反復関連非ATG依存的翻訳産物は、いくつかの繰り返し拡張ベースの疾患の新たな病原性特徴である。記載されたプロトコルの目的は、モデル系C.elegansにおける行動および細胞アッセイを用いてこれらのペプチドによって引き起こされる毒性を評価することである。
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この記事について
サマリー
要約
C.エレガンスは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)やハンチントン病などの繰り返し膨張突然変異によって引き起こされる、年齢関連神経変性疾患をモデル化するために一般的に使用されます。近年、反復膨張含有RNAは、反復関連非AUG依存性(RAN)翻訳と呼ばれる新規型のタンパク質翻訳の基質であることが示された。正規翻訳とは異なり、RAN変換は開始コドンを必要とせず、繰り返しがしきい値の長さを超えた場合にのみ発生します。読み取りフレームを決定する開始コドンがないため、RAN変換は、反復膨張シーケンスを含むセンスおよびアンチセンスRNAテンプレートの両方からすべての読み取りフレームで発生します。したがって、RAN翻訳は、疾患関連の有毒ペプチドの数を1から6に拡大する。これまで、RAN翻訳は、8つの異なる反復拡張ベースの神経変性疾患および神経筋疾患で文書化されてきた。いずれの場合も、どのRAN製品が毒性であるか、ならびに毒性のメカニズムを解読することは、これらのペプチドが疾患病態生理学にどのように寄与するかを理解するための重要なステップです。本論文では、モデル系C.エレガンスにおけるRANペプチドの毒性を測定する戦略を紹介する。まず、開発中のC.エレガンスの成長と運動性に関するRANペプチド毒性を測定する手順を説明する。第2に、RANペプチドが運動性に及ぼす、発達後の年齢依存性の影響を測定するためのアッセイを詳述する。最後に、ニューロンの形態に対するRANペプチドの効果を評価するための神経毒性アッセイについて述べます。これらのアッセイは、RANペプチド毒性の広範な評価を提供し、疾患のメカニズムまたは治療法を同定するために大規模な遺伝的または低分子スクリーンを実行するのに有用であり得る。
概要
DNA反復配列の不適切な拡大は筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病(HD)1などのいくつかの神経変性疾患の遺伝的基盤である。これらの疾患には確立された細胞モデルと動物モデルがあるが、これらの条件の根底にあるメカニズムは十分に定義されていない。例えば、HDは、ハンチンチンタンパク質Htt2に対するコード配列におけるCAG反復配列の拡張によって引き起こされる。CAGはアミノ酸グルタミンをコードするので、CAGの繰り返し拡張は、ポリグルタミン、またはポリQ内の配列を挿入する結果、Tt.拡張されたポリQタンパク質の中で、毒性33、44に関連する長さと年齢依存性タンパク質凝集体を形成する。驚くべきことに、2つの最近の研究は、polyQ配列の長さがHD疾患発症の主な要因ではないことを示唆し、ポリQ独立因子も疾患55、66に寄与する可能性があることを示唆している。
可能なポリQ非依存のメカニズムの1つは、Repeat Aon-AUG依存(RAN)翻訳7と....
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プロトコル
1. コドン変化型RANペプチド発現構築物の生成
- 基本的な反復的なDNA/RNA構造を排除するが、上にあるアミノ酸配列を保持するために、同義コドンを利用して個々のRANペプチドコード配列を設計する。
- カスタムコドンシーケンスを、研究に必要な繰り返し長さで商業的に注文します(通常は5~100の繰り返し)。5' の終わりに HindIII 制限サイトと 3' の終わりに BamHI 制限サイトを含める pPD95.79 などのC. エレガンス発現ベクターへのクローニングを容易にします。
注:より大きな構成体の合成が困難であることが判明した場合、より小さなビルディングブロックシーケンスを合成し、方向結紮戦略17を使用してより大きな繰り返しに組み込むことができます。 - 標準的なT4ライゲーション法を用いてペプチド配列をC.エレガンス発現ベクターにサブクローニングする。
- ランペプチド配列の前でPCRによって生成された細胞型特異的プロモーター配列をサブクローニングし、組織特異的なRANペプチド-GFP発現を駆動する。
- 野生型C.エレガンスの生殖腺にRANペプチドコンストラクトをマイクロインジェクトし、標準方法18を用いて染色体外配列を含むトランスジェニック株を生成する。共注射マーカーの場合、筋....
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結果
ここで説明するアッセイを用いて、G4C2反復増殖を有するALS患者に見られるRANジペプチドの毒性に対する異なる遺伝子阻害2の影響を評価した。成長アッセイを用いて発生毒性を測定し、筋肉発現PR50-GFP毒性のゲノムワイドRNAiスクリーンサプレッサーで同定されたいくつかの遺伝的ノックアウト変異体の効果を分析した。PR50-GFPの発現だけでは完全に浸透性の成長阻止をもたらしたが、いくつかの遺伝子における機能変異の喪失は、PR発生毒性を12〜94%から抑制した(図1A)。
また、ビデオ速度解析法を用いて、PR50発現動物の発達運動性に対する特定の遺伝子ノックダウンの効果を測定した。予想通り、gfp(RNAi)は、PR50-GFP発現の阻害により、空のベクター(RNAi)と比較して運動性が大きく増加した。また、プロテアソームサブユニットrpn-7に対するRNAiがPR50運動性の有意な増加をもたらしたことも明らかにした(
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ディスカッション
ここでは、筋肉またはC.エレガンスのニューロンでモデル化されたRANペプチド毒性をアッセイするために使用できる方法を報告します。神経変性タンパク質はヒト患者に発症する表現型の年齢を有する一方で、モデル系で過剰発現すると発達毒性を示すこともある。過剰発現には解釈上の限界は大きいが、毒性表現型を逆転させる遺伝子や薬物の同定を目的とした遺伝的または薬理学的スクリーンの強力な出発点を提供する。これは、疾患の最も正確な動物モデルが偏りのないスクリーニングアプローチ24、25、26に適していない表現型または弱い表現型を有しないことを考えると特25,26に重要である。当社のC.エレガンスRANペプチドモデルおよびアッセイは、酵母やショウジョウバエなどの他のRANペプチドモデルシステムに対する強力で補完的なアプローチを表し、これらの新しく記述されたタンパク質の毒性に重要な細胞経路を理解します。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
NIH R21NS107797
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 35mm x 10mm ペトリ皿、滅菌 | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | 線虫成長プレートとRNAi |
| AGAR 粒状2キログラム | BD診断システム | 線虫成長プレートとRNAi | |
| アガロース 超純生命 | 技術 | 16500500 RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション | |
| カルベニシリン 5G | サーモサイFAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode Growth Plates and RNAi |
| Cover Glasses No 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains | |
| FF COV Glass NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco バクトペプトン | ギブコ | DF0118-17-0 | 線虫成長プレートとRNAi |
| ハロカーボンオイル 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | 線虫成長プレートとRNAi | |
| ライカ 高度な蛍光イメージングソフトウェア | ライカマイクロシステムズ | LAS-AF | ビデオ速度分析およびコミソシューアッセイ用画像取得ソフトウェア |
| ライカイマージョン タイプN (オイル) | W NUHSBAUM INC | コミソシューアッセイ用イメージング | |
| レバミゾール塩酸塩 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 | ミッショナーアッセイ用イメージング | |
| マイクロローダー ヒント 2 X 96 PCS エ | ッペンドルフ ノースアメリカ バイオツール | E5242956003RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション | |
PETRI DISH、60X15MM,500/CS | CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | Nematode Growth Plates and RNAi | |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode Growth Plates and RNAi |
参考文献
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group.
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再版と許可
