チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ

サマリー

従来のRT-PCR技術と比較して比較的短時間で簡単な機器を使用したティラピア魚のTiLV検出用RT-LAMPアッセイを発表します。このプロトコルは、特に発展途上国において、TiLVDの流行の広がりを制御するのに役立つ可能性がある。

要約

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、ティラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされるチラピアの新興ウイルス病であり、世界の多くの地域でティラピアの大量罹患率と死亡率をもたらした養殖業における永続的な課題です。TiLV感染に対する効果的で迅速かつ正確な診断アッセイは、初期感染を検出し、養殖農業における病気の蔓延を防ぐために必要です。本研究では、魚類組織におけるティラピア湖ウイルスを検出するために、高感度かつ実用的な逆転写ループ媒介等温増幅法(RT-LAMP)法を発表した。感染したサンプルのRT-qPCRとRT-LAMPアッセイの比較は、63(100%)で肯定的な結果を明らかにしましたおよび 51 (80.95%)それぞれサンプル。さらに、感染していないサンプルの分析は、全63の未感染組織がRT-qPCRおよびRT-LAMPアッセイの両方に否定的な結果をもたらすことを示した。ティラピアの5つの病原体との交差反応性をRT-LAMPを用いて評価し、すべての試験は否定的な結果を示した。感染した魚から得られた肝臓と粘液の両方のサンプルは、RT-LAMP法を使用して同等の結果を示し、粘液は魚を殺すことを避けるために非致死的なアッセイとしてRT-LAMPで使用できることを示唆した。結論として、この結果は、提示されたRT-LAMPアッセイが1時間以内にティラピア組織におけるTiLV検出に有効な方法を提供することを実証した。したがって、この方法は、TiLVの迅速な診断のための農場でのスクリーニングツールとして推奨されます。

概要

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、アジア^1、2、アフリカ、アメリカを含む世界の多くの地域でティラピアの死亡を引き起こすと伝えられているティラピア(^1,オロークロミス属)のウイルス性疾患です。この病気は、2009年にイスラエルでティラピアの大量死亡時に初めて認められ、キネレット湖の野生のティラピアの数^は年間257トンから8トンに劇的に急落した。この疾患は、チラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされ、これは、新しい属ティラピネウイルスおよび新種ティラピアチラピネウイルス³としてアムヌーンウイルス科に割り当てられている。TiLVの遺伝的特徴付^,けは、ウイルスが10タンパク質^,1、2、4をコードする10個のセグメントを有する新規なエンベロープ、陰¹性感覚、一本鎖RNAウイルスであることを示した。⁴セロロドン属のティラピアの様々な種、オレオクロミス、およびティラピンおよび他の温水魚(例えば、巨大なグーラ(オスフロネムス・ゴラミー))は^TiLV2,55の影響を受けやすいことが示²されている。現在、このウイルスは、感染した生きた魚^66、77の動きを通じて世界的に広がり続けているが、凍結チラピアまたはその製品を介したウイルス感染のリスクは⁸に制限されている。TiLV感染による実質的な死亡率は、ティラピア産業に著しく有害な経済的影響を及ぼす可能性がある。例えば、TiLV感染に伴うエジプトにおける夏の死亡率症候群の経済的影響は、1億米ドル9と計算された^。したがって、養殖場におけるこの病気の管理を容易にする迅速かつ適切な診断方法を開発することが重要である。

これまでTiLVDの診断は、分子アッセイ、ウイルス分離、組織病理学に基づいていました。TiLV診断^10,11,11用に異なるPCRプロトコルおよびプライマーが開発されている。例えば、ウイルスの検出感度を有するSYBRグリーンベースの逆転写定量PCR(RT-qPCR)法が開発され、TiLV検出¹⁰のために検証されている。TiLV 検出の他の PCR 法としては、TaqMan 定量 PCR¹¹、RT-PCR²、入れ子になった RT-PCR¹²、および半ネスト RT-PCR¹³が挙げられます。しかし、これらの方法は、反応の複雑さのために結果を生み出すために洗練された実験室機器と比較的長い時間を必要とし、フィールドアプリケーションには適していません。

ループ媒介アイソ熱増幅(LAMP)アッセイは、迅速でシンプルで実用的な分野アプリケーション^14,15,15です。この技術はストランド変位反応の原理を採用し、増幅反応は洗練された高価なサーマルサイクラー^14,15,15を使用せずに等温条件下で実行される。その結果、増幅されたLAMP製品またはRT-LAMP製品は、DNAまたは^RNA14の安全な可視化または濁度または白い沈殿物^{,16、17、18,17}の存在のために肉眼で観察するための蛍光染色を有するアガロースゲル電気泳動を用いてラダー状のバンドで分析される。¹⁸これらの理由から、この技術は、異なる魚病原体^,,,17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27のオンサイト検出に使用されています。^{20,21,22,17,18,19,26,27232425}本研究の目的は、TiLV検出のための迅速で敏感で正確なRT-LAMPアッセイを確立することであった。RT-LAMPアッセイは30分以内に魚のサンプルのTiLVのためのスクリーニングを提供する。この技術はTiLVDの診断および監視のために適用されるかもしれない。

プロトコル

この実験は、動物組織の使用を含む、カセサート大学、バンコク、タイの施設動物の世話と使用委員会によって承認されました (プロトコル番号ACKU61-VET-009).

1. 組織の収集

1. クローブオイルの過剰摂取(すなわち、3 mL/L以上)を使用してティラピア魚を安楽死させる。トリケインメタンスルホン酸塩は、クローブオイルの代替として使用することができる。
2. 滅菌マヨハサミと鉗子を使用して、死後のティラピアの腹部を切り開き、約30〜50mgの肝臓組織を切り離すか、顕微鏡カバーガラスを使用して、魚の皮膚層を縦方向(前から後部まで)に削り取って100μLの粘液を収集します。
3. すぐにRNA抽出ステップに進むか、または、実験まで収集したサンプルを−80°Cに保ちます。無傷のRNAはDNAよりも敏感であるため、RNA抽出時にRNaseフリーの材料と試薬を使用してください。

2. RNA抽出

1. 肝臓組織からRNAを抽出するには、チラピア組織の30〜50mgをグアニジウム酸フェノール抽出試薬(材料表)600~1,000 μLを含む1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、ハンドヘルド組織ホモジナイザーを使用して均質になるまでサンプルを粉砕します。組織サンプルは、グアニジニウム酸フェノール抽出試薬の約10%を必要とします。粘液サンプルの場合、グアニジニウム酸フェノール抽出試薬の300 μLのみを使用してください(3:1)。
   注意:グアニジニウム酸フェノール抽出試薬は有毒です。したがって、取扱いは注意して行う必要があります。安全眼鏡、実験室用ガウン、および安全手袋などの保護具は着用する必要があります。
2. 均質化サンプルを室温で30sの10,000 x gで遠心分離し、上清を新しい滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
3. チューブに95%のエタノールの等しいボリュームを追加し、よく混ぜます。
4. 溶液を、コレクションチューブに入れたスピンカラム(材料表)に移し、遠心分離機を室温で30sの10,000 x gで移動します。フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しいコレクションチューブに転送します。
5. 400 μL の RNA プレウォッシュ試薬 (材料表) をカラムに加え、遠心分離機を 10,000 x gで室温で 30 s で加え、流量を廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。
   注:RNAプレウォッシュを調製するには、95%エタノールの10 mLを40mLのRNAプリウォッシュ濃縮物に加えます。
6. カラムに700 μLのRNAウォッシュバッファー(材料表)を加え、遠心分離機を10,000 x gで室温で2分間加えます。カラムを無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
   注:RNAウォッシュバッファーを調製するには、95%エタノールの52 mLをRNAウォッシュバッファー濃縮物の12 mLに加えます。
7. スピンカラムマトリックスに取り込まれたRNAサンプルを、100μLのヌクレアーゼフリー水で、遠心分離機を10,000 x gで室温で30sで溶出させます。
8. マイクロボリューム分光光度計を用いて抽出したRNAの濃度を測定し、ヌクレアーゼを含まない水を用いてRNAを所望の濃度に希釈します。
   注: OD260/OD280 の修飾吸光度値は 1.6 から 1.9 までであり、RT-LAMP アッセイに許容される RNA 純度を示します。
9. 直ちに次のステップに進むか、使用するまでサンプルを−80°Cに保ちます。

3. プライマー設計

1. プライマーエクスプローラバージョン4を使用して、RT-LAMP用の特定のプライマーを設計します。ウェブサイトにアクセスし、https://primerexplorer.jp/e/、PrimerExplorer V4ボタンをクリックします。
2. TiLVのセグメント3のシーケンスを含むファイルをFASTA形式で選択し、プライマーデザインボタンをクリックします。
   注:ティラピア湖ウイルスTV1^{セグメント3}1を表すGenBankの加盟番号KX631923からFASTA形式のシーケンスを取得します。
3. プライマーを設計するには、次の基本パラメータを入力します。
   - 40%~60%のGC含有量
   - ≥280 塩基対のアンプリコン(bp)
   - 5 °Cの最大差を有するプライマー間の同様の融解温度(Tm)
   注: プライマーはお互いを補完してはなりません
   1. 二次構造を形成しやすいシーケンス領域を避けます。
   2. 最大のΔGの最適設計には最小-3.5のダイマープライマー解析を選択し、小さなΔGに最適な設計を行う場合は、最大-4のプライマーの端部を選択します。
4. [生成]ボタンをクリックします。
   注: ソフトウェアが入力データの処理を終了すると、プライマーの結果が表示されます (図 1)。

4. RTランプアッセイ

1. 2.5 μLの1x SD II反応バッファー、3 μLの6 mM MgSO 4、1.4 mM dNTPセットの1.4 μL、0.8 Mベタインの4 μL、0.052 mMカルセイン混合物の1.3 μL、1μLの1.6μM TiLV-F3r、 1 μLの1.6 μM TiLV-B3プライマー、0.2 μM TiLV-BIPプライマーの1 μL、0.2 μM TiLV-FIPプライマーの1 μL、0.3 U Bst DNAポリメラーゼの1 μL、0.1 U AMV逆転写酵素の1 μL、および3.8 μLの核無反応反応。₄
   注:総反応量の少なくとも10%を含む余分なマスターミックスを準備してください。
2. RT-LAMPマスターの22 μLを無菌1.5マイクロ遠心分離管に混ぜます。
3. 抽出したRNAを3μLずつ反応管に加え、ボルテックスで混合します。陰性のコントロールには、RNA材料の代わりに蒸留水を使用してください。
4. 65°Cで60分間反応をインキュベートし、続いて80°Cで10分間反応を終了させる。
5. インキュベーション後、肉眼での色分け変化を目視で観察する。正の結果は蛍光グリーンの色として表示されます。

5. アガロースゲル電気泳動

1. アガロース粉末の0.6 gを1x TAEバッファーの40 mLに懸濁させて1.5%w/vアガロースゲルを調製します。混合物を電子レンジで3〜5分間加熱してアガロースが完全に溶解するまで溶かし、混ぜ合わせます。
2. アガロースは、温度が65°Cに達するまで冷却します。40 mLのアガロース溶液をゲルトレイに注ぎ、ジェルモールドに櫛を加えます。
3. アガロースゲルが完全に固まるまで室温で20〜30分間セットします。その後、くしを取り出し、ゲルをゲルタンクに入れます。
4. ランニングバッファーを追加して、ゲルタンク内のゲルの表面を覆います。
5. RT-LAMPサンプル10μLと6xゲルローディングバッファの2μLを各ウェルに加えます。参照レーンに1kbのDNAラダーの5μLを加えます。
6. カソードに取り付けられた蓋と、電源に接続されたアノードを差し込みます。電源を入れ、一定の100Vに設定し、40分間稼働します。
7. ゲル分離が完了したら、ゲルトレイからゲルを取り出します。その後、エチジウムブロマイド(EtBr)を使用して7分間10mg/mLの濃度で水切りゲルを染色し、蒸留水に5分間レステインします。
   注意:EtBrは有毒であり、発がん性物質とみなされます。したがって、このエージェントを使用する際には注意してください。
8. バンドが現れるゲルドキュメンテーションシステムを使用してゲルをUV光にさらし、ゲルの写真を撮ります。

6. 相補DNA(cDNA)合成

1. 2 μL の 5x RT バッファー、0.5 μL のプライマーミックス、0.5 μL の RT 酵素、および反応ごとに 2 μL のヌクレアーゼを含む cDNA 合成マスターミックスを準備します。
   注:ピペット処理中の潜在的な損失による反応を1倍に含む余分なマスターミックスを準備してください。
2. マスターミックスの5 μLを無菌1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに分配します。
3. 希釈した抽出されたRNA(ステップ2.8から得た)の100 ngを反応管に加え、混合してスピンダウンして、すべての混合物を容器の底に移動させます。
4. 42°Cで60分間インキュベートし、PCR機で5分間98°Cを続けます。cDNAは使用するまで−20°Cで保存してください。

7. RT-qPCR

1. 10 μMリバースプライマーの0.3 μL、10 μMフォワードプライマーの0.3 μL、2x SYBRグリーンDNAポリメラーゼの5 μL、および反応ごとに0.4 μLのヌクレアーゼを含むTiLV qPCRマスターミックスを準備します。次のプライマーとコントロールを使用します。
   フォワードプライマー(TiLV-112F):5'-CTGAGCTAAAGAGGCATATATATAtt-3'
   リバースプライマー(TiLV-112R):5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAGTTCT-3'
2. TiLV qPCRマスターミックスの6 μLを、使用するリアルタイムサーマルサイクラーと互換性のあるqPCRストリップの各ウェルに塗布します。
3. cDNAテンプレートの4μL、陰性対照(ヌクレアーゼフリー水)、陽性対照(10pg/μL)、pTiLV(プラスミド⁾¹⁰または連続希釈されたTiLVプラスミドをウェルに加え、フリックして各サンプルを混合します。各サンプルを三重にして実施します。
4. qPCR 反応をプログラムされたリアルタイムサーマルサイクラーに入れます。3分間95°Cでインキュベーションを行うqPCRプログラムを設定し、温度が0.5°C/5単位で65°Cから95°Cに上昇する必要がある融解曲線ステップの前に、10 sの95°Cと30sの60°Cの40サイクルが続くように設定します。
5. 増幅・融解曲線を評価してデータ解析を行い、連続希釈されたプラスミドを用いてデータから得られた標準曲線を用いてTiLVコピー数を計算します。

結果

本研究では、ティラピアにおけるTiLV感染を検出するためのRT-LAMPアッセイが開発された。試験されたサンプルは、2015年から2016年の間にタイの異なる地域にある14の農場から収集されました。感染した魚と感染していない魚は、主に物理的な診断と症候性TiLVDの出現に基づいてグループ化されました。TiLV感染は、その後、回収プロセス後にRT-PCRを用いて確認された。ランプアンプリコンの評価方法として、アガロースゲル電気泳動と発光緑色の検出を選択した(図2)。感染したティラピア魚の肝臓と粘液は、皮膚の浸食、皮膚の赤み、外眼筋、腹部の腫脹を含むTiLV疾患症状の臨床的出現によって特徴付けられました。以前の報告は、TiLV³⁵の存在を決定する分子診断アッセイにおける肝臓サンプルの使用を実証している。あるいは、粘液は動物を殺すことを避けるのに役立つかもしれないので、アッセイにおいて有益であり得る。結果は、感染した魚の感染した肝臓および粘液サンプルにおけるラダー様DNAバンドパターンと蛍光緑色を示した(

ディスカッション

養殖産業は、継続的に実質的な経済的損失^を引き起こすウイルス感染によって脅かされています^9,23,,28.例えば、新興TiLVは、世界の多くの地域でティラピア生産国に大きな脅威を与えています^1,,6,9.これまで、TiLVDを予防するための特定の治療法はありませんでした。ワクチンの開発が進行中である一方で、効率的なワクチンは商業目的で利用可能になる前にかなりの時間を必要とします。このような状況を考えると、TiLVD^29,30,30の普及を防ぐために、魚農場では消毒剤の適用などの厳格なバイオセキュリティ測定が必要である。現在、TiLV透過を低減するための最...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ティッシュコレクション:
クローブオイル	ベターファーマ	N/A
トリカインメタンスルホン酸	Sigma-Aldrich	E10521	クローブオイル
の代替オプション RNA抽出:
酸性グアニジニウムフェノール系試薬(トリゾール試薬)	サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
酸性グアニジニウムフェノール系試薬(GENEzol reagent)	Geneaid	GZR100
Direct-zol RNA Kit:	Zymo Research	R2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICGカラム
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II 反応バッファー	Biotechrabbit	BR1101301
硫酸マグネシウム (MgSO4)	Sigma-Aldrich	7487-88-9
dNTP set	Bioline	BIO-39053
ベタイン	Sigma-Aldrich	B2629
カルセイン混合物	メルク	1461-15-0
Bst DNA ポリメラーゼ	Biotechrabbit	BR1101301
AMV 逆転写酵素	プロメガ	M510A
ヌクレアーゼフリー水	Invitrogen	10320995
エリート ドライバス インキュベーター、シングルユニット	メジャー サイエンス	EL-01-220<
strong>Gel電気泳動:
Agarose	Vivantis Technologies	PC0701-500G
トリスホウ酸EDTA(TBE)バッファー	Sigma-Aldrich	SRE0062
Tris-acetic-EDTA(TAE)バッファー:
- Tris	Vivantis Technologies	PR0612-1KG
- 酢酸(氷)、EMSURE	メルクミリポア	1000632500
-エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、ベテック	シグマアルドリッチ	V800170-500G
ネオ	グリーンネオサイエンス株式会社	GR107
DNAゲルローディング色素 (6X)	ThermoFisher Scientific Corp.	R0611
DNA ラダーおよびマーカー	Vivantis Technologies	PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)	Bio-Rad	1704487
PowerPac HC 電源	Bio-Rad	1645052
Gel Doc EZ System	Bio-Rad	1708270
UV sample tray	Bio-Rad	1708271
NαBIイメージャー	Neogene Science
cDNA合成:
ReverTra Ace qPCR RTキット	東洋紡	FSQ-101
Viva cDNA合成キット	Vivantis Technologies	cDSK01	cDNA合成の代替オプション
NanoDrop2000(微量分光光度計)	サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)	ND-2000
T100 サーマルサイクラー	Bio-Rad	1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725120
Nuclease-free water, sterile water	MultiCell	809-115-CL
8-tube PCR strips, white	Bio-Rad	TLS0851
フラットPCRチューブ 8キャップストリップ、光学	バイオ・ラッド	TCS0803
CFX96 タッチサーマルサイクラー	バイオ・ラッド	1855196
一般的な機器・材料:
メイヨーハサミ		N/A
鉗子		N/A
Vortex Genie 2 (ボルテックスミキサー)	科学産業
マイクロ遠心分離機 LM-60	LioFuge	CM610
コーニング LSE ミニマイクロ遠心機	コーニング	6765
ピペット	レイニン	ピペットライト XLS
QSP フィルター付きピペットチップ	品質 科学プラスチック	TFシリーズ
コーニング アイソチップ メル	ク	CLSシリーズ
ヌクレアーゼフリー1.5 mL微量遠心チューブ、NEST	Wuxi NEST Biotechnology	615601