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方法論記事

マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

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DOI:

10.3791/61003

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2020年5月31日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

この記事について

サマリー

ここでは、生体内B-1a細胞の移行および局在化を調べるマウスB-1a細胞のレトロウイルス過剰発現および導入導入の方法について説明する。このプロトコルは、ドナーB-1a細胞の局在化の定量化や、導入後のドナー細胞由来分泌因子の分析を含む、多様な下流機能アッセイに拡張することができる。

要約

細胞機能は細胞微小環境におけるニッチ特有の因子の影響を受けるため、細胞の局在化および移行を解剖する方法は、細胞機能に関するさらなる洞察を提供することができる。B-1a細胞は、健康および疾患の間に生じる酸化特異的エピトープに対して保護的な天然IgM抗体を産生するマウスにおけるユニークなB細胞サブセットである。B-1a細胞IgMの産生はB-1a細胞の位置によって異なるため、治療的観点からB-1a局在化を標的とする標的、高い抗体産生を支持するニッチまで有用となる。ここでは、C-X-Cモチーフケモカイン受容体4(CXCR4)のレトロウイルス媒介過剰発現により骨髄へのB-1a細胞移行を標的とする方法について説明する。原発性マウスB細胞における遺伝子誘導は困難であり、通常は技術に応じて10〜20%の低いトランスフェクション効率をもたらす。ここでは、原生マウスB-1a細胞のレトロウイルス伝達が30〜40%のトランスダクション効率をもたらすことを実証する。この方法は、ドナーB-1a細胞の移行および局在化を可視化できるように、B細胞欠損レシピエントマウスへのB細胞欠損型マウスへの導入されたB-1a細胞の導入細胞移管を利用する。このプロトコルは、他のレトロウイルス構造のために変更することができ、ドナー細胞または宿主細胞表現型および機能の分析、またはポストB-1a細胞転写の可分泌因子の分析を含む、養子導入後の多様な機能アッセイで使用することができる。CD45.1およびCD45.2の同種別によって分化された別個のドナーおよびレシピエントマウスの使用およびレトロウイルスプラスミド内のGFPレポーターの存在はまた、内因性B細胞集団を含む他の免疫不十分なマウスモデルにおけるドナー細胞の検出を可能にすることができる。

概要

最近の研究では、かなりの免疫細胞、特にB細胞、細胞の,局在1、2、3、4、52,3に依存1するフェノティピックおよび機能的異質性が実証されている。4,5B-1a細胞は、保護IgM抗体を産生する異種能力を有するそのような集団の1つである。骨髄B-1a細胞は、IgMを構成的に分泌し、血漿IgM力価6に大きく寄与する一方、腹膜B-1a細胞は恒常性で低レベルのIgM分泌を有し、代わりに自然なToll-like受容体(TLR)またはサイトカイン媒介シグナル伝達を介して活性化7,8,9,することができる。B-1a細胞IgM抗体は、病原体、アポトーシス細胞、および酸化LDLに存在する酸化特異的エピトープ(OSE)を認識し、OSEにIgM結合すると、アテローム性動脈硬化症などの疾患における炎症性下流シグナル伝達を防ぐことができる。したがって、骨髄のような部位への腹膜B-1a細胞遊泳を介してIgM産生を増加させる戦略は治療的に有用であり得る。しかし、オフターゲット効果が免疫機能や健康に悪影響を及ぼす可能性があるため、このような戦略を標的とし、細胞型特異的であることが重要です。

ここでは、一次マウスB-1a細胞におけるCXCR4の標的化および長期過剰発現の方法と、その後の細胞移動および機能IgM抗体産生を可視化するためのその後の導入導入について説明する(図1)。原発性B細胞の遺伝子操作は、トランスフェクション細胞株のトランスフェクションに比べてトランスフェクション効率が低い場合に制限されます。しかし、形質転換細胞株が12,13の原細胞から著しく逸脱する可能性があるため、13初等細胞の使用は、通常の生理学により密接に一致する結果をもたらす可能性が高い。レトロウイルス伝達、アデノウイルス伝達、リポフェクション、またはエレクトロポレーションベースのトランスフェクションを含む、一次マウスB細胞における遺伝子導入に関するいくつかの技術が記載,14,されているが、これは、効率、一過性、および細胞の健康への影響のレベルが異なる。以下の方法は、細胞生存率に影響を及ぼしながら>30%の十分な遺伝子導入効率を生み出すため、レトロウイルス伝達を利用した。CXCR4発現レトロウイルスは、前述のレトロウイルス構築マウス幹細胞ウイルス-内部リボソームエントリー部位-緑色蛍光タンパク質(MSCV-IRES-GFP;MigR1)16,マウスCXCR4遺伝子がクローン4をサブクローニングした.MigR1 (制御(Ctl)-GFP) およびCXCR4-GFPレトロウイルス粒子は、前に公開されたプロトコル4,,14に記載されているようにリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して生成した。

正常にB-1a細胞を導入し、次いで静脈内にリンパ球欠損Rag1-/-マウスに移した。ドナーマウスとレシピエントマウスの両方に、さらにアポリポプロテインE(ApoE)遺伝子のノックアウトが含まれ、OSE蓄積およびアテローム性動脈硬化が増加し、それによってインビボB-1細胞活性化およびIgM産生のモデルを提供する。さらに、ドナーマウスとレシピエントマウスはCD45同種で異なった。ドナーB-1細胞はCD45.1+ApoE-/-マウスから来て、Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-レシピエントに移された。-/- -/-これにより、フローサイトメトリー分析中にB細胞マーカーの染色を追加する必要なしに、レシピエントCD45.2B細胞からのドナーCD45.1の転写後の分化が可能となった。ここで示した結果は、B-1a細胞上の標的CXCR4過剰発現が、B-1a細胞が骨髄に移行する能力の増加と関連していることを示し、これは血漿抗OSE IgMの増加と関連している。さらに、負選択による腹膜B-1細胞の濃縮方法を提供し、効率的なトランスダクションのためのB-1細胞活性化の要件を実証する。この方法は、B-1a細胞遊マイグレーション、表現型、または機能に対するタンパク質過剰発現の影響を研究するために、他のレトロウイルス構築物に適応することができる。さらに、CD45.1対CD45.2の同種区別の使用は、理論的には内因性B細胞を含む他の免疫不足のマウスモデルへの伝達を可能にする可能性がある。

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プロトコル

すべての動物のプロトコルは、バージニア大学の動物のケアと使用委員会によって承認されました.

1. 腹膜B-1細胞の磁気分離と濃縮

  1. CO2を使用して、12-14 週齢の男性、CD45.1+ApoE-/-マウスを安楽死させる。
  2. まっすぐな外科用はさみを使用して腹部に表面的なカットを行い、骨曲がったはさみを使用して皮膚を剥がして腹壁を露出させます。10 mLシリンジと25G針を使用して、10 mLの37°C RPMI-1640培地で腹腔を洗い流します。マウスを振って、尾を握り、マウス側を十分に左右に動かして細胞を外します。
    注:溶かした腹土をマッサージすると、細胞の回復を最大化することもできます。
  3. 腸の近く、股関節のレベルのすぐ上の腹膜の右下側に液体を描くことによって、10 mLシリンジと25G針を使用して腹膜液を収集します。エピディジマル脂肪デポと基礎臓器を破壊しないでください。オメンタル脂肪は注射器に簡単に引き込むことができるので、マウスの左側から流体を引き出さないでください。
  4. ~6~7 mLの流体が採取されたら、氷の上に配置された50 mLの円錐管に分配します。次に、残りの流体が腹腔の底に残るように、鉗子を使用してダイヤフラムの上に腹膜壁を保持することによって、マウスを垂直に高めます。肝臓の上の外科用はさみを使用して腹壁に小さな切り傷を行い(肝臓を切断しないようにしてください)、ガラスピペットと球根を使用して残りの腹膜液を収集します。
  5. すべてのCD45.1+ApoE-/-マウス(n = 15-20)から50 mL円錐管に腹膜洗浄細胞をプールし、氷の上に保存します。
    注: 必要なマウス数の計算: B-1a細胞は腹膜総集団の5-10%を含み、著者の手でマウス1匹あたりおよそ2.5-5 x 105 B-1a細胞を得る。以下に示すように、トランスダクション効率は~30~40%です。
  6. トリパンブルーやヘモサイトメーターなどの生存性染料を使用して生細胞を数えます(トリパンブルーでサンプル1:5を希釈し、ヘモサイトメーターチャンバーに10μLをロードします)。1つの管の1 x 10の8細胞までの細胞をプールする。遠心分離細胞は4°Cで5g分間400xgで、次いで吸気上清を吸引した。
  7. 1 mLの抗CD16/CD32抗体(材料表)で最大1 x 108細胞をアッセイバッファー(1xリン酸緩衝生理食塩水[PBS]、0.5%ウシ血清アルブミン[BSA]、2 mM EDTA)で1:50希釈してFc受容体を遮断する。必要に応じてセル数に基づいてスケールします。氷の上で4°Cで10分間インキュベートします。
  8. 滅菌のためのアッセイバッファーにビオチン化抗体の2倍のマスターミックスを調製します(表1)。2xマスターミックスは、抗CD16/CD32でインキュベートする際に細胞がすでに入っている液体の体積を占めています。例えば、細胞が500μLの希釈抗CD16/CD32でインキュベートしている場合、10μLのビオチン化Ter119、Gr-1、CD23、およびNK1.1抗体を含む2xマスターミックスの500 μLを加え、25μLのビオチン化F4/80抗体を添加して、最終的な濃度を達成する。細胞に2倍のマスターミックスを加え、4°Cで20分間染色します。
  9. 5 mLのアッセイバッファーと遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間洗浄し、吸気上清を吸引します。
  10. 再懸濁し、メーカーが推奨する濃度とプロトコルに従ってアッセイバッファーに希釈抗ビオチンマイクロビーズ(材料表)で細胞をインキュベートします。
  11. 5 mLのアッセイバッファーと遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間洗浄します。吸気上清は、500 μLのアッセイバッファーで最大 1 x 108個のセルを再懸濁します。
  12. 主磁気選択カラム(材料表)3 mLのアッセイバッファー。プライミングされた磁気選択カラムに細胞を移し、濃縮されたB-1細胞を含む溶出物を氷上の15 mL円錐管に集めます。全体の量が10 mLになるまで追加のアッセイバッファーで磁気選択カラムを洗浄します。
    注: 事前精製細胞分画と後精製細胞画分のアリコートは、図2に示すように、CD19+B細胞、F480+マクロファージ、およびCD5+T細胞の染色による精製効率のためのフローサイトメトリーによって別々に分析されるべきである。
  13. ステップ1.6のように生細胞を数えることによって、精製後の細胞画分(濃縮されたB-1細胞を含む溶性)を数え、 B細胞培地中の1 x 106細胞/mLで再懸濁(RPMI-1640、10%熱不活性化ウシ血清[FBS]、10mM HEPES、1x非必須アミノ酸、1mMナトリウムピルビン酸、50 μg/mLゲンタマイシン、55 μMβ-メルカプトエタノール)。

2. 腹膜B-1細胞刺激

  1. 2つの導入条件(Ctl-GFPおよびCXCR4-GFP)のプールされた細胞を分割し、未導入制御のために少なくとも10 x106細胞をメッキする。
  2. 1ウェルあたり最大150 μL(150,000セル)を96ウェルの丸底プレートにプレートします。
  3. 細胞増殖を刺激するために、すべてのウェルに100 nM TLR9アゴニストODN1668を加えます。
  4. 37°Cで16-18時間、5%CO2のインキュ2ベート。

3. 腹膜B細胞のレトロウイルス伝達

  1. 以前に公開されたプロトコル14に記載されているようにリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてCtl-GFP(MigR1)およびCXCR4-GFPレトロウイルス粒子を生成する。
    注:これは数日かかるので、このプロトコルを開始する前に-80 °Cでレトロウイルスストックを準備し、保存し、アリコート。
  2. 氷の上にレトロウイルスストックを解凍します。すぐに使用し、凍結融解サイクル中にウイルスのチターが大幅に減少するので、再凍結しないでください。8 μg/mL ポリブレンと新鮮なβ-メルカプトエタノールの存在下で、細胞に20:1の感染多重度(MOI)でCtl-GFPまたはCXCR4-GFPレトロウイルス上清を加え、最終濃度55μMで新鮮なβ-メルカプトエタノールを添加します。非伝達制御のために確保された細胞にウイルス株を追加しないでください。
  3. 室温で90分間800xgで遠心板gでスプフレキシを行います。
  4. 37°Cでレトロウイルスを用いたプレートをインキュベートし、さらに3時間の場合は5%CO2。
  5. 新鮮なB細胞培地で細胞を収穫し、再プレートし、37°Cでインキュ2ベートし、5%CO2を一晩で行う。

4. 細胞の細胞分化型の細胞の細胞の細胞の並べ替え

  1. 培養細胞とプールを、各条件に対して3つの別々の50 mL円錐管(非トランスデューセ、Ctl-GFP導入、CXCR4-GFP導入)に収穫します。
  2. ステップ1.6のように生きた細胞を数え、4°Cで5分間400xgで遠心分離機を摂り、吸気上清を含む。 g
  3. Fc受容体を遮断するために、1:50抗CD16/CD32抗体(材料表)を含むソートバッファー(PBS + 1%BSA)の100,000細胞/μLで細胞を再懸濁させる。氷の上で4°Cで10分間インキュベートします。
  4. 補償対照のためのアリコート細胞(報酬対照当たり30,000個の細胞):非導入サンプルからの非染色および単染色制御アリコートおよび、トランスデューセサンプルからのGFP単染色対照アリコート用。
    注:市販の補償ビードは、代わりに、非トランスデューセの細胞数が低い場合は、単一の染色制御に使用することができます。
  5. フルオロフォア共役抗体を含む2倍の抗体マスターミックスをソートバッファーに用意する(表1)。2x マスターミックスを、非トランスデューシング、CTL-GFP 導入、CXCR4-GFPの導入サンプルに追加します。個々の抗体を単一の染色制御に追加します。暗闇の中で4°Cで20分間インキュベートします。
    注: 2x マスターミックスは、ステップ 1.8 のように、抗 CD16/CD32 でインキュベートするときに細胞が既に入っている液体の量を占めています。CXCR4がCXCR4過剰発現を確認するために、各条件からの細胞のアリコートを個別に染色することができる。
  6. 1 mLのソートバッファーでサンプルを洗浄し、70 μm フィルターを通してポリプロピレンチューブにひずみます。
  7. 遠心分離機は4°Cでg5分間400xgで吸気上清を用いた。ソートバッファー内の 50,000 セル/μL でサンプルを再中断します。
  8. 細胞選別前に、1 mLの回収培地(RPMI-1640、20%熱不活性化FBS、10mM HEPES、1x非必須アミノ酸、1mMナトリウムピルビン酸、50μg/mLゲンタマイシン、55μM-β)を含む標識された蛍光活性化細胞選別(FACS)コレクションチューブを調製する。
  9. 細胞ソーターでサンプルを実行する前に、死細胞識別のために2x DAPI(ソートバッファで1:5000希釈として用意)を追加します。
  10. GFP+ B-1a細胞を DAPI- CD19+ GFP+ B220ミッドロCD23- IgM+ CD5+ CTL-GFP サンプルから採取培地を含む FACS チューブに並べ替えます。非トランスデューセサンプルを使用してGFP+ ゲートを設定し、DAPI- CD19+ GFP- B220ミッドロCD23- IgM+ CD5+非トランスデューセ B-1a 細胞を並べ替えます。
    注: また、非導入細胞は、GFP-画分内の B-1a セルを個別にガッティングすることにより、CTL-GFP および CXCR4-GFP サンプルからソートすることもできます。トランスデューセドまたは非トランスデューセB-1b細胞は、DAPI-CD19 + GFP+/ - B220ミッドロCD23 -IgM+ CD5-細胞としてこのソート戦略を使用してソートすることもできる。-

5. 養子縁組の移転

  1. 細胞選別後、遠心分離細胞は4°Cで5g分間400xg、吸気上清を注意深く行う。
  2. 1,000細胞/μLで、冷たい生殖不能1x PBSの細胞を再懸濁する。
  3. イオブルランを使用して雄のRag1-/- ApoE-/-マウスを麻酔し、超微細インスリン注射器を使用して静脈内レトロ眼窩または尾静脈注射を介してマウスあたり100 μL(100,000細胞)を注入する。コントロールとして1x PBSを用いてマウスを数個注入する。

6. ドナー細胞と血漿IgMの定量化

  1. 養子後の移行が望ましい時に、骨髄および脾臓組織収穫4およびフローサイトメトリーによってレシピエントマウスで移された細胞を分析する。CD45.1、CD45.2、CXCR4の染色によるドナー細胞の局在化とCXCR4過剰発現を定量化し、フロージョなどのソフトウェアを用いてフローサイトメトリー結果を分析します。
    注: このステップで使用する抗体については、表 1を参照してください。結合ドナー細胞にGFPとしてFITCチャネルに蛍光を発する抗体コンジュゲートを使用しないようにしてください。
  2. 動物の犠牲時に心臓穿刺を介して採取した全血に0.5 M EDTAの10μLを加えて血漿を分離する。遠心分離機全血を7,000xgで全血、アリコート血漿を別々の1.5 mL遠心分離管に入った。 gELISA4によるIgMなどの分泌因子の分析を行うまで-80°Cで保管する。

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結果

プロトコルの概要は図 1に示します。図2は、他の腹膜細胞タイプの磁気枯渇後の腹膜B-1a細胞の濃縮を示す。非破壊後の分画中の生きたシングル細胞は、F4/80+マクロファージと比較してCD19+B細胞の割合が高く、CD5ハイCD19-T細胞が欠けており、プレ枯渇画分と比較+してCD19+CD5中期B-1a細胞の頻度が増加している。- +図3は、レトロウイルスB細胞の誘導を成功させるためのB細胞活性化の要件と、Ctl-GFPレトロウイルスを用いたウイルスMOIの増加に伴うGFP+B細胞サブセットの正常導入頻度の用量依存的増加を示す。表2は、24ウェルまたは6ウェルプレートと比較して96ウェルラウンドボトムプレートを使用して、増量されたトランスダクション効率を示しています。図 4

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ディスカッション

ここで提供される方法は、安定かつ比較的効率的な一次B-1a細胞遺伝子の送達、生体内導入導入、および注入された細胞の同定および局在化を可能にする。細胞は17週後の細胞転移を検出することができ、CXCR4発現の増加を保持した。レトロウイルス媒介性送達は、私たちの手の細胞生存率への影響を最小限に抑えて、プライマリマウスB-1a細胞の30〜40%のトランスダクション効率を生み出した(図4e)。これは、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、核切除、またはリポフェクタミンを含む原発性マウスB細胞への遺伝子導入の技術を比較したMoghimiたちの研究の結果と一致している。しかし、CXCR4の過剰発現範囲は、CXCR4-GFP導入B-1a細胞を受け取る受信者の範囲が大きく異なることがわかりました(図6c,d)。そこで、結合解析を利用して、CXCR4発現の増加がB-1a移行および骨髄への局在化の増加と相関していることを実証した。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、1R01 HL107490、1R01 HL136098、P01 HL055798のプロジェクト3、P01 HL136275-01(C.A.マクナマラ)、R01GM100776(T.P.ベンダー)によってサポートされました。A. Upadhyeは、米国心臓協会の博士研究員16PRE30300002および5T32AI007496-20によって支えられた。バージニア大学フローサイトメトリーコアのジョアン・ラニガン、マイク・ソルガ、クロード・チューの優れた技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70ミクロンフィルターキャップファルコン352235
抗ビオチンマイクロビーズMiltenyi Biotec130-090-485
抗CD16/CD32、またはFcブロックLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83クローン:RA3-6B2
ベータメルカプトエタノールGibco21985-023
CD19APCef780eBioscience47-0193-82クローン:eBio1D3
CD23 ビオチンeBioscience13-0232-81クローン:B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82クローン:B3B4
CD3e ビオチンeBioscience13-0033-85クローン:eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- マウスN/AN/Aハウスで飼育
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580クローン: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895クローン: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- マウスN/AN/A家で飼育
CD5 PEeBioscience12-0051-83クローン: 53-7.3
Ctl-GFP レトロウイルスN/AN/AT.P. 博士が提供するGFP発現レトロウイルスプラスミドMigR1を使用して家で生成しました。Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82クローン: 2B11
CXCR4-GFP レトロウイルスN/A N/AマウスCXCR4をMigR1レトロウイルスプラスミド
F4/80ビオチンにMF48015クローン: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.必要な
ゲンタマイシンGibco15710-064
Gr-1 ビオチンeBioscience13-5931-82クローン: RB6-8C5
熱不活化ウシ胎児血清Gibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565クローン: R6-60.2
インスリン用シリンジBD Biosciences329461
IsofluraneHenry Schein アニマルヘルス029405
ライブ/デッド イエローライフテクノロジーL34968
LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 ビオチンBD Biosciences553163クローン: PK136
非必須アミノ酸Gibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
ピルビン酸ナトリウムGibco11360-070
Ter119 ビオチンeBioscience13-5921-82クローン:Ter119
クローニングすることにより社内で生成 ライフサイエンステクノロジーズ ライセンスズ

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