方法論記事

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

DOI：

10.3791/61037

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2020年5月1日

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1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、高分子群行の使用を用い、生体内条件に似たヒト肥大型瘢痕組織モデルを作成することを説明する。人間の皮膚線維芽細胞は、高分子環境で栽培すると、色型、生化学、生理学、および瘢痕組織に似た機能特性を示します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体内組織はタンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類などによって非常に混雑することが示されています。次のプロトコルは、高分子群集(MMC)技術を適用して、体性ポリマー(群集機)をインビトロの細胞培養に添加することによってこの生理的混雑を模倣する。Ficollまたはデキストランをクラウダーとして使用した以前の研究は、MMC技術を使用してWI38およびWS-1細胞株におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチンの発現が有意に増強されることを実証している。しかし、この技術は、一次肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞(hHSF)において検証されていない。このプロトコルは、コラーゲンの過剰な沈着から肥大性瘢痕化が生じるため、hHSFを用いたMMC技術を適用することで、コラーゲンが豊富な体外肥肥性瘢痕モデルを構築することを目的としています。この最適化されたMMCモデルは、従来の2次元(2次元)細胞培養系と比較して、生体内瘢痕組織との類似性が高い点が示されている。さらに、動物モデルに比べて費用対効果が高く、時間効率が高く、倫理的に望ましいです。したがって、ここで報告される最適化モデルは、肥大性瘢痕関連研究のための高度な「生体内様」モデルを提供する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

瘢痕組織は、組織修復の終点を表す。しかし、多くの個人、特に火傷や外傷1に苦しむ人では、瘢痕化が過剰であり、治癒した皮膚の形態および機能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。病理的(肥大性瘢痕およびケロイド)瘢痕形成の正確なメカニズムは十分には理解されていないが、創傷治癒時のコラーゲンの過剰な沈着が必須の寄与である2であることが実証された。

成長因子β1(TGF-β1)とα平滑筋アクチン(αSMA)の変換が肥大性瘢痕の形成において重要な役割を果たすのは十分に確立されている。証拠は、上昇したTGF-β1がSMADシグナル伝達経路3を調節することによってコラーゲンの過剰な沈着を直接刺激することを示唆している。また、αSMAは創傷治癒過程4において細胞収縮や再形成を調節することにより肥大性瘢痕形成に寄与することが分かった。インビトロおよびインビボモデルの適切な欠如は、瘢痕修復のための介入および治療法の開発と評価に対する大きな障害である。本研究の目的は、既存のMMC技術を利用して、新たな瘢痕関連の介入を評価するのに適した「生体内に似た」肥大性瘢痕モデルを構築することである。

体外の生体組織を再現する、科学界では何年もの間の目標となってきました。20世紀初頭のインビトロ技術の開発は、この目標を部分的に達成しました。現在のインビトロ技術は、胚細胞が暖かい生理食動物5で数日間生き残ることができるというルーの当初の実証からわずかに進化した。しかし、in vitroの方法論は、主に2次元で培養された単一細胞型に限定され、生体内の組織を正確に再現しない。細胞生化学、生理学、遺伝学を調べるのに役立ちますが、ネイティブ組織は3次元であり、複数の細胞タイプを組み込んでいます。単純な2次元インビトロシステムは、哺乳類細胞を、ネイティブの組織特異的なアーキテクチャが失われる高度に人工的な環境に供する6.これは細胞内および細胞外の事象に影響を及ぼし、細胞の形態、生理学、および行動7に異常をもたらす。

このプロトコルの背後にある関心は、肥大性瘢痕およびケロイドの開発および臨床管理にある。皮膚線維芽細胞が瘢痕組織に存在するコラーゲンの豊富な産生を主に担うことは定評があるが、2次元インビトロ系を用いて皮膚線維芽細胞を培養することは、生体内8で観察されたコラーゲンのターンオーバーを再現することができない。現代のインビトロ法は、生きている組織とは全く異なる環境である「温かい生理学」を依然として本質的に使用しています。生体内の組織は非常に混雑しており、タンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類が総容積の5~40%を占めています。2つの分子が同時に同じ空間を占有することはできないので、利用可能な空きスペースはほとんどなく、水のほとんど完全な欠如9。

MMC技術は、細胞質ゾルおよび間質流体の熱力学的特性に影響を与える制約を課す。分子相互作用、受容体リガンドシグナル伝達複合体、酵素、およびオルガネラは、閉じ込められ、自由に相互作用することから制限される9.細胞内環境(すなわち、インタースティジウム)内の相互作用もまた制約される。最近の証拠は、混和溶液中の高濃度の不活性高分子が拡散を摂動し、物理的な関連、粘度および流体力学的特性10を摂動することを確認している。

興味深いことに、いくつかの一般的な混雑剤(すなわち、フィコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン[PVP]、および4-スチレンスルホン酸ナトリウム[PSS])は、異なる細胞タイプおよび異なる設定に適用すると同等ではない。ある以前の研究では、FicollはPVPと比較して間葉系幹細胞の細胞毒性が低いことが報告されました。これらの結果は、その中性電荷と比較的小さい流体力学的半径11の結果であると解釈された。対照的に、第2の研究は、dextranがFicoll12と比較してヒト肺線維芽細胞によるコラーゲンI沈着を刺激するのにより効果的であることを発見した。我々自身の研究からのデータは、Ficollが肥大性瘢痕由来線維芽細胞によるコラーゲン沈着を増強するのに対し、PVPはこれらの細胞13に対して毒性があることを示唆している。

インビボ環境14では非常に混雑している間にコラーゲンへのプロコラーゲンの変換が速く、希釈された2次元培養系15では生物学的反応速度が遅れることが実証されている。ここでは、MMCを組み込んで、真皮線維症および瘢痕形成のより「インビボ様」モデルとしての役割を果たすように、in vitroプロトコルを最適化しました。一般的な2次元培養系とは対照的に、MMCでhHSFを栽培することは、コラーゲンの生合成および沈着を有意に刺激する13。特に、線維化の他の特徴(すなわち、マトリックスメタロプロテイナーゼ[MmPs]および炎症性サイトカインの発現の増加)も、この最適化されたMMCプロトコル13の下でも明らかである。この方法を用いて培養した場合、真皮細胞が生体内で測定した生理学的、生化学的、および機能的なパラメータを再現することが示される。

最適化されたMMC in vitroプロトコルは、肥大性瘢痕真皮および関係のない隣接する真皮から分離された真皮線維芽細胞によってコラーゲンおよび他のECMタンパク質の発現を評価するために使用されてきた。生体外のMMC環境で栽培した場合、hHSFが生体内の真皮肥大性瘢痕組織と同様に特定の特徴(すなわち、mRNA、生化学、生理学、および表現型)を発現することが観察されている。この証拠は、群集を選択し、体外栽培のためのMMC条件を最適化する際に、物理的および化学的特性が重要な考慮事項であることを示している。

原理の証明のために、MMCプロトコルは、シコニンとその類似体がアポトーシスを誘導する能力を定性的かつ定量的に評価するために、ここで適用される。これにより、真皮瘢痕13を管理するためのこれらの天然由来の伝統的な中国医学(TCM)化合物の潜在的な用途の評価が可能になる。それにもかかわらず、このインビトロMMCプロトコルのシンプルさ、費用対効果、適時性は、EU指令2010/63/EUおよび米国環境保護庁(EPA)による哺乳類の実験を排除するための最近の規制も満たしています。

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プロトコル

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1. 細胞培養

  1. 10%の胎児子牛血清(FCS)および1%v/vペニシリン/ストレプトマイシン溶液(P/S)を含むダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)の非病理学組織(hNSF)に由来するhHSFおよび正常な皮膚線維芽細胞を5%CO/95%のインキュベーターで37°Cで維持する2。
  2. 適切な会社からFicoll 70、Ficoll 400、およびアスコルビン酸を購入してください。

2. MMC肥大性瘢痕モデルの構築

  1. hHSF または hNSF (50,000/well) を、各ウェルに 1 mL のメディアを含む 24 ウェルプレートにシードします。
  2. 5%CO2で37°Cインキュベーターに入2れ、一晩放置します。
  3. MMC メディアを準備します。実験に必要な総容積に基づいて、Ficoll 70(18.75 mg/mL)、Ficoll 400(12.5 mg/mL)、アスコルビン酸(100 μM)を混合して10%のFCS/DMEM培地を製造します。
  4. 混合物を37°Cの水浴に1時間入れて、群発を溶液中に分散させ、0.2 μmフィルターを使用してMMC培地を殺菌します。
  5. 使用済みのメディアを吸引し、作りたてのMMCメディアに置き換えます。
  6. 37°Cおよび5%CO2で6日間培養し、3日2ごとに培地を交換する。

3. コラーゲンの全量の発現

  1. シリウス赤溶液(0.1%w/v)を準備します。1 mLの酢酸で200mLの蒸留脱イオン水(ddH2 O)にダイレクトレッド80パウダー0.2gを溶解します。
  2. MMCメディアを吸引し、各井戸にシリウスレッド溶液の300 μLを追加します。37°Cで90分間インキュベートします。
  3. シリウスレッド溶液を水道水でそっとすすべし、プレートを一晩で空気乾燥させます。
  4. 水酸化ナトリウム(0.1M)を各ウェルに200μL加えてシリウスレッド染色を抽出します。プレートを軌道シェーカーの上に5〜10分間置き、シリウスレッドの汚れを完全に抽出します。
  5. 抽出したシリウスレッド染色の100 μLを96ウェル透明プレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して620nmで吸光度を測定します。

4. コラーゲンI(免疫染色)の発現

  1. 200 μLのリン酸緩衝生理食塩分(PBS、pH = 7.35)を使用してウェルを洗浄します。
  2. 4 °Cでメタノール(500μL/ウェル)を使用して10分間細胞を固定します。
  3. 室温(RT)で30分間、3%のウシ血清アルブミンによる非特異的相互作用をブロックする。
  4. ブロッキング溶液を吸引し、200 μLの抗コラーゲンI抗体(10 μg/mL)をRTで90分間インキュベートします。
  5. 一次抗体を吸引し、3倍をPBSでそれぞれ5分間洗浄します。
  6. 200 μLのヤギ抗ウサギ-FITC二次抗体(1:400希釈)と4'6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI;1:2000希釈)をRTで30分間インキュベートし、アルミニウム箔でプレートを覆います。
  7. 二次抗体とDAPIの両方を廃棄し、3xをPBSでそれぞれ5分間洗浄します。
  8. 顕微鏡下で直接蛍光染色を可視化します。

5. ウェスタンブロッティング

  1. 細胞をPBSで2倍洗います。
  2. 各ウェルに40μLのライシスバッファーを加え、ピペットチップでセル層を削ります。このリシスバッファーには、RIPA バッファー、プロテアーゼ阻害剤カクテル (PIC)、2 mM バナデートナトリウム、および 10 mM フッ化ナトリウムが含まれています。
  3. タンパク質のライゼートをマイクロ遠心チューブに移し、製造業者の指示に従ってタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。
  4. 各グループのタンパク質10 μgを4%~12%のビストリスタンパク質ゲルのウェルにロードします。ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を200Vで30分間実行します。
  5. 90Vで90分間ウェスタンブロットを走らしてタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ゲルとニトロセルロース膜との間に気泡が形成されないようにします。
  6. 10 mLのブロッキングバッファーで膜をブロックします。
  7. 一次抗体を一晩4°Cでインキュベートする。一次抗体は、抗コラーゲンI、抗コラーゲンIII、抗コラーゲンIV、抗αSMA、抗MMP-1、抗MMP-2、抗MMP-13、抗MMP-13、抗グリセアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)です。
  8. 0.1%TBS-Tween 20(5分5分)で膜を洗浄します。TBS/Tween 20(1 L)には、50mLの1 Mトリス(pH = 7.4)、5M塩化ナトリウム30mL、Tween 20の1mL、およびddH2Oの920 mLが含まれています。
  9. 1時間RTで適切な二次抗体を種とインキュベートする。
  10. ステップ5.8を繰り返し、イメージングシステムを用いて蛍光を可視化する。

6. RT-PCR

  1. RNA抽出アッセイキットに含まれる2-メルカプトエタノールと混合したリシスバッファーを使用して、RNA 全体を収集します。
  2. メーカーの指示に従ってRNAを浄化する17.
  3. マイクロボリューム分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
  4. メーカーの指示に従って、cDNA合成キットを使用して最初のストランドcDNA合成を実行します。
  5. RT-PCRオリゴヌクレオチドプライマーは、カスタム96ウェルプレートに提供(プレコーティング)される。カスタマイズされたプレートに10 μLのSYBRグリーンスーパーミックスを使用して、cDNAサンプルの100 ngを混合します。
  6. ddH 2 Oを使用して、総体積を20μL/wellに増やします。
  7. メーカーの指示に従ってサーマルサイクラーを使用してRT-PCRを実行します:15 sの98°Cで変性の40サイクル、60°Cで60°Cでアニーリング/延長60 s。RT-PCRでテストされる遺伝子には、COL1A1、COL3A1、ACTA2、ACTA2スマッド2、スマド3、スマッド4、スCOL3A1マッド7、IL1A、IL1B、IL6、IL8、MMP1、MMP2、MMP3、TGFB1、IL1BおよびVEGFが含まれます。 IL1A IL6 IL8 MMP1 MMP2 MMP3 TGFB1,

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結果

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各実験で三重サンプルを実施し、各実験を3人の個別の患者由来の細胞を用いて3倍ずつ繰り返した。データは、制御グループのパーセントで表されます。一方向の分散分析とTukeyの事後検定は、統計的差異を分析するために適用されました(*p 00.05)。

9%FVOでFicollを用いたMMC(分量占有率)は、hHSF13におけるコラーゲン及びコラーゲンI沈着の総13量を増強する。図1Aに示すように、hHSFの細胞密度は、PVPを用いた対照およびMMCと比較して9%および18%FVOでFicollで培養した後に有意に増加した。図1B,Cは、Ficoll(9%FVOで)他のMMC製剤と比較してコラーゲン(コラーゲンIを含む)の堆積を有意に増強したことを示す。定量分析(図1D,E)は、フ...

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ディスカッション

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このプロトコルは、人間の皮瘢痕組織の改良された:scar-in-a-jar"in vitroモデルを最適化し、認証することを目的としています。これまでの研究では、ヒト肺線維芽細胞12、ヒト骨髄間葉幹細胞23、およびヒト真皮線維芽細胞23に対するMMC技術の応用が報告されており、デキストラン12、Ficoll12、および12PVP23を群集者として用いた。ここで報告された研究では、肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞に関する以前に発表されたプロトコルは、群衆としてFicollまたはPVPで最適化された。

高分子群集の選択と濃度は、同等の結果を生み出さないため、重要なパラメータです。以前の研究では、PVP40(18%FVO)およびPVP360(54%FVO)が真皮線維芽細胞

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開示事項

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著者には利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、シンガポール科学技術庁「SPF 2013/004:皮膚生物学基礎研究」と「熱帯地方創傷ケアイノベーション」IAF-PP/2017(HBMS)H17/01/01/a0/009からの資金提供によって支えられました。著者らは、ポーラ・ベニー博士とマイケル・ラグナート博士からの助言と支援を感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 μm フィルターザルトリウス16534
2-メルカプトエタノールSigma-AldrichM6250
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)サーモフィッシャーサイエンティフィックP36962
アレクサフルオロ 680サーモフィッシャーサイエンティフィックA-21076
アレクサフルオッサー 800サーモフィッシャーサイエンティフィックA-11371
α smooth muscle actin (αSMA) Primary antibodyAbcamab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler) ThermoFisher Scientific4351106
Ascorビン酸Wako#013-12061
ウシ血清アルブミンSigma-Aldrich#A2153
Bradford protein assayBio-Rad500-0006
Collagen I 一次抗体 (免疫染色用)Abcam6308
Collagen I 一次抗体 (ウェスタンブロット用)Abcamab21286
Collagen III 一次抗体Abcamab7778
Collagen IV 一次抗体Abcamab6586
Direct Red 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11996-065
子牛胎児血清 (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
GAPDH 一次抗体Sigma-AldrichG8795
ヤギ抗ウサギ二次抗体Abcamab97050
ヒト肥大型瘢痕/正常線維芽細胞 (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad#1708890
MMP-1 一次抗体Abcamab38929
MMP-13 一次抗体Abcamab39012
MMP-2 一次抗体Abcamab37150
MMP-9 一次抗体Abcamab38898
NanoDrop 微量分光光度計Thermo Fisher ScientificN/A
ニトロセルロースメンブレンBio-Rad10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermo Fisher ScientificNP0321BOX
オデッセイブロッキングバッファーLI-CORバイオサイエンス927–40000
Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR BiosciencesN/A
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunotaining)OlympusN/A
Penicillin/streptomycin solution (P/S)Life Technologies15140-122
PrimePCR AssaysBio-RadCustomized Primeers pre-coated in 96-well plates based on requirement
プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40
RIPAバッファーMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN#74134
バナジン酸ナトリウムSigma-Aldrich450022
ナトリウムvanadateSigma-Aldrich450243
SpectraMax M5 マルチモードマイクロプレートリーダーMolecular DevicesN/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermixBio-Rad#172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904(2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165(2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746(2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

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