大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

サマリー

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

要約

ショウジョウバエ 精巣は、幹細胞生物学、核アーキテクチャ、微膜および精子の発生を含む生物学的プロセスを研究するための強力なモデルシステムです。しかしながら、 ショウジョウバエ 精巣全体の免疫標識は、抗体の浸透による染色の有意な不均一性と関連していることが多い。押しつぶされた準備は、解析の3D品質を低下させるので、部分的に問題を克服するだけです。本明細書において、我々は、液体媒体中の免疫標識と共に固定中にNP40およびヘプタンを用いた全実装プロトコルについて述べている。それは再生可能で信頼できるラベル付けと共に共焦点顕微鏡に適した容積を維持する。我々は、共焦点部からの精子細胞核の3D再構成の異なる例を示す。検査中および間の試験の再現性により、異なる遺伝子型の単一細胞間の 蛍光 を3D定量および比較することができます。我々は、核内MINT構造(Mad1含有核内領域)の異なる成分と、核孔複合体に関連する2つの成分を使用して、このプロトコルとその精巣の最大細胞S4-S5精子細胞への応用を説明した。

概要

ショウジョウバエの精巣は、核建築の研究にとって貴重なモデルです。有糸精子細胞では、核体積は主にクロマチンによって占められます。これらの細胞は4ラウンドの分裂を受け、16の原発性精子細胞の嚢胞を産生する。次の数日間にわたって、精子細胞は6つの発達段階(S1-S6)を通過し、体積が大幅に増加し、およそ20倍^1、2。彼らはまた、核形態を変えます。ラミンDm0によって明らかにされた核の輪郭は不規則になり、深い内層^1、3を示す。これは、クロマチン組織^{1、4、5、6、7}における広範な遺伝子発現変化^および修飾^を伴う。この相間染色体は、ステージS4-S5で明確に定義されており、2つの主要な二価オートソームと核子とドッキングされたX-Y対に対応する3つの異なる質量を形成する。

Mad1 はもともと、有糸分裂性チェックポイントの重要な構成要素....

プロトコル

1. ショウジョウバエ精巣コレクション

注:若い男性(0-15時間後-分浸)は、ジロイド生殖細胞(すなわち、精子および精子細胞)を調べるのに必要である。

1. 精子の開発による干渉を最小限に抑えるために、可能な限り若いハエを選択してください。
2. 二酸化炭素への短時間の暴露によってハエを麻酔し、フライパッド^14、15に移す。
3. 解剖顕微鏡(10倍の倍率)の下で、鉗子を使用して頭部を取り除く。
4. 5~10個の切断されたハエを、黒いバックグラウンドサポート上のシリコーンコーティングされたガラススライド上のリンゲルのバッファー(183 mM KCI、47 mM NaCl、10 mM Tris-HCI、1 mM EDTA、完全タンパク質阻害剤、pH 6.8)の100 μLに移します。
5. 40倍の倍率で顕微鏡を解剖すると、5個の鉗子を1組使って胸部と腹部の間にハエを保持し、他の鉗子で腹部を胸郭から引き離します。精巣と隣接組織をハエ・カーカス¹⁵から迅速に分離し、同じスライド上のリンガーの緩衝液の新しい滴に入れる。
6. すべての精巣の準備ができたら、残りの組織(補助腺と外部生殖器)から精巣をき....

結果

ショウジョウバエ精巣の適切な染色を得るための主な障害は、部分的に押しつぶされた製剤を使用して解決されたが、3D分析の制限(例えば3D表現または共局在化の尺度)を犠牲にして解決された抗体の限られた浸透性である。この手順では、均一なラベルを作成でき、精巣のすべての細胞の体積を保持します。ここでは、S4-S5精子細胞の3D表現に関する方法のイラストを、それらが最大の細胞であり、したがって、スカッシュからの変形に敏感であるように焦点を当てました。我々は、有糸タンパク質Mad1¹²によって記述される核内MINTドメイン(Mad1含有核内領域)の核内MINTドメインのラベリングと核内の標識を含む異なる核マーカーを用いた。MINTは複数の異なる抗体によって明らかにすることができるので、我々はそれらを使用して、定量的3D共局在化のためのプロトコルの堅牢性をテストし、正しい空間分解能を必要とする方法である。

上述のプロトコルは、3D再構成のために処理される十分な品質の共焦点画像の取得を可能にする。S5段の隣接する4つの連続セクションが

ディスカッション

このプロトコルは、成体成群ショウジョウバエ精巣の免疫標識を成功させるための方法を提供する。他の手順で報告されているように、若い男性は精子を妨害する危険性のある精子の発症の存在を最小限に抑えるために使用する必要があります(我々も、発疹後20時間以内に年齢を短縮しました)。解剖は迅速で、抗体希釈はシグナル対ノイズ比^21、22、23を最適化するように調整する必要があります。他のプロトコルを用いるため、精巣の深さ全体に染色を観察せず、NP40やヘプタンとPFAを組み合わせた固定法を開発しました。現在では、20%NP40の30 μLと2巻のヘプタンを用いたPBSで、4%パラホルムアルデヒド600 μLを日常的に使用しています。これは、十分な透過性を可能にするために重要です。NP40の量を10 μLに減らすことによって、目に見えてラベル付けを減らすことができます。その後のステップはすべて懸濁液で行い、精巣が重力によって管の底に穏やかに降下できるようにすることで余分.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 2011年5月15日;124(Pt 10):1664-71。
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	ウィーン ショウジョウバエ RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	ストック溶液は、H2O
Dumont#5 Fine Forseps で	ファインサイエンスツール
MBP ワイドボアピペットチップ	フィッシャーブランド	11917744	ワイドアパーチャチップ
サーモサイエンティフィック 0.2 mL Individual Tube	Thermo	AB-0620
2 ml マイクロ遠心チューブ	シグマ	T3531-200EA	シリコン処理された2mlチューブ
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	シグマ	Z377821-1EA
正常なヤギの血清(NGS)	Σ	NS02L-1ML
のパラホルムアルデヒド4%	Σ	P6148-500G	パラホルムアルデヒド(4%)をPBSに溶解 1X ;アリコート600ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用
0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T			0.1%(0.2%または0.3%)を含むPBS 1X  Triton X-100
Triton X-100、分子生物学用、	Sigma	T8787
Antibodies
GFP booster	Chromotek	gba488	1/200
マウス抗Mtor			1/40 J. Johansen, Iowa State Universityからの
贈り物 ラット抗Nup62			1/200 H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Guinea-pig anti-Ulp1			1/200 C. P. Verrijzer, エラスムス大学, ロッテルダム
Rabbit anti-Raf2			/200 C. P. Verrijzer, エラスムス大学, ロッテルダム
DyLight コンジュゲート シリーズからのギフト	Thermo		1/500 Donkey anti-(モルモット、マウス、ウサギまたはラット)

調製する必要があります。抗体 1