方法論記事

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

DOI：

10.3791/61050

⸱

2020年11月17日

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。

要約

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多発性硬化症(MS)は、環境要因と遺伝的背景の影響を受けやすい遺伝的背景の組み合わせによって引き起こされる中枢神経系(CNS)の自己免疫疾患である。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、ミエリン抗原に特異的なTリンパ球がCNSで炎症反応を起こさせる病因を調べたりするために広く使用されているMSの典型的な疾患モデルである。CNSのリンパ球が疾患の発症をどのように調節しているかを評価することは非常に重要です。しかし、脳から浸潤したリンパ球の分離と検出が困難なため、CNS内の浸潤リンパ球の量と質を測定するアプローチは非常に限られています。この原稿は、CNSからの浸潤リンパ球の単離、同定、および特徴付けに有用であり、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを理解するのに役立つプロトコルを提示する。

概要

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CNSの慢性脱髄疾患として、MSは世界中で約250万人に影響を及ぼし、治癒的治療を欠いている1.また、自己免疫疾患と考えられ、その中でミエリン抗原特異的Tリンパ球が炎症反応を起こし、CNS2において脱髄および軸索損傷を引き起こす。2実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、CNS3における古典的な自己免疫脱髄疾患モデルとしてMSの病原性メカニズムを調査するために広く使用されてきた3。EAEを誘導する方法は2つあり、1つはミエリン成分で動物を免疫することによってEAEを積極的に誘導し、もう1つは脳原性T細胞を受容体22、4、54,5に移すことによって養子転移することである。EAEへの感受性は、異なる動物株6で異なっている。C57BL/6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロキ酸糖タンパク質(MOG)35~55チャレンジは、CNSにおける広範な脱髄および炎症を伴う単相性疾患を誘発し、遺伝子標的マウスの実験で頻繁に使用される7。

ミエリン特異的反応性T細胞の生成は、EAEにおける疾患の発生および発症に必要であり、EAEおよびMS.活性化自己反応性Tリンパ球が血液脳関門(BBB)を健康なCNSに横断し、EAE疾患を開始する免疫学的徴候である。MOG 35-55 Agが発生すると、これらのTリンパ球は炎症を誘発し、CNSにエフェクター細胞を動員し、脱髄および軸索破壊88,99を生じる。EAEモデルでは、神経抗原特異的CD4+T細胞が神経炎症および病理3,3,10を開始し、持続することができるという十分な証拠がある。産生される主要なサイトカインに応じて、CD4+Tリンパ球は異なるサブセットに分類されている:Th1(インターフェロンγの産生によって特徴付けられる)、Th2(インターロイキン4の産生によって特徴付けられる)、およびTh17(インターロイキン17の産生によって特徴付けられる)。Th1およびTh17細胞の活性化は、マクロファージを活性化し、病変を加速させるために炎症性部位に好中球を求めることができるエフェクターサイトカインIFN-γおよびIL-17を分泌することにより、EAEおよびMSにおける炎症性脱髄の誘導、維持、および調節に寄与すると考えられている。

自己反応性T細胞は、CNSにBBBを横断し、MSおよびEAEにおける疾患の発症を誘導するので、CNS内のT細胞を分析することは非常に重要である。しかし、CNS12からリンパ球を単離するための確立されたプロトコルはほとんどありません。そこで、単核細胞を脳から単離し、Cd45、CD11b、CD3、CD4、INF-g、およびIL-17のフローサイトメトリーを用いてTリンパ球を解析するための最適化された方法を開発した。この方法では、MOG35-55アジュバント結核 菌 H37 Raおよびペルタシス毒素ワーキングソリューション(PTX)を用いて、マウスにおけるEAEの活性免疫モデルを誘導する。そして、CNS単核細胞の単一核細胞の単離に機械的分離及び密度勾配遠心分離法が用いられる。最後に、最適化されたフローサイトメトリー測定の測定戦略を使用して、複数のマーカーを染色することによって脳からTリンパ球およびサブセットを同定する。

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プロトコル

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ここに記載されているすべての方法は、上海交通大学基礎医学部の動物委員会によって承認されています。

1. 材料の準備

  1. MOG35–55のMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK配列を使用して、市販の供給源から凍結乾燥ペプチドを得る。ペプチドの純度が>95%であることを確認してください。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で10 mg/mL MOGストック溶液を調製し、-20°Cで保管します。
  2. 完全フロイントのアジュバント(CFA)の25 mLにM.結核H37 Raの100mgチューブを入れて混合することにより、M.結核H37 Raの4mg /mLストック溶液を調製します。ストック液は-20°Cで保管してください。
  3. 50 mLのPBSにPTXを50 μg加えて、1 ng/μL ペルタシス毒素作動溶液(PTX)を準備します。作業溶液を-20°Cに保存してください。
  4. すべての抗体(すなわち、FITC抗マウスCD3、PE/Cy7抗マウスCD4、PerCP/Cy5.5抗マウスCD11b、アレクサFluor700抗マウスCD45.2、PE抗マウスIL-17A、およびAPC抗マウスIFN-γ)を°4°Cに保存します。
  5. フローサイトメトリー染色(FCS)バッファーに2 mMエチレンダイアミンテトラ酢酸(EDTA)と1%ウシ胎児血清(FBS)をPBSの500 mLに加えて下します。

2. C57BL/6マウスのハウジング

  1. 8~12週齢の雌のC57BL/6マウスを使用してください。
  2. C57BL/6Jマウスは注射前に少なくとも7日間順応した。
  3. 12時間の明暗サイクルで一定の温度と湿度で病原体のない状態で動物施設にマウスを収容し、水と標準的なペレット食品への無料アクセスを提供します。

3. C57BL/6マウスの予防接種

  1. 完全な水分補給を確実にするために、室温(RT)で15分間すべてのストックソリューションを残してください。
  2. 3 mg/mL作業用溶液を調製するために、700 μLのPBSを用いた300 μLのMOGペプチドストック溶液を希釈。
  3. 1 mLの 結核 H37 Raストック溶液と1 mLのMOG35-55ペプチド作動溶液を別々の10 mLシリンジに入れ、4方向停止コックを使用して少なくとも10分間乳化します。射出前に完全な乳化を確認してください。
  4. EAEのピーク時に、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。
  5. 1 mL シリンジを使用すると、マウスに 100 μL の MOG 35-55/CFA エマルジョン(300 μg/200 μL)を 2 つの部位(両方とも首付近)に注入します。皮下に200μLのPBSでコントロールマウスを注入する。
  6. 同じ日(0日目)と2日目の予防接種後(PI)に、腹腔内に200μLの1ng/μL PTX働く溶液をマウスに注入する。腹腔内に200μLのPBSを用いてコントロールマウスを注入する。
  7. マウスを温かいパッドで自宅のケージに移します。
  8. 注射後毎日全てのマウスを、表11,13,13に示す神経学的徴候について盲目にして評価する。スコアがグレード4よりも悪い場合は、動物を安楽死させます。
  9. 病気の経過中に体重変化を記録します。これは、EAEモデル11,13,13における疾患活動に対する貴重な追加措置である。
  10. 個々のマウスの臨床徴候の最初の日を追加し、グループ内のマウスの数で除算します。結果は発症です。個々のマウスの最大 EAE スコアの最初の日を追加し、グループ内のマウスの数で除算します。結果はピークになります。

4. 脳からの単細胞懸濁液製剤

  1. 15 mL円錐管でPBSと9:1の比率で希釈密度勾配培地は、最終的な100%溶液を得る。
  2. EAEのピーク時に、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔し、20mLの無菌氷冷PBSで心内浸透する。20 mLの注射器を使用して心臓の左心室にPBSをゆっくりと着実に注入し、右心房を開くことで、これを達成します。
  3. 鼻から首まで頭蓋骨を慎重に切り、頭蓋箱から脳を50 mLの円錐管でRPMIの10 mLに取り除きます。接着性の赤血球を除去するためによく混ぜます.その後、吸引によって培地を取り出し、10 mLのRPMIを加えます。
  4. 100 mm皿に脳と媒体を入れます。カミソリの刃で細かく刻みます。
  5. 皿から6 mLをきれいなピペットで冷たい7 mL焼結ガラスホモジナイザーに移します。ピペットに大量の組織を残さないようにしてください。少量は避けられない。
  6. 最初に害虫の「緩い」プランジャーを使用して脳を粉砕し、懸濁液が均質になるまで「タイト」プランジャーを使用し、プレチルド15 mL円錐管に注ぎ、氷の上に置きます。
  7. すべてのサンプルが均質化された後、体積を推定する。RPMIで音量を7mLに調整します。その後、冷たい15 mL円錐形遠心分離管に氷冷100%基底膜マトリックスを3 mL入れ、脳ホモジネートの7 mLを加えて最終的な30%密度勾配培地を得る。反転によって数回混ぜる。渦を出さないで下ろしてください。
  8. 鋭利なインターフェースを確保するために、3 mLピペットを使用してRPMIに70%アンダーレイ密度勾配媒体の1mLを慎重かつゆっくりと加えます。
  9. 遠心分離機は800xgで4°Cでわずか20分。 g 加速度を 1 に設定し、減速を 0 に設定します。遠心分離後、上部のほぼすべての段階を吸引し、上部のミエリンを完全に除去するように注意する(図1)。
  10. 新しい15遠心管にインターフェースを取り外します。RPMIで音量を10 mLに調整します。
  11. 500 x g で 10 分間の遠心分離機。遠心分離後、上清を吸引する。フローサイトメトリー染色(FSC)バッファーの約200 μLでペレットを再懸濁します。ペレットは、FACS のために染色する準備ができています。

5. 脳からの単一細胞のフローサイトメトリック解析

  1. 細胞を数えるために、ヘモサイトメーターと顕微鏡を使用してください。細胞の10 μLを10 μLのトリパンブルーに加え、よく混ぜ合わせ、ヘモサイトメーターに10 μLを置いて細胞を数えます。次に、転写顕微鏡(例えば、オリンパス反転顕微鏡)の下でマイクロリットル当たりの生細胞数を計算する。
  2. アリコート約2 x 106 の細胞をRPMI中の96ウェルプレートの単一ウェルにする。
  3. 500x細胞刺激カクテルとタンパク質輸送阻害剤を井戸に加えます。
  4. 37°Cでインキュベーターにプレートを4時間インキュベートします。
  5. RTで5分間400 x g の細胞を遠心分離します。
  6. 抗マウスCD16/CD32 Fcブロック(1:33)で細胞を4°Cで10分間培養してから、非特異的なFc媒介相互作用をブロックする染色を行います。
  7. 洗浄せずに細胞表面マーカーを染色する。抗マウスCD45.2(1:200)、抗マウスCD11b(1:200)、抗マウスCD3(1:200)、抗マウスCD4(1:200)抗体を加える。
    注:正と負のゲートを決定するには、各色とアイソタイプコントロール抗体の蛍光マイナス1(FMO)を染色する必要があります。
  8. 4 °Cまたは氷上で30分以上プレートをインキュベートします。光から守る。
  9. FCSバッファーを追加して細胞を洗浄します。マイクロティタープレートには200 μL/wellを使用してください。遠心分離機 400 x g で 5 分間 RT. 上清を捨てます。
  10. 細胞内(IC)固定バッファーを200μLずつ各ウェルに加えて、細胞を固定します。セルが溶液内で完全に再懸濁されていることを確認します。
  11. RTで30〜60分をインキュベートします。
  12. サンプルをRTで400 x g で5分間遠心します。上清を捨てます。
  13. 各ウェルに200 μLの1x透過性バッファーを加え、サンプルをRTで400 x g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
  14. 残留容積のペレットを再中断し、1xパーメアビライゼーションバッファーで約100 μLに調整します。
  15. 細胞内抗原を検出するための抗マウスIL-17A(1:200)および抗マウスIFN-g(1:200)抗体を追加します。
  16. 4°Cで30分以上インキュベートする。 光から守る。
  17. 各ウェルに1x透過バッファ100 μLを加え、サンプルをRTで400 x g で5分間遠心します。上清を捨てます。
  18. 染色した細胞を100μLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁します。
  19. フローサイトメトリーで分析する。
    注:フローサイトメーターのレーザーと補償の設定が調整され、サンプルがサイトメーターに配置され、すべてのイベントがメーカーの推奨事項に従って記録されます。

6. データ分析

  1. FSC-A 対 FSC-H および SSC-A 対 SSC-H を使用するゲート シングル。
  2. サイズに基づいてFSC-AとSSC-Aを使用して生細胞をゲートします。
  3. 次に、単球を除く白血球を、CD45+CD11b-細胞上で+格子化して同定-する。
  4. 次に、CD3+CD4+細胞上でのGATによるCD4Tリンパ球の同定を行う。
  5. 最後に、IFN-γ+細胞とIL-17+細胞を個別に行い、Isotype コントロールと FMO を使用して正と負の集団を決定することにより、Th1 および Th17 サブセットを特定します。

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結果

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C57BL/6マウスの免疫化後、すべてのマウスを体重を量り、検査し、神経学的徴候について毎日採点した。EAEの代表的な臨床コースは、図2Aに示された疾患曲線と、図2Bに示すようにマウスの体重の変化をもたらすべきである。MOG35-55で免疫したC57BL/6マウスは、通常10~12日目頃に疾患症状を発症し始め、活動的な免疫後15~21日目頃に疾患のピークを達成した(図2A)。重量変化はEAEモデルの貴重な指標でした。疾患の発症前に、免疫されたマウスの体重は徐々に増加し、その後、典型的には増加する疾患症状に関連して減少した。EAEのピーク時には、マウスも最低の体重を示した(図2B)。その後、臨床症状が減少するにつれて体重はわずかに回復した。しかし、マウスは通常完全に回復しなかった。C57BL/6マウスは、MOG35-55チャレンジの際に単一性慢性疾患病理を発症した(

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ディスカッション

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本研究は、C57BL/6マウスにおけるMOG35-55を用いてEAEを誘導および監視するプロトコルを提示し、これはMS.EAEの典型的な神経免疫学的実験動物モデルと考えられる。例えば、SJLマウスでPLP139-151ペプチドを使用すると、再発症15に対する治療効果の評価に特に適した再発性EAE疾患コースを誘発し得る。ここで概説する実験手順は、他のEAEプロトコル7にも適用できます。このモデルでは、C57BL/6マウスをMOG35-55ペプチドで免疫し、単橋疾患を発症する。EAEの重大度を評価するために5点のスコアリングシステムが使用される。0~3ポイントまたは0~10ポイントのスコアリングシステムが用いられ、疾患の重症度が7、16、1716,17に達していますが、これらの結果は、5点スコアリングシステムがグループと他のEAEスコアリングシステム間の疾患スコ...

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開示事項

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著者は宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国立自然科学財団助成金(31570921からZJ、81571533からLS)、上海市保健家族計画委員会(201540206からZJ)、瑞津病院ノース研究助成金(2017ZX01からZJ)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor700 抗マウス CD45.2eBioscience56-0454-82
抗マウス CD16/CD32 Fc ブロックBioLegend101302
APC 抗マウス IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce ホモジナイザーウィートン353107542
eBioscience 細胞刺激カクテル (およびタンパク質輸送阻害剤) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience Intracellular Fixation &透過化バッファーセットeBioscience88-8824-00
FITC 抗マウス CD3BioLegend100203
FITC ラット IgG2b, κアイソタイプ・コントロール抗体BioLegend400605
フロイント・アジュバント・コンプリート (CFA)Sigma-AldrichF5881
マウス IgG2a κ アイソタイプ・コントロール (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
結核菌 H37 RaDifco Laboratories231141
PE 抗マウス IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 抗マウス CD4BioLegend100422
PE/Cy7 ラット IgG2b, &κ;アイソタイプ制御抗体BioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 抗マウス CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 ラット IgG2b, &κ;百400631BioLegend
PTX)Sigma-AldrichP-2980
ラットIgG1 κアイソタイプコントロール(eBRG1)、APC、eBioscienceeBioscience17-4301-82
ラットIgG2aカッパアイソタイプコントロール(eBR2a)、PE、eBioscienceeBioscience12-4321-80
ラットMOG35–55ペプチドBiosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
日咳毒素アイソタイプコントロール抗体(

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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MOG 35 55C57BL 6

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