方法論記事

多能性幹細胞からのヒトマクロファージの生成と特性

DOI：

10.3791/61038

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2020年4月16日

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1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞からのマクロファージの堅牢な生成とその後の特性評価のための方法を記述する。細胞表面マーカー発現、遺伝子発現、および機能アッセイは、これらのiPSC由来マクロファージの表現型および機能を評価するために使用される。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マクロファージは、ほとんどの脊椎動物組織に存在し、異なる機能を有する広く分散および不均一な細胞集団を含む。彼らは健康と病気の主要なプレーヤーであり、免疫防御中に食細胞として機能し、栄養、維持、修復機能を仲介します。ヒトマクロファージ機能に関わる分子プロセスの一部を研究することは可能であったが、ヒトのマクロファージに遺伝子工学的手法を適用することは困難であることが判明した。これは、マクロファージ生物学に関与する複雑な遺伝的経路を尋問し、特定の疾患状態のモデルを生成する能力を著しく妨げている。したがって、遺伝子操作技術の膨大な武器庫に適した人間のマクロファージの既製の供給源は、したがって、この分野で貴重なツールを提供します。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からマクロファージを生成できる最適化されたプロトコルをvitroで提供します。これらのiPSC由来マクロファージ(iPSC-DM)は、CD45、25F9、CD163、CD169を含むヒトマクロファージ細胞表面マーカーを発現し、当社の生細胞イメージング機能アッセイは、それらが堅牢な貪食活性を示していることを示している。培養されたiPSC-DMは、LPSおよびIFNg、IL4、またはIL10を添加することによって遺伝子発現および貪食活性の変化を示す異なるマクロファージ状態に活性化することができる。このように、このシステムは、特定のヒト疾患をモデル化する遺伝的変化を運ぶヒトマクロファージを生成するプラットフォームを提供し、これらの疾患を治療するための薬物スクリーニングまたは細胞治療のための細胞の供給源を提供する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚性幹細胞(ESC)と誘導多能性幹細胞(iPSC)は、3つの生殖層系統すべての細胞を生成するために分化することができる自己更新細胞源を表します。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、CRISPR-Cas9などのヒト多能性幹細胞(PSC)の遺伝子操作を可能にする技術は、医学研究11、2、3、42,3,4に革命を起こしている。ヒトPSCの遺伝子操作は、目的の第一細胞がインビトロの拡大および/または維持することが困難な場合、またはマクロファージ55、6、7、8、96,の場合のような遺伝的操作が困難な場合に特に魅力的な戦略である。7,8,9ヒトのiPSCは体細胞から派生できるため、ESCに関連する倫理的な制限を回避し、個別化医療を提供するための戦略を提供します。これには、患者固有の疾患モデリング、薬物検査、および免疫拒絶反応および感染のリスクを低減した自己細胞療法686、8、10、1110,11が含まれる。,

iPSCからのマクロファージの生成を記述するプロトコルは、次の3段階のプロセスで構成されます: 1) 胚体の生成;2)懸濁液中の造血細胞の出現;3)末端マクロファージ成熟。

胚体(EBs)と呼ばれる三次元凝集体の形成は、iPSCの分化を開始する。骨形態形成タンパク質(BMP4)、幹細胞因子(SCF)、および血管内皮成長因子(VEGF)が追加され、メソダームの指定を駆動し、新たな造血細胞77、8、9、11、128,9,11,12を支持する。また、EB内の分化細胞は、WntやActivinなどの内因性シグナル伝達経路の活性化も開始します。いくつかの分化プロトコルは、EB形成の段階を通過しません。これらの場合、組換えヒトアクティビンAおよび/またはカイロンなどのWntおよびActivinシグナル伝達調節因子は、単層フォーマット13、14、15,14,15で分化iPSCに添加される。ここでは、EB 形成を使用するプロトコルに焦点を当てます。分化の第2ステップでは、EBは付着面にメッキされます。これらの結合された細胞は、造血および骨髄性前駆腫を含む懸濁細胞の出現を促進するサイトカインにさらされる。これらのインビトロ培養条件において、インターロイキン-3(IL3)は、造血幹細胞前駆細胞形成および増殖16、17、17ならびに骨髄前16駆体増殖および分化18を支持する可能性が高い。マクロファージコロニー刺激因子(CSF1)は、ミエロイド細胞の産生及びマクロファージ19,20,20への分化を支持する。分化の第3段階の間、これらの懸濁細胞は、末端マクロファージ成熟を支持するためにCSF1の存在下で培養される。

ヒトiPSCをインビトロでマクロファージに分化すると、開発中のマクロファージ生産の初期の波を模倣しています。組織居住マクロファージは、胚発生時に確立され、成体単球とは異なる発達系統を有する。いくつかの研究では、iPSC-DMは血液由来単球よりも胎児肝臓由来マクロファージに匹敵する遺伝子シグネチャを有することが示されており、iPSC-DMは組織居住マクロファージに似ていることを示唆している。iPSC-DMは、組織の再モデリングおよび血管新生に関与するタンパク質の分泌をコードする高レベルの遺伝子を発現し、炎症性サイトカイン分泌および抗原提示活動21,22,22をコードする低レベルの遺伝子を発現する。さらに、iPSC-DMは、組織居住マクロファージ23,24,24と同様の転写因子要件を有する。転写因子RUNX1、SPI1(PU.1)、およびMYBに欠損しているノックアウトiPSC細胞株を用いて、BuchrieserらはiPSC-DMの生成がSPI1およびRUNX1依存性であるが、MYB独立性であることを示した。これは、それらが、発達23の間に造形の第一波の間に生成される黄身嚢由来マクロファージに転写的に類似していることを示している。したがって、iPSC-DMは、ミクログリア14、25および25クファー細胞11などの組織居住マクロファージを研究するためのより適切な細胞モデルを表し、組織11修復療法に使用される可能性のあるより望ましい細胞源であることを広く受け入れられている。例えば、マウスESCからインビトロで産生されるマクロファージが、生体内11におけるCCl4誘発性肝傷害モデルにおいて線維化を改善するのに有効であったことが示されている。さらに、これらのESC由来マクロファージは、マウスでリポソームクロドロント11を用いてマクロファージを枯渇させたクッパー細胞区画を再抽出する際の骨髄由来マクロファージよりも効率的であった。

ここでは、ヒトiPSCのメンテナンス、凍結、解凍、およびこれらのiPSCを機能的マクロファージに分化するための、血清およびフィーダーフリープロトコルについて説明します。このプロトコルは、ヴァン・ヴィルゲンブルクらで記述したものと非常によく似ています。2) ROCK阻害剤は、EB形成段階では使用されません。3) 酵素的アプローチではなく機械的アプローチを用いて、iPSCコロニーから均一なEBを生成する。4) EB収穫とめっきの方法が異なる。5)サスペンション細胞は週2回、週単位ではなく、収穫される。6)収穫された懸濁液細胞は、7日間ではなく9日間のマクロファージ成熟のためにCSF1の下で培養される。また、iPSC由来マクロファージ表現型および機能の特性評価に用いるプロトコルについて、遺伝子発現解析(qRT-PCR)、細胞表面マーカー発現(フローサイトメトリー)、機能アッセイを用いて、貪食と分極を評価する。

プロトコル

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注:このプロトコルで使用されるすべての試薬と装置は、材料表にリストされています。培地は細胞培養のために37°Cにする必要があります。分化プロトコルで使用される培地および試薬は滅菌性でなければならない。

1. ヒューマン iPSC ラインの解凍とメンテナンス

  1. 細胞維持培地、増殖因子、その他の試薬を準備します。
    1. ダルベッコの修飾イーグル培地F12(DMEM/F12)をhESCサプリメント、1.8%w/vウシ血清アルブ(ミン(BSA)、0.1 mM 2メルカプトエタノールで補うことで、hESC-血清フリー培地(hESC-SFM;材料表を参照)を準備します。
    2. 無菌0.1%ヒト血清アルブミン(HSA)-リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液にbFGFを溶解することにより、ヒト基礎線維芽細胞成長因子(bFGF)ストック溶液(10μg/mL)を調製。株式溶液を200μLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックbFGFは7日間4°Cで保存することができます。
    3. ローキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)-Y27632ストック溶液(1mg/mL)を滅菌水に溶解して調製します。株式溶液をクライオチューブに50 μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、7日間4°Cで保管することができます。
  2. 希釈幹細胞基質(材料表を参照) 1:50 ダルベックコのリン酸緩衝塩分カルシウムとマグネシウムで。
  3. 希釈した幹細胞の基質溶液を培養プレートに置き、表面積あたりの最終体積が78μL/cm2になるようにします。26ウェルプレートのウェルをコーティングするには、750 μLの溶液を加えます。
  4. コーティングされたプレートを37°Cおよび5%CO2の加湿雰囲気で1時間インキュベート2する。
  5. 幹細胞の基質コーティングを吸引し、20 ng/mL bFGFと10 μM ROCK阻害剤を添加したhESCの1 mLを加えます。
  6. 凍結したヒトiPSC細胞のバイアルを解凍するには、37°Cでバイアルを解凍して解凍し、細胞を5 mL hESC-SFM培地に移します。
  7. 遠心分離細胞は100xggで3分間。
  8. 20 ng/mL bFGFおよび10 μM ROCK阻害剤を補充した0.5 mL hESC-SFMで再中断する。コーティングウェルに細胞を移す。
  9. 培養細胞は24時間用である。
  10. 20 ng /mL bFGFを補ったhESC-SFMにメディアを変更しますが、ROCK阻害剤なし。
  11. 細胞を維持するには、細胞が80%の合流度に達するまで、毎日培地を変更します。未分化iPSCは、通常、80%の合流に達するまでに3〜4日かかります。
  12. 細胞が80%の合流度に達したら、通過細胞。
    1. 20 ng/mL bFGF(ROCK阻害剤なし)を補充した新鮮なhESC-SFMの1.5 mLで使用済み培地を置き換えます。
    2. 培養容器を片手に持ち、使い捨てのセルパッセジングツール(材料表を参照)をプレートを横切って一方向(すなわち、左から右)に転がします。ローラーのすべてのブレードがプレートに触れている必要があります。転がりながら均一な圧力を維持する。
    3. 全体の井戸が覆われるまで、同じ方向に転がりを繰り返します。
    4. 培養容器を90°回転させ、ステップ1.12.2および1.12.3の説明に従って繰り返し転がします。
    5. 使用後にパスツールを破棄します。
    6. 滅菌ピペットを使用して、切断されたコロニーを取り除くために井戸内の媒体を使用する。
    7. 細胞をプレコートされた幹細胞の基質ウェル(ステップ1.2-1.5)に1:4の比率で、ウェルあたり1.5 mLの最終媒体容積(hESC-SFMを補う20 ng/mL bFGF)に移す。

2. ヒトiPSCライン凍結

  1. iPSC細胞を凍結するには、6ウェルプレートの70%~80%コンフルエントウェルの培地を、20 ng/mL bFGFと10 μM ROCK阻害剤を補充したhESC-SFMで交換してください。
  2. 37°Cで、5%CO2で1時間2 インキュベートする。
  3. 細胞通過ツールでコロニーを切断し、遠心分離管に外れたコロニーを配置します。
  4. 遠心分離細胞は100xggで3分間。
  5. 培地を吸引し、細胞凍結保存媒体の1 mLで細胞を再中断する(資料表を参照)。
  6. 細胞を2つの凍結細胞に均等に分け、4°Cの冷蔵前細胞凍結保存容器に入れます。
  7. 細胞を-80°Cで24~48時間保存します。
  8. バイアルを -135 °C 冷凍庫または液体窒素タンクに移します。

3. マクロファージへのヒトiPSC分化

注:マクロファージ分化プロトコルの概略的な要約を図1に示します。

  1. 細胞分化成長因子およびその他の試薬の調製
    1. hESC-SFM メディアを準備します (前のセクションを参照)。
    2. ゼラチンを滅菌水に溶解して、ブタゼラチンの0.1%w/v溶液を調製します。ゼラチン溶液は、最大2年間4°Cで保存することができます。
    3. BMP4を4 mM塩化水素(HCl)-0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒトBMP4ストック溶液(25μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブに50 μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックBMP4は5日間4°Cで保存することができます。
    4. VEGFを0.2%BSA PBS溶液に溶解させることにより、ヒトVEGFストック溶液(100μg/mL)を調製します。株式溶液を10μLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックVEGFは7日間4°Cで保存することができます。
    5. SCFを0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒトSCFストック溶液(100μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブで5μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックSCFは10日間4°Cで保存することができます。
    6. IL3を0.2%BSA PBS溶液に溶解させることで、ヒトIL3ストック溶液(10μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブに500 μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは-20°Cから2年まで保存できます。一度解凍すると、ストックSCFは15日間4°Cで保存することができます。
    7. CSF1を0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒトのCSF1ストック溶液(10μg/mL)を調製します。株式溶液を1 mLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは-20°Cから2年まで保存できます。一度解凍すると、ストックSCFは15日間4°Cで保存することができます。
    8. インターフェロンガンマ(IFNg)、インターロイキン4(IL4)、インターロイキン10(IL10)の10 μg/mLストック溶液を0.2%BSA PBS溶液に溶解して準備します。0.2%BSA PBS溶液に溶解して(100 U/mL)のストック溶液にリポ多糖(LPS)を調製します。各ストックソリューションを35 μLのアリコートとして分配します。-80°Cで2年まで保管してください。一度解凍すると、在庫は7日間4°Cで保存することができます。
  2. ステージ1:胚体の生成(0日目~3日目)
    1. 0日目には、ステージ1メディアの2.25 mL(50 ng / mL BMP4、50 ng/ mL VEGF、および20 ng /mL SCFを補う)を超低い取り付け6ウェルプレートの2つの井戸に加えます。
    2. iPSCの1つの80%コンフルエントウェルのメンテナンスメディアを、ステージ1メディアの1.5 mLで6ウェルプレートに交換します。
    3. 細胞通過ツールを使用してコロニーをカットし、切られたコロニーをピペットで超低添付ファイル6ウェルプレートの2つの井戸に移す(材料表を参照)。
    4. 2日目に、0.5 mLのhESC-SFM培地を使用して、サイトカインを50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、および20 ng/mL SCFの最終濃度にします。
      注:IPSC コロニーは、エブ (図 2A)になります。
  3. ステージ2:懸濁液中の造血細胞の出現
    1. 4日目には、ゼラチンを0.1%w/vで6ウェル組織培養プレートの4ウェルをコーティングし、少なくとも10分間インキュベートします。
    2. ゼラチンを取り除き、ステージ2培地(X-VIVO15に100 ng / mL CSF1、25 ng/mL IL-3、2 mMグルタマックス、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.055 mM 2メルカプトエタノールを添加)
    3. 形成されたEBを50 mL遠心管に集め、重力によって管の底に落ち着くようにします。慎重にメディアを吸引します。
    4. ステージ 2 メディアの 2 mL で EJB を再中断します。
    5. ステージ2媒体2.5mLを含むゼラチンコーティングウェルに10~15個のEB(15個以下)を送ります。
    6. 37°Cおよび5%CO2空気でインキュベー2 トする。
    7. メッキされた EB のメディアを 3 ~ 4 日ごとに 2 ~ 3 週間変更します。
    8. 2~3週間後、EJBは非接着造血細胞を懸濁液に放出し始めます。
      注:この中断細胞放出期間は、細胞株によって異なる場合があり、また、細胞株に依存する。この懸濁液中の細胞は、収穫され、マクロファージに成熟させることができる(ステージ3を参照) (図2A)。
  4. ステージ3:末端マクロファージ成熟
    1. 懸濁造造細胞を収集し、EBプレート上の培地(ステージ2培地)を補充します。
    2. 遠心分離機の懸濁液細胞を200xgで3分間用した。 g
    3. ステージ3培地中の懸濁液細胞を再懸濁(X-VIVO15は100 ng/mL CSF1、2 mMグルタマックス、および1%ペニシリンストレプトマイシンを補充した)。
    4. プレートは、採取し、0.2 x 106細胞/mLの密度で未処理のプラスチック10センチメートル細菌グレードプレート(10 mL)またはコーティングされていない6ウェル組織培養プレート(3mL)に細胞を紡いだ。
    5. ステージ 3 のメディアにセルを 9 ~ 11 日間保持し、5 日ごとにメディアを変更します。
      注:ステージ3のステップ3.4.1~3.4.5は3~4日ごとに繰り返し、元のEBプレートから最大3ヶ月間回収されたサスペンションセルを繰り返すことができます。
  5. マクロファージ偏光
    1. マクロファージをM(LPS+IFNg)表現型に活性化するには、LPS(最終濃度:100ng/mL)とIFNg(最終濃度:10 U/mL)で細胞を48時間刺激します。細胞をM(IL4)表現型に活性化するには、IL4(最終濃度:20 ng/mL)で細胞を刺激します。M(IL10)表現型に活性化するには、IL10(最終濃度:5 ng/mL)でマクロファージを刺激します。

4. iPSC由来マクロファージ品質管理チェック

  1. 血球細胞計でそれらを数えることによって、6ウェルプレートの6ウェルプレートあたりに産生される造血性懸濁液細胞の数を決定する。
  2. 前述のようにマクロファージ形態を評価する(例えば、市販キット染色)8,9.,9
  3. 前に述,べたように遺伝子発現解析およびフローサイトメトリーを用いてマクロファージ特異的マーカーおよび偏光マーカーの発現を検出する。
    1. 6ウェルプレートのマクロファージの1ウェルでフローサイトメトリー実験を行う場合、成熟培地を吸引して細胞を収穫し、2mLのPBSで洗浄し、室温(RT)で5分間の酵素フリー細胞解離緩衝液2mLでインキュベートする。ピペットは、マクロファージを取り外して収穫するために繰り返し上下します。
    2. ヘマトサイトメーターを用いた細胞を数え、2%BSA、0.5 mMエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)-PBS溶液の80 μLで再懸濁します。
    3. MACSヒューマンFCブロッカーの20 μLを追加します。
    4. 氷の上で20分間インキュベートし、光から守ります。
    5. 適切な体積の2%BSA、0.5 mM EDTA PBS溶液を加え、細胞濃度を1 x 106マクロファージ/mLにします。
    6. 2%BSAの100 μLの1x105細胞、対応する抗体を用いた0.5 mM EDTA PBS溶液(下記注を参照)を染色し、光から保護されたRTで15分間インキュベートします。
    7. 1xを2%BSA、0.5 mM EDTA PBSの少なくとも100 μLで洗浄してください。
    8. 2%BSA、0.5 mM EDTA PBSの200 μLで細胞を再懸濁します。
    9. 4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI、希釈1:1,000)を生死染料として加えます。インキュベート 3 分
    10. フローサイトメトリー解析では、主要集団にゲートし、次に単一細胞を、次に生細胞に入れます。生細胞集団では、マクロファージ関連マーカー発現が明らかである(図3A)。
      注:抗体は、マクロファージを導出するために使用される各細胞株について慎重に滴定する必要があります。結果のセクションに示されている抗体は、材料表にあります。SFCi55由来マクロファージフローサイトメトリーアッセイの希釈因子も含まれています。

5. 高スループット食細胞性アッセイ

  1. iPSC由来マクロファージ(iPSC-DM)を収穫し、培地を吸引し、氷冷酵素フリー細胞解離バッファーを添加し、5分間インキュベートして、ピペット処理を繰り返してマクロファージを収集します。
  2. プレート8 x 104 iPSC-DMは、イメージング組織培養グレード96ウェルプレート(例えば、セルキャリアウルトラ、パーキンエルマー)の少なくとも2日前に、ステージ3培地の200μLで高スループットイメージングを行う。
  3. PBSの2 mLで1つのバイアルを再懸濁してpHrodoGreen Zymosan-Aバイオ粒子を調製(「溶液1」)。10 sのための渦液。
  4. PBSビーズ懸濁液2 mLを、より多くのPBSで1:5("溶液2")で希釈します。
  5. 8 sのためのソニッケートソリューション2と10 s.の渦溶液4°Cでそれを保ちます。このソリューションは、ステップ 5.11 で使用されます。
  6. メッキされたiPSC-DMのメディアを取り外し、PBSで洗います。
  7. 1:20希釈してHoechst 33342を含有するPBS溶液を使用してiPSC-DMを染色する。37°Cで20分間インキュベートします。
  8. PBSで細胞を洗います。
  9. 深い赤血漿膜染色を含有するPBS溶液を用いた汚れは1:1,000希釈した(材料表参照)。37°Cで30分間インキュベートします。
  10. PBSで細胞を洗います。
  11. 4°Cに保たれたビーズ溶液を100μLずつiPSC-DMの各ウェルに加えます。プレートはイメージングの準備が整いました。
  12. 高含有画像システムを用いてプレートを画像化し、ウェル全体で3つ以上のフィールドを取得し、ウェルの良好な表現を得る。
  13. コロンバスソフトウェア(高コンテンツイメージング解析システムソフトウェア)を使用して食作用を定量化します。明確な画像バッチ分析のために、特定のアルゴリズムを開発できます。
    1. 青い強度を測定し、青信号が核を示すソフトウェアで定義します。
    2. 赤い強度を測定し、赤信号が細胞質を示していることをソフトウェアで定義します。
    3. 核と細胞質が一緒に細胞に対応することを定義します。
    4. 細胞内の緑色の強度を測定し、細胞を貪食と見なすために厳密なカットオフ/しきい値を確立します。
    5. 細胞毎の食細胞画分と平均食細胞指数を定量化する。ビーズの色の強度はビーズの数に比例するので、貪食活性は、摂取したビーズの数によって測定することができる。
    6. アルゴリズム/パイプラインをすべてのフィールド内のすべての画像に適用し、取得したすべてのタイムポイントで、細胞の貪食能力を決定するための堅牢で公平なバッチアプローチを可能にします。
      注:コロンブスは、細胞のフェノタイピングと機能テストのための細胞セグメンテーション分析を提供する高内容分析ソフトウェアです。

結果

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分化進行、マクロファージ数、形態
提示,された結果は、多くの研究8、9、10、269で説明され、10使用されているSFCi55ヒトiPSC8ラインの分化からである。26マクロファージに対するIPSC分化のプロセスは、光学顕微鏡で監視することができた。iPSCコロニー、胚体(EB)、造血性懸濁細胞、および成熟したマクロファージは形態学的に異なっていた(図2A)。成熟したマクロファージ形態は、遠心分離されたサイトスピン製剤の染色によってさらに検証することができる。IPSC由来マクロファージは大きかったが、小さな楕円形の単一の小さな核と、多くの小胞を含む豊富な細胞質を有していた(図2B)。

造血性懸濁液細胞の最初の2週間は、平均して2.59 x10 6±0.54細胞を含む1つの完全な6ウェルプレートの収穫(16〜28日目)です。28日目以降、平均4.64 x 106 6±0.94の懸濁液細胞を6ウェルプレート当たりに生成した。80日目以降、EBが枯渇するにつれて、サスペンションセルの数が減少し始めました(図2C)。数値が6ウェルプレートの6ウェルプレートあたり収穫ごとに3 x 106前駆体を下回った後、分化プロトコルを停止することをお勧めします。

IPSC由来マクロファージ細胞表面マーカー発現
フローサイトメトリーは、ヒトマクロファージの表現型を評価するために使用される最も一般的な方法です。細胞表面マーカー発現を評価する格言戦略は、サイズや粒度などの物理的パラメータを使用して細胞の主母集団を格数化し、続いて単一細胞を格紙にしてから生細胞を行う(図3A)。成熟したiPSC由来マクロファージは、系統マーカーCD45およびマクロファージ成熟マーカー25F9を発現し、かつ単球/未熟マクロファージマーカーCD93に対して陰性であるべきである。これは我々の観測と一致している(図3A)。IPSC由来マクロファージは、系統骨髄マーカーCD11b、CD14、CD43、CD64、CD115、CD163、およびCD169についても陽性であった(図3B)。これらは免疫変調マーカーCD86に陽性であり、そのわずかな割合がナイーブ状態でCX3CR1、CCR2、CCR5、およびCCR8を発現したケモカイン受容体を発現した(図3B)。プロットは、私たちの研究室8によって以前に公開されたデータから得られました。

iPSC由来マクロファージ食前細胞症と分極化
宿主防御および組織恒常性におけるマクロファージの主要な特徴の1つは、病原体、アポトーシス細胞、および破片27を貪食する能力である。食細胞化の割合は、特定のフェノチの状態28と密接に関連している。iPSC-DM貪食能を評価するために、パーキンエルマー・オペレッタ顕微鏡とpHrodo Zymosan生体粒子(pH感受性色素共役体)を利用した高含有イメージングシステムアプローチ8,8,9,1111を用いた。9培養物に添加すると生体粒子は非蛍光性であったが(図4A)、細胞内酸性pH中で明るい緑色に蛍光を発した(図4B)。ライブイメージングオペレッタ顕微鏡は、ビーズを添加した後5分ごとに、合計175分間の画像化に設定しました。高スループットと偏りのない画像分析パイプラインは、その後、ビーズを貪食した細胞の割合を表す貪食画分と、各細胞が摂取したビーズの数の尺度である貪食指数の観点から活性を定量化するために、コロンブスのプラットフォームで使用されました。

マクロファージは、環境の手掛かりに応じて表現型に応答し、変更することができます。iPSC-DMは、環境刺激に反応し変化する能力を評価するために、LPSおよびIFNg、IL4、またはIL10で処理することができます。48時間の治療の後、彼らは表現型を変更し、本明細書において、M(LPS+IFNg)、M(IL4)、およびM(IL10)と称し、それぞれ29。遺伝子発現解析は、マクロファージの偏光状態をテストするのに有用なツールです。LPSおよびIFNg刺激に際して、マクロファージはCD40、VCAM1、VCAM1およびTNFAの遺伝子のmRNA発現をアップレギュレートした(図5A)。IL4刺激の際、細胞は遺伝子CD68、CD84、MRC1のmRNAMRC1 発現をアップレギュレートした(図5B)。 CD84IL10刺激の際、IPSC-DMはMRC1の発現をアップレギュレートする(図5B)。食性食症の観点から、LPS+IFNgまたはIL4で処理したマクロファージは、ナイーブマクロファージと比較して食細胞の割合が有意に低かった。IL10で処理したiPSC-DMは、貪食細胞および貪食指数の割合の増加を示した(図5C–E)。

iPS細胞のマクロファージへの分化;フロー図;BMP4、VEGF、SCF、IL3、CSF1プロトコル。
図1:成熟した機能的マクロファージへのiPSC分化のグラフィック要約バイオレンダーで描かれた図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

細胞分化プロセス:顕微鏡画像、細胞培養。成長チャートには、前駆体番号が表示されます。
図2:マクロファージおよびiPSC-DM数および形態に対するiPSC分化(A)から得られた明視野画像(左から右):IPSCコロニー、胚体(EB)、採取された懸濁液細胞、および成熟したマクロファージ。スケールバー= 100 μm(B)Kwik-diffキットで染色したマクロファージサイトスピンの画像。スケールバー= 25 μm。(C) 1回の収穫当たりに回収された懸濁細胞数 6 ウェルプレートのエブプロットは平均+ SEMを示します。(n=6生物学的に独立した実験)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

免疫解析のための細胞選別プロセスと系統マーカーヒストグラムを含むフローサイトメトリー図。
図3:マクロファージ細胞表面マーカー表現型。(A)成熟したiPSC由来マクロファージの分析のためのギャティング戦略。単一の生細胞をゲートし、次いで細胞表面マーカーCD45、CD93、および25F9の発現について分析した。細胞表面マーカーのゲートは、蛍光マイナス1(FMO)コントロールを使用して描かれた。(B) iPSC-DM(青)およびアイソタイプコントロール(グレー)の単染色に対する代表的なフローサイトメトリーヒストグラム(系統および骨髄マーカー、免疫変調マーカー、成熟マーカー、ケモカイン受容体)プロットは、CD105およびCD206(n = 3)を除く、すべての系統および骨髄マーカーに対するn= 5生物学的に独立した実験を表す。成熟マーカー(n = 5);免疫変調マーカー (n = 3);そしてケモカイン受容体(n=3)プロットは、以前にパブリッシュされたデータを使用します8.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

顕微鏡画像、食作用画分、および経時的なインデックスチャートによる食作用プロセス。
図4:IPSC-DM分極化および貪食アッセイ。iPSC-DM(A)の代表的な画像は、ザイモサンpHrodoグリーンビーズの添加直後とビーズのB添加後175分。青は細胞の核を表す。赤は細胞の細胞質を表す。緑色は、摂取されたビーズ(スケールバー= 20 μm)を表します。(C)貪食マクロファージの割合および(D)ナイーブ状態の経時的な過ぎの貪食性マクロファージ当たりの貪食指数/緑色強度(n=6生物学的に独立した実験)。プロットは平均値を示し、棒はSEMを表し、プロットは以前にパブリッシュされたデータ8を使用します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

マクロファージにおける遺伝子発現解析;棒グラフ、共焦点顕微鏡、食作用グラフ。
図5:iPSC-DM偏光状態の評価ナイーブおよび偏光iPSC-DMのRT-PCR分析の相対定量化 (A) M(LPS+IFNС) の発現を評価する;(B) M(IL4) および M (IL10) 関連遺伝子 (n = 6 生物学的に独立した実験;一方向のANOVAとホルム・シダックの多重比較は、テスト後に行います。偏光基は、ナイーブグループのみと統計的に比較した。プロットは平均値を示し、誤差範囲は標準偏差を表します。プロット内のND = 転写は検出されません。これらのプロットのデータは、以前に公開されました 8 .(C) iPSC-DM の代表的な画像 (左から右) で処理された iPSC-DM から pHrodo ビーズを添加した後の 175 分: サイトカインなし、 LPS+IFN-Y, IL-4, IL-10 (スケールバー = 20 μm)。(D) 貪食性マクロファージの画分および(E)ビーズの添加後175分のナイーブおよび偏波マクロファージ治療における貪食性マクロファージ当たりの貪食指数/緑色強度(n = 12生物学的に独立した実験、片道ANOVAおよびホルム・シダックの複数比較後試験後)偏光基は、ナイーブグループのみと統計的に比較した。プロットは平均値を示し、誤差範囲は標準偏差を表します(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明するiPSC-DMの生成プロトコルは堅牢であり、比較的少数のiPSCから多数の同種細胞を生産することができます。最初の分化により、10個のiPSCが最初に分かれた後、その後の培養物を2~3ヶ月間4日ごとに収穫することができ、その結果、その間に少なくとも6.5 x 107マクロファージが生産されます。これらのインビトロで生成されたヒトマクロファージは、ヒトの主要マクロファージと形態的に類似しており、主要なマクロファージ細胞表面マーカーを発現し、貪食活性を示す。マクロファージ分化のプロトコルは再現可能であり、他のhiPSCおよびhESC細胞株にも適用できますが、マクロファージ前駆体の最初の収穫の正確なタイミングと生成可能な細胞の絶対数はiPSCラインによって異なります。

マクロファージは、遺伝子操作されたiPSCから生成できることが実証されています。例えば、構成CAGプロモーターの制御下にある蛍光レポーターZsGreenからなるトランスジーンカセットをSFCi55 iPSC線のAAVS1遺伝子座に挿入し、その後、このiPSC線をZsGreen発現マクロファージ8に分化できることが示された。これらの蛍光マクロファージは、将来的に疾患モデルにおける治療的マクロファージの移動および安定性を追跡するために使用することができる。別の研究では、マクロファージは、タモキシフェン誘発転写因子KLF1を発現するために遺伝的に操作されたiPSCラインから生成された。iPSC由来マクロファージにおけるKLF1の活性化は、エリスロイド島9のマクロファージに匹敵する表現型を有するマクロファージの産生をもたらした。潜在的に、この戦略は、iPSC由来のマクロファージを、皮膚の肝臓またはランゲルハンス細胞のクファー細胞のような他の組織特異的マクロファージ集団に関連する表現型に遺伝的にプログラムするために使用することができる。これは、これらの細胞タイプを定義する主要な転写因子が特定されれば可能です。

プロトコルの観点から言えば、iPSCの母集団の開始状態が分化を成功させるために重要であることに注意することは非常に重要です。ヒトのiPSC培養は、いくつかの通路にわたって、典型的に異常な亜集団でオーバーランする可能性があるため、iPSC株やゲノム品質管理を受けた大型バッチマスター株の堅牢なキュレーションが推奨されます。ここで説明するメンテナンスプロトコルは、連続培養で最大2ヶ月間、通常のiPSCを維持することができますが、これは細胞株や研究室によって異なる場合があります。問題が発生した場合は、各分化実験に未分化iPSCのフレッシュバイアルを使用することをお勧めします。また、未分化iPSCの開始培養は、80%以下のコンフルエントでなければなりません。EBめっき段階では、6つのウェル組織培養プレートのウェルあたり10〜15個のEBのみをメッキする必要があり、これらのEBが井戸全体に均等に広がることは重要です。井戸の中央にあるEBの数が多いり、塊状の脳が発生するマクロファージの数に悪影響を及ぼしました。コーティングされた培養プレートの表面へのEBの接着を妨げないように、培地を補充し、EB培養物から単球様前駆細胞を収穫する際には注意が必要です。採取した造血用懸濁液細胞の数は、収穫のたびに徐々に増加し、40~72日目の分化の間で最適な生産を行う(図2)。生産は68日目以降に徐々に減少し、プレートは2.5ヶ月後に排気する傾向がありますが、正確なタイミングはiPSCラインによって異なる場合があります。

我々のプロトコルの1つの制限は、ステージ2の終わりに生成された造血性懸濁液細胞を凍結保存することは不可能であった。WNTの外因性活性化に依存するプロトコルは、凍結保存後の回復率を約40%報告するが、これらのプロトコルは1つの細胞収穫のみを報告するので、生成されるマクロファージの絶対数は低い30である。ここで説明するプロトコルは、脳の形成を介して内因性シグナル伝達を誘導し、隔週に収穫することができ、はるかに高い総マクロファージ収量を生み出す。

要約すると、機能性iPSC由来マクロファージの生産に関する詳細なプロトコルを提示する。iPSC由来マクロファージを用いて、健康と疾患のマクロファージ生物学を研究するためのインビトロ実験を設定することは、単球由来マクロファージ(MDM)の実験に対して多くの利点があります。これらの利点は、材料へのアクセスの容易さ(例えば、ドナーが必要とされない)、非常に大量のマクロファージを産生することができ、そして遺伝子組み換えマクロファージを産生することは現実的で比較的簡単である。さらに、iPSC由来マクロファージは、組織常駐マクロファージ生物学の研究のためのより良いリソースである可能性があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フィオナ・ロッシとクレア・クライアーのフローサイトメトリー、エオガン・オドゥイビール、ベルトラン・ヴェルネイの顕微鏡観察に感謝します。この作品は、CONACYT(M.L.-Y.)、ウェルカムトラスト(102610)、イノベート英国(L.M.F)、ウェルカムトラスト博士課程(A.M)、MRC精密医学学生(T.V)によって資金提供されました。L.C.とJ.W.P.はウェルカムトラスト(101067/Z/13/Z)、医学研究評議会(MR/N022556/1)、コストアクションBM1404 Mye-EUNITER(http://www.mye-euniter.eu)によってサポートされました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノール (50 mM)Invitrogen31350010
Abtibody CD64-APC -CY7Biolegend305026希釈係数:1:100
抗体 25F9-EFLUOR 660Ebioscience15599866希釈係数:1:20
抗体 CCR2-PE-Cy7Biolegend357212希釈係数:1:100
抗体 CCR5 PEBiolegend313707希釈係数:1:100
抗体 CCR8 PEバイオレジェン360603希釈係数:1:100
抗体 CD11b-PEバイオレジェン301305希釈係数:1:50
抗体 CD14-APCEbioscience10669167希釈係数:1:20
抗体 CD163-PE-CY7バイオレジェン333614希釈係数:1:25
抗体 CD169-APCバイオレジェン346007希釈係数:1:25
抗体 CD206-PEバイオレジェンド321106希釈係数:1:100
抗体 CD209-PE-CY7バイオレジェン3310114希釈係数:1:100
抗体 CD274-PE-CY7バイオレジェン329718希釈係数:1:100
抗体 CD43-PEEbioscience10854419希釈係数:1:100
抗体 CD45-APCEbioscience15577936希釈係数:1:20
抗体 CD86-APCバイオレジェンド305412希釈係数:1:100
抗体 CD93-PEEbioscience10804637希釈係数:1:100
抗体 CX3CR1-PEバイオレジェン307650希釈係数:1:100
抗体 HLA-DR-BV650バイオレジェンド307650希釈係数:1:100
Antiboy CD115-PEBiolegend347308希釈係数:1:40
細胞解離バッファー、酵素フリーThermofisher13151014
Cell Dissociation Buffer、酵素フリー、PBSGibco13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates、組織培養処理済み、黒色、96 ウェルPerkinElmer6055302
CellMask Deep Red Plasma Membrane StainThermofisherC10046凍結保存培地
Cryostor CS10SigmaC2874
CTS CELLstart SubstrateInvitrogenA1014201Stem Cell Substrate
DAPIMerckD9542-1MG最終濃度 1 μg/mL
DPBS、カルシウム、マグネシウム(500 mL)サーモフィッシャー14040091
FcR ブロッキング試薬、ヒトMACS Miltenyi Biotec130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) 組換えヒトタンパク質サーモフィッシャーPHG0021
GlutaMAX サプリメントサーモフィッシャー35050061
ヒト組換え IFNYサーモフィッシャー14-8319-80
ヒト血清 AlbuminumIrvine Scientific9988
大腸菌からのリポ多糖類 (LPS)SigmaL2630
NucBlue (Hoechst33342)ThermofisherR37605
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for PhagocytosisThermofisherP35365
ブタ スキン ゼラチンシグマG9136
組換えヒト BMP4 タンパク質R&D314-BP-010
組換えヒト IL10Preprotech200-10
組換えヒト IL3Preprotech200-03-10
組換えヒト IL4Preprotech200-04
組換えヒト MCSF (キャリアフリー) 100 μgBiolegend574806
組換えヒトVEGFタンパク質R&D293-VE-010
岩石阻害剤 Y-27632メルクSCM075
SCF (C-Kit リガンド) 組換えヒトタンパク質サーモフィッシャーPHC2111
StemPro hESC SFMサーモフィッシャーA1000701
StemPro EZPassage ディスポーザブル幹細胞継代ツールサーモフィッシャー23181010
超低アタッチメントプレート:細胞培養マルチウェルプレート、6ウェル、Cell Star細胞忌避剤表面Greiner657970
UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0Invitrogen15575020
X-Vivo 15 500 mL bottleLonzaBE02-060F
ド ドド ドドドド

参考文献

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iPSC CD45 25F9

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