計、石灰化、および計算不能軟骨領域の測定
   注: これらの手順を実行するには、市販のソフトウェア(「資料表」を参照)を使用します。このセクションで説明する軟骨領域C、接合部、軟骨下骨領域の明確化については、補足図1B、Cを参照してください。
   1. 軟骨が関節空間と合致する脛骨軟骨表面の上端を横切って線を引きます。軟骨軟骨が軟骨下骨と合致する軟骨-骨接合部に2本目の線を引く(図1B)。ソフトウェアのArea関数を使用して、軟骨面積の合計測定を自動的に取得します。
   2. 潮汐マークに沿って線を引きます, 軟骨の石灰化と非石灰化領域を分離する自然発生線.軟骨軟骨が軟骨下骨と合致する軟骨-骨接合部に2本目の線を引く(図1B)。ソフトウェアのArea関数を使用して、石灰化軟骨面積の測定を自動的に取得します。
   3. 合計軟骨領域から石灰化軟骨領域を差し引くことによって、未計算の軟骨領域を計算する(図1B)。
3. 軟骨細胞数と表現型の決定
   1. ヒストモルファトリーソフトウェアの設定内に別々のカウント関数を作成して、マトリックス産生とマトリックス非産生軟骨細胞を区別する(図1B)。
   2. スタイラスを使用して、指定された表現型を発現する軟骨細胞の上に小さなドットを作ることによって、軟骨細胞を産生または生産しない行列の数を決定する(図1B)。
      注:それらの表現型に従って細胞を、生成するマトリックス(すなわち、強力なサフラニン-O染色)または非産生マトリックス(すなわち、非常にかすかなまたはサフラニンO染色なし)として数えます。
4. 脛骨関節表面周長の測定
   1. 脛骨軟骨の表面を横切る線をトレースし、個々の細動を慎重に定義することによって、絶対的な脛骨関節表面の周長を測定する(図1C)。
   2. タイドマークに沿って 2 本目の線を引き、各セクションの平面の内部制御として機能します (図 1C)。
   3. 脛骨関節表面細動指数を、脛骨関節表面周囲を潮汐境界で割って計算する。
      注: Tidemark の周囲は一般的にサンプル間で等しいため、sham と DMM の関節面の境界の差は、絶対周長または細動指数を使用した場合に一般的に小さかった。
5. 軟骨下骨・骨髄空間面積の測定
   1. ヘマトキシリンのみで染色された軟骨下Area領域(すなわち、高速緑色の陰性)の領域を概説して、軟骨下腔領域を測定し、軟骨下骨内の全骨髄空間領域を決定する。これらの領域の周囲に線を引いて、脛骨下骨内のすべての骨髄空間の総面積を決定する(図2B)。
   2. 軟骨-骨接合と成長板の上層境界との間の領域を概説することによって領域機能を使用して、軟骨下領域の総量を測定し、前骨棘と後骨棘の領域に横方向に延びる(図2B)。
   3. 全軟骨下領域から軟骨下骨髄領域を差し引くことによって軟骨下骨領域を計算する(図2B、C)。C
6. 前部および後骨棘領域の測定
   1. 骨棘領域を測定するには、領域機能を用いて近位脛骨の前骨および後骨棘をトレースする(図2B、E、F)。EF
      注:骨棘は、関節軟骨と成長プレート、前または後口下領域の間に形成される骨の突起です。脛骨の前側および後方側の骨棘領域は、前部または後部を軟骨下骨にトレースすることによって決定される。骨棘と軟骨下骨の間の結合は、関節軟骨から成長プレートに及ぶ細胞のラインによって明確に線引される。骨棘と滑膜の間の結合は、骨と線維組織の間の移行によって定義される。
7. 滑膜厚の測定
   1. 大腿骨の前部挿入点から半月板上の付着点に向かって大腿骨の内側挿入点から線を引くことによってArea関数を使用して前大腿滑膜の厚さを測定する(図3B)。
   2. 大腿骨の滑膜の外側の挿入から、半月板への付着に向かって2本目の線を引く(図3B)。
   3. 滑膜の全領域を滑膜の周長で割って、滑膜厚さを計算します。

8. 統計分析

1. 測定されたパラメータを収集し、各サンプルの3つの代表的なセクションから結果を平均します。ペアになっていない Student の t 検定を使用してデータを分析し、2 つのグループまたは一方向の分散分析を比較して、3 つ以上のグループを比較します。
2. データを平均値±標準誤差として表示します。
   注: 統計的有意性は p ≤ 0.05 で達成されました。

結果

DMM誘導OAは関節軟骨変性と軟骨細胞損失をもたらす
DMM誘導OAは、偽マウスと比較してOARSIスコアが増加し、表面浸食および軟骨損失によって明らかに特徴づけられた(図1A、D)。Dここで詳述したヒストモルホメトリープロトコルは、総軟骨面積の減少および非定量化軟骨領域(図1A、B、E、G)を含むいくつかのOA関連のB変化をE検出したG。Figure 1A総軟骨細胞数の減少;そして、重要なことに、軟骨細胞を産生するマトリックスの損失(図1H、I)。I関節表面への変化は、浸食の重症度を示し、軟骨細動指数を用いて評価した。全体として、DMMマウスでは細動指数が増加した(図1C、K、L)。

ディスカッション

最近の変形性関節症研究は、関節内の異なる組織と、各組織が疾患開始または進行において果たす役割の間のクロストークの理解を高めている^{898、9、10、35、36。10,35,36,}したがって、OAの評価は軟骨の分析に限定されるべきではなく、軟骨下骨および滑膜の分析も含めるべきであることが明らかになっている。それにもかかわらず、関節軟骨はOA15、37、38の半定量的スコアリングの主^15,37,38な焦点となっている。計算された組織病学は、すでに筋骨格系研究^{39、40、41、42、43、44}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
固定のための	10%緩衝ホルマリンの隣の	ホッサーバンFisherの化学薬	SF100-20
	フィッシャーケミカル	A38S-212	脱灰用 染色用バッファー調製および酢酸溶液調製
Cintiq 27QHD クリエイティブペンディスプレイ	ワコム	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	組織形態学的分析およびイメージング用
Cintiq エルゴスタンド	ワコム	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	組織形態学的分析およびイメージング
用 エチレンジアミン四酢酸、四ナトリウム塩二水和物、99%	Acros 有機物	AC446080010脱	灰用 緩衝液調製
ファストグリーン染色	SIGMA Life Sciences	F7258	サンプル染色用
Fisherbrand Superfrost Plus 顕微鏡スライド	Fisher	12-550-15	サンプルセクションコレクション用
HistoPrep キシレン	フィッシャーブランド	HC-700-1GAL	サンプルの脱パラフィン化と染色用
Histosette II ティッシュカセット - 蓋とベースのコンビネーション	フィッシャー	15-182-701A	サンプル処理と埋め込み用
HP Z440 ワークステーション	HP	製品番号: Y5C77US#ABA	組織形態解析およびイメージング用
手動ロータリーミクロトーム	ライカ	RM 2235	用サンプル切片
作成 マーキングペン	ライカ	3801880	サンプルラベリング、カセット、スライド用
OLYMPUS BX53 顕微鏡	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/	組織形態解析およびイメージング用
OLYMPUS DP 73 顕微鏡カメラ	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/	組織形態測定解析およびイメージング用(販売終了)
ORION STAR A211 pHメーター	Thermo Scientific	STARA2110	脱灰用 緩衝液調製
OsteoMeasureソフトウェア	OsteoMetrics	https://www.osteometrics.com/index.htm	組織形態測定および解析用
灌流 2つの自動圧力灌流システム	ライカ	モデル# 39471005	マウス用膝ハーベスト
PRISM 7 ソフトウェア	GraphPad	機関 アクセス アカウント	統計分析
Safranin-O stain	SIGMA Life Sciences	S8884	サンプル染色用
ThinkBoneStage - 回転顕微鏡ステージ	Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (サプライヤー)	http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php	組織形態分析およびイメージング用
ワコムプロペン スタイラス	ワコム	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	組織形態解析およびイメージング用
Weigerts 鉄ヘマトキシリン A	フィッシャー	5029713	ヘマトキシリン染色用
Weigerts 鉄ヘマトキシリン B	フィッシャー	5029714	ヘマトキシリン染色用