ゼブラフィッシュ異種移植片モデルは、生体内微小環境におけるヒト癌細胞のハイスループット薬物スクリーニングおよび蛍光イメージングを可能にする。当社は、自動蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットを用いて、ゼブラフィッシュにおける患者由来白血病サンプルに対する大規模な自動薬物スクリーニングのワークフローを開発しました。
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この記事について
サマリー
要約
患者由来の異種移植片モデルは、インビボ系における薬物治療に対する異なる癌の反応を定義する上で重要である。マウスモデルは分野の標準ですが、ゼブラフィッシュは、高スループットおよび低コストの薬物スクリーニングの能力を含むいくつかの利点を持つ代替モデルとして登場しています。ゼブラフィッシュはまた、以前はインビトロシステムでのみ得られた大きな複製数でインビボ薬物スクリーニングを可能にする。大規模な薬物スクリーンを迅速に実行する能力は、結果をクリニックに迅速に翻訳してパーソナライズされた医療の可能性を開く可能性があります。ゼブラフィッシュ異種移植モデルは、標的療法に対する腫瘍応答に基づいて作用可能な突然変異を迅速にスクリーニングしたり、大規模なライブラリから新しい抗癌化合物を同定したりするためにも使用できる。この分野の現在の主な制限は、薬物スクリーンがより大きな規模で行われ、労働集約的でないようにプロセスを定量化し、自動化することです。我々は、ゼブラフィッシュ幼虫に一次患者のサンプルを異種移植し、蛍光顕微鏡を装備したイメージングユニットと自動サンプラーユニットを使用して大規模な薬物スクリーンを実行するためのワークフローを開発しました。この方法は、生着腫瘍領域の標準化と定量化と、多数のゼブラフィッシュ幼虫にわたる薬物治療への応答を可能にする。全体的に見て、この方法は、薬物治療を通じて生体内環境で腫瘍細胞の増殖を可能にするため、従来の細胞培養薬スクリーニングよりも有利であり、インビボ内の薬物スクリーンの大規模なマウスよりも実用的かつ費用対効果が高い。
概要
原発性患者癌またはヒト癌細胞株をモデル生物に異種移植することは、生体内での腫瘍の進行および行動、薬物治療に対する腫瘍応答、および微小環境との癌細胞相互作用を研究するために広く使用されている技術である。従来、細胞は免疫不全マウスに異種移植され、これは分野の標準のままです。しかし、このモデルシステムには、高コスト、低複製数、生体内での腫瘍負担を正確に定量化する難さ、腫瘍の生着や薬物検査にかかる時間の延長など、いくつかの制限があります。近年、ゼブラフィッシュは代替異種移植モデルとして登場し、2005年に最初に報告され、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識ヒト黒色腫細胞株がブラツラ期胚11,22に移植された。さらに最近では、2日間のポスト受精(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫が異種移植片のレシピエントとして使用され、周囲の微小環境33,44との腫瘍相互作用の生体内イメージングにおける解像の高分解能の制御を可能にしている。
ゼブラフィッシュは、異種移植片モデルとして多くの利点を提供します。まず、成虫のゼブラフィッシュは比較的低コストで大量に飼育し、迅速に飼育することができます。成類ゼブラフィッシュの各交配ペアは、週に何百もの幼虫の魚を生産することができます。サイズが小さいため、これらの幼虫ゼブラフィッシュは、ハイスループットの薬物スクリーニングのために96ウェルプレートで維持することができます。幼虫は、黄身嚢が人生の最初の週にそれらを維持するための栄養素を提供するので、典型的な異種移植片実験の過程で供給される必要はありません。さらに、ゼブラフィッシュは7dpfまで完全に機能する免疫系を持たないため、異種移植片注射の前に照射や免疫抑制レジメンを必要としません。最後に、光学的に透明なゼブラフィッシュラインは、腫瘍-微小環境相互作用の高解像度イメージングを可能にする。
ゼブラフィッシュを異種移植モデルとして最も有望な応用は、他のモデル生物を使用できない方法でヒト癌サンプルに対してハイスループット薬物スクリーニングを行う能力である。幼虫は皮膚を通して水から薬物を吸収し、薬物投与の容易さを高める5.動物は96ウェルプレート(通常は100〜300 μLの水)に維持されるため、スクリーンはマウスに比べて薬物量が少なく必要があります。現在、ゼブラフィッシュのヒト腫瘍負担に対する薬物の効果を標準化および定量化するためのいくつかの異なる方法があり、そのうちのいくつかは、ハイスループットスクリーニングに単一の薬物検査をスケールアップするために他のものよりも実用的である。例えば、一部のグループは、魚を単一細胞懸濁液に解像し、半自動化されたImageJマクロ4を用いて懸濁液の個々の液滴をイメージングし蛍光を定量することにより、蛍光標識または染色された腫瘍細胞を定量する。半自動化された全幼虫イメージング法を開発し、幼虫魚を96ウェルプレートに固定し、反転蛍光顕微鏡を使用して画像化した後、複合画像の再調整と腫瘍細胞病巣6の定量化を行った。これらのアッセイはどちらも定量化のためのかなり労働集約的な方法であり、ゼブラフィッシュ異種移植片モデルにおける真に高スループットの薬物スクリーニングを非現実的なものにしている。
この問題は、脊椎動物自動スクリーニング技術(VAST)バイオイケマと大粒子(LP)サンプラー、蛍光顕微鏡搭載イメージングユニット、自動サンプラーユニット(図1および7,8,材料表)の開発によって解決されました。このユニットでは、魚は麻酔をかけ、96ウェルプレートから自動的にサンプリングされ、毛細血管に配置され、プリセットユーザーの好みに基づいて設定された方向に回転し、画像化され、さらに研究のために新しい96ウェルプレートの同じ井戸に戻すか、廃棄されます。このイメージング技術とゼブラフィッシュ異種移植片を組み合わせることで、個々の患者腫瘍に対する大型薬物化合物ライブラリーのハイスループット薬物スクリーニングを使用する個別化医療の可能性が可能になる可能性があります。ゼブラフィッシュ異種移植片はまた、生体内の新しい化合物の毒性と有効性の両方をテストするための大規模かつ低コストの方法を提供します。ゼブラフィッシュは、マウス異種移植モデルに進む前に予備スクリーニングステップとして使用することができます。
私たちは、ゼブラフィッシュに原発性患者白血病細胞を異種移植し、他の原発性腫瘍細胞または癌細胞株に適用できる自動イメージングと定量化を備えた高性能薬物スクリーンを実行するための合理化されたワークフローを開発しました。このワークフローは、蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットと自動サンプラーユニットを使用して、現在の標準化および定量方法を改善し、生体内で腫瘍質量を定量化する以前のより労働集約的な方法に代わる自動化された代替手段を提供します。
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プロトコル
この議定書に記載されているすべての手順は、ケンタッキー大学の制度的動物のケアと使用委員会(プロトコル2015-2225)によって承認されています。患者サンプルは、ケンタッキー大学の機関審査委員会(プロトコル44672)の下で収集した。このプロトコルに従って行われるすべての動物実験は、ユーザーの制度的動物のケアと使用委員会によって承認されなければなりません。
1. 初等患者急性リンパ芽球性白血病細胞の解凍
- 一次患者末梢血単核細胞(PBMC)を37°Cの水浴中の凍結ストックから解凍する。細胞が解凍された直後に、凍結培地中の細胞(90%FBS+ 10%ジメチルスルホキシド[DMSO])を、ゆっくりとピペット処理した15 mL円錐形チューブに移し、気泡を避けます。15 mL円錐管内の細胞に、17°C解凍培地(アイコーブの修飾ダルベッコ培地[IMDM]に25%ウシ胎児血清[FBS])を10 mL添加します。
注:PBMCは、診断時に患者の血液サンプルから収集されました。このバフィーコートを密度遠心分離により分離し、細胞をRPMI 1640+10%FBSで2倍洗浄した。細胞を1mLの凍結培地で107個の細胞を1mL凍結して10個の細胞を計数し、−80°Cで保存した。 - 遠心分離細胞は100xggで10分間、細胞ペレットから吸気培地を吸引する。解凍した媒体、遠心分離、および吸引を1回繰り返して、残ったDMSOを除去します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5 mLで細胞を再懸濁し、10 μLを除去して、自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを使用します。10 μLのトリパンブルーを10 μLの細胞を加えて、カウントします。mL 当たりのセル数をカウントし、後で異種移植のために細胞を再中断する量を計算するために記録します(ステップ2.5を参照)。
注:典型的には、500個の細胞が幼虫ゼブラフィッシュ当たり異種移植される。例えば、1,000個のゼブラフィッシュを注入するには5 x 105細胞が必要です。異種移植に使用する生存率は>85%である必要があります。本実験では、細胞生存率は解凍後96%であったが、トリパンブルー染色により評価した。
2. DiIで細胞を蛍光標識
- 遠心分離剤は、PBSの5mLで所望の細胞数を200xgで5分間及び吸気上清を用いた。 g注射中に針をロードする凝集や問題の場合には、最低2 x 106細胞を染色します。
- 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-テトラメチルドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)染色溶液(DiI染色のmL当たり4μL、材料表を含むPBSの5 mL)を作り、染色溶液中の細胞ペレットを再懸濁します。
注:染色液中に再懸濁した場合、細胞密度は2 x 106細胞/mLを超えてはならない。 - 37°Cで20分間光から保護された細胞をインキュベートし、穏やかに渦を、氷の上で15分間インキュベートし、光から保護します。
- 遠心分離細胞は5分間200xgで、吸気上清を用いられます。 g5 mLのPBSで細胞を洗浄し、遠心分離機を200 x gで5分間洗浄し、吸気上清を吸引します。洗浄、遠心分離、および吸引を1回繰り返します。
- 250,000個の生細胞につき1μLのPBSで細胞を再懸濁し、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。暗闇の中で氷の上に再懸濁細胞を保ち、すぐにマイクロインジェクションを続けます。
注:これにより、2 nL容積の各注入ポンプで500個の患者細胞がゼブラフィッシュに注入されることを保証する。
3. ゼブラフィッシュの幼虫をマイクロ注入する
注:細胞の生存率を向上させるために、1~3時間以内にマイクロインジェクションを完了する必要があります。
- 細胞を染色して注入する前に、1x Tris/borate/EDTA(TBE)の25mLのアガロースをペトリ皿に注ぎ、固化させて注入するためのアガロースプレートを作ります。プレートを4°Cで2週間保存します。
- また、細胞を染色し、注入する前に、解剖顕微鏡の下で鉗子を使用して2 dpfゼブラフィッシュをデコールリオネート。手動デコールリオネーションの場合、シブラフィッシュの保護絨毛の反対側の端から、絨毛が涙を流し、ゼブラフィッシュが包絡解除されるまで鉗子で引っ張る。
注:デコールリオネーションは、前述の10のように、プロナーゼによる酵素処理を使用して行うこともできます。キャスパー(ロイ-/-;ナクレ-/-)ゼブラフィッシュは、これらの実験のために使用されました11.ゼブラフィッシュの幼虫株は、異種移植に使用できます。顔料が画像化または可視化を妨げる場合、蛍光明らかに透明なゼブラフィッシュ株が利用できない場合のメラニン合成を遮断するためにプロピルチオウラシル(PTU)治療が利用できる12。 - 4 °Cまたは氷上のプレチル針は、マイクロインジェクション中の細胞の凝集を防ぎます。マイクロローダーピペットチップを使用して、5μLの染色されたセルを冷蔵非フィラメントホウケイ酸ガラス針にロードします。
注:マイクロインジェクターとニードルのセットアップ方法は、以前に公開されています13. - マイクロインジェクターアームに針をロードします。無菌カミソリの刃を使用して針先をベベル。ステージマイクロメーターを使用して鉱物油中の液滴サイズを測定し、液滴量を全体で2 nL(直径約0.15mm)で一貫して維持します。
- E3培地25mLを含むペトリ皿に30デコリオネートゼブラフィッシュを麻酔するために4 mg/mLトリカイン-Sの350 μLを使用してください。麻酔注射用幼虫を平らな表面注入プレート(ペトリ皿中の3%アガロース)に麻酔を移し、所望の注射部位(例えば、黄身または心膜)で染色された細胞の1つのポンプで幼虫を注入した後、図2A,Bを参照)。
注:注射部位は実験の目的に基づいて選択されるべきである。最も一般的な注射部位は黄身です。血流中を循環する細胞を得るために、心膜、Cuvierのダクト、周膜腔、またはレトロ軌道空間を注射部位として使用することができる。脳などの異交性注射部位も使用できる。 - 注射プレートから10cm2ペトリ皿(1プレート2あたり30本の幼虫)にメチレンブルーを入れずに洗浄し、28°Cで1時間回収します。必要な数の幼虫が注入されるまで注射を続ける。
注:理想的には、実験に必要な幼虫の数の2-2.5倍を注入します。注射によるストレスとインキュベーション温度の上昇により、幼虫の死滅が起きます。通常、この技術を用いた練習後、染色された細胞を注入する必要がある場合、1-3時間以内に1人で800-1,500匹のシブラフィッシュ幼虫を注射することができる。 - 注射した幼虫のプレートを34°Cインキュベーターに移動します。幼虫のペトリ皿をインキュベーターの金属製の棚に直接置かないでください。例えば、棚と幼虫のペトリ皿の間に空のペトリ皿を置いて緩衝液として機能させます。注射後24時間と48時間後に死んだゼブラフィッシュの幼虫を取り除く(hpi)。
4. ゼブラフィッシュを異種移植した薬のスクリーンを設定する
-
48 hpiでは、蛍光/腫瘍の生着および健康のためのゼブラフィッシュの幼虫をスクリーニングする(図2C,D)。死んだゼブラフィッシュや不正なゼブラフィッシュを取り除き、同様の生え物を持つゼブラフィッシュを選択します(図2C、D、1-3、1'-3')。未移植のゼブラフィッシュを取り除く(図2C、D、5、5')。
- 卵黄注入魚の場合、卵黄の縁が生着細胞塊(図2C,4)の周囲に見えない魚を取り除き、定量が困難になります。心膜注入魚の場合は、卵黄嚢に細胞塊を注入した魚を取り除く(図2D、4')。
- ゼブラフィッシュを96ウェルプレートに加えます。これを行うには、200 μL ピペットチップの先端を切り落とし、4 dpf ゼブラフィッシュがフィットするのに十分な大きさを取り除きます。P200ピペットを使用してプレートから1ゼブラフィッシュを備えたE3培地の150 μLを吸引し、フラットボトム96ウェルプレートの空の井戸に追加します。
- E3培地の必要量でテストされる薬物を、1ウェルあたり150 μLで希釈します。目的の濃度の2倍で薬剤を調製する。例えば、所望の最終濃度が10μMの場合、各ウェルの総容積の半分が薬物溶液で構成されているため、E3で20μMの薬剤を調製する。DMSOコントロールグループの場合、DMSOを薬剤と同じボリュームに追加します。
- E3の150 μLにゼブラフィッシュ幼虫を含む各ウェルに150 μLの希釈薬物溶液を加え、井戸当たり1x薬物溶液で300 μLの最終体積を実現します。
- プレートを34°Cでインキュベートします。毎日死んだゼブラフィッシュをチェックしてください。2日後、必要に応じて、96ウェルプレートの各ウェルから200 μLの液体を取り除き、E3培地中の200 μLの1x希薄薬物溶液またはDMSOに交換して、薬物をリフレッシュします。
注:最良の結果は、この実験のための薬物治療の3日後に発見されました;しかし、薬物治療の長さは2〜4日の間で変化し、実験や使用されている薬物に基づいて最適化する必要があります。
5. 蛍光顕微鏡搭載イメージングユニットと自動サンプラーユニットを用いたゼブラフィッシュの異種移植
- 新鮮な4 mg/mL トリカインと1.5 LのE3培地を1 L準備します。メディアボトル1にE3メディアとメディアボトル2をトリカインで充填します。
- イメージングソフトウェア内の不要な蛍光チャネルをすべて取り除き、目的のチャンネル(この実験用のDiI)を追加します。画像はチェックマーク付きのチャンネルに対してのみ撮影されるので、目的の蛍光チャネルを確認してください。また、イメージの撮影方法(zスタック、オートメーション、連続ループなど)を選択します。
注:今回の実験では、画像化した各魚に対して手動で焦点を設定し、最適な焦点を当てた画像の数を最も多く得ました。 - DMSOコントロール魚を薬物処理魚の前に画像化して、適切な露光時間をイメージングソフトウェアで設定できるようにします。露出を設定したら、実験の時間の露出時間を変更しないでください。
注:焦点は、焦点が合っていない画像がないことを確認するために各ゼブラフィッシュのために手動で調整するか、完全に自動化されたイメージングのために、同じ焦点を、焦点が合っていない画像が廃棄された魚の間で使用するか、分析を行う前に魚を再画像化することができます。さらに、この実験は、任意の蛍光イメージャーを使用して、ImageJソフトウェアを使用して蛍光を定量することによって行うことができます。
6. ImageJを用いた蛍光の定量化
- イメージJソフトウェアを開きます。
-
ファイルに移動 |目的の .czi ファイルを開いて選択します。ソフトウェアはインポートオプションウィンドウを表示します。
- スタック表示の場合は、[ハイパースタック] を選択し、[個別にファイルを開く] をオンにし、[自動スケール] をオンにして、[チャネルの分割] をオンにします。カラーオプションで[色付き]を選択します。
- プラグインをクリックして|マクロ|レコード.
- [イメージ |調整|しきい値:しきい値ウィンドウの右側にあるドロップダウンメニューで、画像の種類を赤として選択します。ソフトウェアが蛍光領域のみをハイライト表示するまで最小しきい値を調整し(図3A)、[適用]をクリックします。ソフトウェアは、黒で選択した領域で、白黒に写真を変換します。
注:結果を標準化し、比較するために、薬物スクリーンの各画像に同じしきい値を使用します。 - [分析]をクリックします。測定します。ソフトウェアは、その画像の蛍光領域を含む結果ウィンドウをプルアップします。
- [マクロ記録]ウィンドウで[作成]をクリックします。マクロのコードを含む新しいウィンドウが開きます。分析に必要なすべての画像をハイライト表示し、手順 6.2 のように開きます。
- マクロを使用してウィンドウで実行を選択します。結果ウィンドウには、各画像の領域が表示されます。
注:画像解析は、マクロを記録して実行することなく、また画像ごとに上記の手順を繰り返すことなく、個別に行うことができます。 - 測定データをスプレッドシートにコピーします。全制御(DMSO)サンプルの全蛍光を平均します。次の式を使用して、パーセント差を計算します: –[(平均 DMSO 面積 – 実験領域)/平均 DMSO 領域] x 100% (図 3B)。
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結果
上述のプロトコルに従い、ゼブラフィッシュは、診断時にT細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)患者からもともと単離された原発患者PBMCを有する黄身および心膜に異種移植され、生存可能な凍結サンプルとしてバンクされた。48 hpiでは、異種移植された魚を蛍光標識腫瘍細胞(図2C,D)についてスクリーニングし、化学療法(デキサメタゾンまたはビンクリスチン)またはDMSOで治療した。魚を7dpiで撮影し、蛍光顕微鏡を搭載した撮像部と自動サンプラーユニットを用いた薬物治療で3日後に撮影した(図3A)。
ImageJを用いて画像化した各魚について蛍光領域/腫瘍の負担を測定し、異なる薬物治療群とDMSOとの比較を行った(図3B)。全体として、ビンクリスチンで処理された異種移植魚は、DMSO処理魚と比較して、異種移植細胞量の最大かつ最も一貫した減少を示した。デキサメタゾン処理魚はビンク...
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ディスカッション
本研究では、ゼブラフィッシュへの一次患者白血病細胞の解凍および注入を異種移植モデルとして標準化された方法で実証した。また、蛍光顕微鏡搭載イメージングユニットと自動サンプラーユニットを用いたゼブラフィッシュのハイスループット薬物スクリーニングプロトコルを確立しました。これまで、異種移植片はヒト細胞株で報告されており、異種移植腫瘍の定量はハイスループットで現場で課題となっていた。この方法は、異種化ゼブラフィッシュのイメージングを自動化する方法として蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットと自動サンプラーユニットを利用する研究の基礎となり、特定の患者の癌がどの薬物に反応するかを予測するハイスループット薬物スクリーンを実行するという究極の目標を持ち、よりパーソナライズされた医療の可能性を開きます。
このプロトコルの多くを自動化する能力にもかかわらず、見逃してはならない多くの技術的課題がまだ存在します。まず、細胞の凝集や細胞死を防ぐために、染色後できるだけ早くゼブラフィッシュに細胞を注入することが重要です。幼虫は、細胞染色プロトコルを実行する前にデコリオネートする必要があります。ガラスフィラ...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、V財団Vスカラー賞とNIHグランツDP2CA228043、R01CA227656(J.S.ブラックバーンへ)、NIHトレーニンググラントT32CA165990(M.G.ヘイニーへ)によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10x TBE 液体濃縮 | 物 VWR | 0658-5L | |
| 96 ウェル プレート、平底 | CELLTREAT | 229195 | VAST は、さまざまな標準またはディープ ウェル 24、48、または 96 ウェル プレートと互換性があります |
| アガロース | フィッシャー サイエンティフィ | BP160-500 | |
| フィラメント | サッター インストゥルメント カンパニー | B100-50-10 | |
| デキサメタゾン | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 メディア | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | フィジー | N/A | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | 自動サンプラーユニット http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| メトトレキサート | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| 鉱物油 | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/ | 蛍光灯付き顕微鏡イメージングユニット |
| https://www.unionbio.com/vast/ 硫酸ビンクリスチン | エンツォライフサイエンス | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | サーモフィッシャー | V22885 |
参考文献
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