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方法論記事

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

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DOI：

10.3791/61061

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2020年8月27日

 ,  , 
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

この記事について

サマリー

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

要約

ショウジョウバエ 精巣は、幹細胞生物学、核アーキテクチャ、微膜および精子の発生を含む生物学的プロセスを研究するための強力なモデルシステムです。しかしながら、 ショウジョウバエ 精巣全体の免疫標識は、抗体の浸透による染色の有意な不均一性と関連していることが多い。押しつぶされた準備は、解析の3D品質を低下させるので、部分的に問題を克服するだけです。本明細書において、我々は、液体媒体中の免疫標識と共に固定中にNP40およびヘプタンを用いた全実装プロトコルについて述べている。それは再生可能で信頼できるラベル付けと共に共焦点顕微鏡に適した容積を維持する。我々は、共焦点部からの精子細胞核の3D再構成の異なる例を示す。検査中および間の試験の再現性により、異なる遺伝子型の単一細胞間の 蛍光 を3D定量および比較することができます。我々は、核内MINT構造(Mad1含有核内領域)の異なる成分と、核孔複合体に関連する2つの成分を使用して、このプロトコルとその精巣の最大細胞S4-S5精子細胞への応用を説明した。

概要

ショウジョウバエの精巣は、核建築の研究にとって貴重なモデルです。有糸精子細胞では、核体積は主にクロマチンによって占められます。これらの細胞は4ラウンドの分裂を受け、16の原発性精子細胞の嚢胞を産生する。次の数日間にわたって、精子細胞は6つの発達段階(S1-S6)を通過し、体積が大幅に増加し、およそ20倍1、2。彼らはまた、核形態を変えます。ラミンDm0によって明らかにされた核の輪郭は不規則になり、深い内層1、3を示す。これは、クロマチン組織1、4、5、6、7における広範な遺伝子発現変化および修飾を伴う。この相間染色体は、ステージS4-S5で明確に定義されており、2つの主要な二価オートソームと核子とドッキングされたX-Y対に対応する3つの異なる質量を形成する。

Mad1 はもともと、有糸分裂性チェックポイントの重要な構成要素として分離されました(8でレビュー)。相間では、核エンベロープに位置するが、核内に位置する9、10、11と記載されている。ショウジョウバエ精巣では、Mad1が核内で顕著であり、2つの主要な常染色体塊と密接に関連しており、XYクロマチンとのより少ない程度に関連していると報告した。我々は、このクロマチン関連構造をMINT(Mad1含有核内領域)12と定義した。他の4つのタンパク質は、精子細胞におけるMINTと関連していた:ヌクレオポリンMtor/Tpr、SUMOペプチダーゼウルプ1、有糸性チェックポイントタンパク質Mad2およびポリコーム様複合体Raf212のサブユニット。

MINTの説明を完了するために、我々は抗体を使用する必要があり、精巣における免疫染色に一般的に遭遇する技術的な問題に直面していた:透過性が悪く、特に大きな精子で精巣の深部に有意な不均一性の染色をもたらした。Squashed製剤は抗体アクセスを増加させたが、圧縮画像、3D分析を制限し、共局在化を含む定量的蛍光の測定を妨げる。抗体の浸透の問題は、0.3%Naデオキシコール酸13などの透過性剤によっても対処することができたが、この手順は我々の手の中に再現可能な結果を生み出さなかった。多くの共標識実験を行ったため、パーメバライゼーションプロトコルの改善を検討しました。1%NP40とヘプタンの組み合わせは、特に大きな精子細胞を研究する上で、より再現性をもたらした。

このプロトコルは、懸濁液中の精巣の固定および免疫染色を行い、サンプルの品質を向上させ、再現性を高め、共焦点顕微鏡に適したレンダリングを行います。我々は、このプロトコルを用いて、特定の核エンベロープタンパク質と大きな精子細胞の核内構造の空間的関係をより良く定義した。この方法は、例えばクロマチン、核細胞および核の毛穴を含む核の動的構造変化など、精子細胞の発達に伴う変化のより良い調査を可能にする。

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プロトコル

1. ショウジョウバエ精巣コレクション

注:若い男性(0-15時間後-分浸)は、ジロイド生殖細胞(すなわち、精子および精子細胞)を調べるのに必要である。

  1. 精子の開発による干渉を最小限に抑えるために、可能な限り若いハエを選択してください。
  2. 二酸化炭素への短時間の暴露によってハエを麻酔し、フライパッド14、15に移す。
  3. 解剖顕微鏡(10倍の倍率)の下で、鉗子を使用して頭部を取り除く。
  4. 5~10個の切断されたハエを、黒いバックグラウンドサポート上のシリコーンコーティングされたガラススライド上のリンゲルのバッファー(183 mM KCI、47 mM NaCl、10 mM Tris-HCI、1 mM EDTA、完全タンパク質阻害剤、pH 6.8)の100 μLに移します。
  5. 40倍の倍率で顕微鏡を解剖すると、5個の鉗子を1組使って胸部と腹部の間にハエを保持し、他の鉗子で腹部を胸郭から引き離します。精巣と隣接組織をハエ・カーカス15から迅速に分離し、同じスライド上のリンガーの緩衝液の新しい滴に入れる。
  6. すべての精巣の準備ができたら、残りの組織(補助腺と外部生殖器)から精巣をきれいにします。
  7. 解剖された精巣を含むドロップから余分なバッファを取り除きます。通常、200 μL チップの上に 10 μL チップを取り付けた p200 ピペットを使用します。これは小さい絞りを通して液体過剰の除去を可能にする。解剖精巣を含むドロップの上に4%パラホルムアルデヒド固定液の滴を置き、次いで迅速に新しい固定溶液を含むチューブに精巣を移します。

2. パラホルムアルデヒド固定

  1. 使用直前に2 mLの固定液を調製:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した4%パラホルムアルデヒド600 μL、NP40 20%の30 μL+2 mLシリコン化マイクロ遠心チューブ内のヘプタン1200 μLを使用します。600 μL アリコートで調製し、-20°Cで保存した PBS で 4% パラホルムアルデヒドを使用してください。
    注意: ヘプタンとパラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードで扱う必要があります。ホスト協会の規則に従って処分する。
  2. 広い開口チップを備えたp200マイクロピペットを使用して、PFA/NP40/ヘプタン溶液に精巣を移します。チューブを上下に振って30s手で動かします。室温で30分間、回転ミキサーで精巣を固定し続けます。
  3. 回転ミキサーを停止し、チューブラックにチューブを置いて、相分離を可能にし、精巣がチューブの底部に落ち着くようにします。
  4. すべてのヘプタンと固定溶液を取り除き、1x PBSで3回素早く精巣をすすぐ。
  5. きれいな200 μLの個々の管に移す。これらの小さなチューブ内のすべてのインキュベーションを行い、抗体の使用量を最小限に抑えます。
  6. P200とP10チップの両方を取り付けた200 μLマイクロピペットを使用して余分なバッファーを除去します。精巣を吸引しないように注意してください。
  7. すべてのサンプルが準備ができるまで氷の上に1x PBSで精巣を保ちます。

3. 溶液中の抗体染色

  1. PBSを廃棄し、細胞膜を透過させるために室温で30分間0.3%PBS-Tに精巣を残します。
  2. 同じバッファーに 5% 通常のヤギ血清 (NGS) を加えた 1 時間の前培養します。
  3. 0.3%PBS-Tプラス5%NGS(材料表)に希釈された一次抗体の200 μLを加える。
  4. ロッカーに緩やかな攪拌を伴い、一次抗体を4°C(または室温)で一晩インキュベートします。
  5. 室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで3回洗浄します。重力によって精巣がチューブの底に落ち着くようにします。
  6. DyLightコンジュゲートシリーズから1:500希釈した二次抗体200μLを加えます。
  7. 二次抗体を暗室で室温で4時間インキュベートする。
  8. 室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで洗います。その後、0.2%PBS-Tと0.1%PBS-Tで繰り返し、室温でロッカーで30分間繰り返します。洗剤を取り除くために30分間、PBS1xで最後の洗浄を行います。
  9. 1μg/mLのDAPI溶液を1μg/mLで1x PBSで15分間追加します。ストック溶液はH2Oで10mg/mLであり、PBSでストック溶液を作ることを避け、より大きな精子での拡散クロマチンのDAPI染色信号を減少させることができます。
  10. 3倍の洗剤を5分間洗います。
  11. 疎水性バリアペンを使用して、きれいなスライドに円を描きます。
  12. 試験を吸引し、スライドの上に置きます。広い開口チップを0.1%PBS-Tでプレリンスすると、精巣が先端に付着するのを防ぎます。余分なPBSを除去します。
  13. シティフルオールAF1のドロップ(約100 μL)を加えます。
  14. ガラスのカバースリップを組織の上にそっと置き、気泡をトラップしないように注意してください。
  15. クリアマニキュアを使用して、カバースリップをスライドに密封します。
  16. 顕微鏡でスライドを観察します。

4. 共局化分析

  1. 共焦点画像を取得します。Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡(63xプランアポクロマティックオイル)を使用し、Z解像度は0.5または1μmでした。
  2. 独立した精巣から異なるセルを選択します。
  3. 処理ソフトウェア(例えば、イマリス)に画像をインポートします。
  4. 隣接する核を除外するために、手動セグメンテーションで核を定義します。Coloc ソフトウェアを使用する。2つのフルオロフォア間の全容内でピアソンの相関係数(PCC)を収集します。

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結果

ショウジョウバエ精巣の適切な染色を得るための主な障害は、部分的に押しつぶされた製剤を使用して解決されたが、3D分析の制限(例えば3D表現または共局在化の尺度)を犠牲にして解決された抗体の限られた浸透性である。この手順では、均一なラベルを作成でき、精巣のすべての細胞の体積を保持します。ここでは、S4-S5精子細胞の3D表現に関する方法のイラストを、それらが最大の細胞であり、したがって、スカッシュからの変形に敏感であるように焦点を当てました。我々は、有糸タンパク質Mad112によって記述される核内MINTドメイン(Mad1含有核内領域)の核内MINTドメインのラベリングと核内の標識を含む異なる核マーカーを用いた。MINTは複数の異なる抗体によって明らかにすることができるので、我々はそれらを使用して、定量的3D共局在化のためのプロトコルの堅牢性をテストし、正しい空間分解能を必要とする方法である。

上述のプロトコルは、3D再構成のために処理される十分な品質の共焦点画像の取得を可能にする。S5段の隣接する4つの連続セクションが

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ディスカッション

このプロトコルは、成体成群ショウジョウバエ精巣の免疫標識を成功させるための方法を提供する。他の手順で報告されているように、若い男性は精子を妨害する危険性のある精子の発症の存在を最小限に抑えるために使用する必要があります(我々も、発疹後20時間以内に年齢を短縮しました)。解剖は迅速で、抗体希釈はシグナル対ノイズ比21、22、23を最適化するように調整する必要があります。他のプロトコルを用いるため、精巣の深さ全体に染色を観察せず、NP40やヘプタンとPFAを組み合わせた固定法を開発しました。現在では、20%NP40の30 μLと2巻のヘプタンを用いたPBSで、4%パラホルムアルデヒド600 μLを日常的に使用しています。これは、十分な透過性を可能にするために重要です。NP40の量を10 μLに減らすことによって、目に見えてラベル付けを減らすことができます。その後のステップはすべて懸濁液で行い、精巣が重力によって管の底に穏やかに降下できるようにすることで余分...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

P.ベリザー、J.ヨハンセンH.、オクラの抗体、A.デベック、ブルーミントン、ウィーンのハエストックセンターに感謝します。提案と刺激的な議論のためのC.ジャクソンに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyOGift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFPJ Cell Sci. 2011年5月15日;124(Pt 10):1664-71。
Mtor RNAi VDRCID 110218ウィーン ショウジョウバエ RNAi Center
Materials
DAPI ThermoD1306ストック溶液は、H2O
Dumont#5 Fine Forseps でファインサイエンスツール
MBP ワイドボアピペットチップフィッシャーブランド11917744ワイドアパーチャチップ
サーモサイエンティフィック 0.2 mL Individual TubeThermoAB-0620
2 ml マイクロ遠心チューブ シグマT3531-200EA シリコン処理された2mlチューブ
Citifluor AF1CitifluorAF1
Dakopen シグマZ377821-1EA 
正常なヤギの血清(NGS)ΣNS02L-1ML
のパラホルムアルデヒド4%ΣP6148-500G パラホルムアルデヒド(4%)をPBSに溶解 1X ;アリコート600ml 
PBS 1XThermo14190094DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T 0.1%(0.2%または0.3%)を含むPBS 1X  Triton X-100
Triton X-100、分子生物学用、 SigmaT8787
Antibodies
GFP boosterChromotekgba4881/200
マウス抗Mtor1/40 J. Johansen, Iowa State Universityからの
贈り物 ラット抗Nup621/200 H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp11/200 C. P. Verrijzer, エラスムス大学, ロッテルダム
Rabbit anti-Raf2/200 C. P. Verrijzer, エラスムス大学, ロッテルダム
DyLight コンジュゲート シリーズからのギフト Thermo1/500 Donkey anti-(モルモット、マウス、ウサギまたはラット)
調製する必要があります。抗体 1

参考文献

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