ここで提示されるのは、アガロースパッドおよび細胞イメージングディッシュと組み合わせて、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用した捕食細菌 Bdellovibrioバクテリオボルス の完全なライフサイクルのモニタリングを記述するプロトコルです。
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この記事について
サマリー
要約
Bdellovibrio細菌は 、有害な病原体を含む他のグラム陰性細菌を殺す小さなグラム陰性、義務的な捕食細菌である。したがって、生きた抗生物質と考えられる。 B.バクテリオボルス を生きた抗生物質として適用するには、まず、その複雑なライフサイクルの主要な段階、特に獲物内での増殖を理解する必要があります。これまでのところ、捕食ライフサイクルの連続した段階をリアルタイムで監視することは困難でした。ここで提示されるB. バクテリオボルスの完全なライフサイクルのリアルタイムイメージングのための包括的なプロトコルは、特にホスト内での成長の間である。この目的のために、アガロースパッドからなるシステムは、捕食細胞がアガロースパッドの下を自由に移動し、固定化された獲物細胞がbdelloplastsを形成することができる細胞イメージング皿と組み合わせて使用される。DNAポリメラーゼIIIの蛍光タグ付きβサブユニットを産生する株の適用により 、B.バクテリオボルス のライフサイクルの再生段階で染色体複製を監視することがさらに可能になります。
概要
Bdellovibrio bacteriovorusは、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シゲラ・フレックスネリ11,2,32,3などの有害な病原体を含む他のグラム陰性細菌を捕食する小さな(0.3-0.5 μm by 0.5-1.4 μm)グラム陰性細菌である。B.バクテリオボルスは病原体を殺すので、細菌感染症、特に多剤耐性株によって引き起こされる細菌感染と戦うために適用できる潜在的な生きている抗生物質と考えられている。
B. バクテリオボルスは、自由に生きている非複製的攻撃期と細胞内生殖期の2つの段階からなる独特のライフサイクルを示す(図1)。自由な生活段階では、最大160μm/sの速度で移動するこの高い運動性細菌は、獲物を探します。獲物の外膜に付着した後、それは、ペリプラズム44、5に入る。B.バクテリオボルスは、子宮間生殖段階で、多量の加水分解酵素を使用して宿主の高分子を分解し、それ自身の成長のために再....
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プロトコル
1. 微視的分析のための B.バクテリオボルス リセートの調製
- 250 mL フラスコに、新鮮な 24 時間 B. バクテリオボルス 培養液の 1 mL を組み合わせて共培養を設定します( HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)および3mLの一晩の獲物培養物(例えば、 大腸菌 S17-1 pZMR100)と50 mLのCa-HEPESバッファー(25 mM HEPES、2 mM CaCl2[pH = 7.6])が必要な場合に抗生物質を補った(ここでは50μg/mcml)。
- 200rpmで振盪して30°Cで24時間培養する。
- 獲物細胞が液体取り付け位相対相顕微鏡によって完全に取り付けられていることを確認してください。この時点で、多数のモチル攻撃相 B.バクテリオボルス 細胞が存在し、 大腸菌 細胞またはbdelloplastが見えるべきではない。
- B.バクテリオボルス培養を0.45 μmの細孔サイズフィルタでフィルターし、残りの宿主細胞を除去します。捕食細胞(0.3~0.5 μm x 0.5~1.4 μm)は0.45μmの気孔を自由に貫通し、宿主細胞はフィルター表面に保持されます。
- 捕食細胞を収集するために、2469 x g で 20 分間、50 mL 円錐....
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結果
記載されたTLFM系システムは、B.バクテリオボルスの個々の細胞を時間で追跡することを可能にし(図3、Movie 1)、複雑な捕食ライフサイクルの各段階に関する貴重な情報を提供する。PilZ-mCherry融合により、捕食細胞全体を攻撃段階および成長段階の初期段階で標識することができます(図3)。攻撃から複製段階への移行は、宿主のbdelloplast形成だけでなく、DnaN-mNeonGreen蛍光病巣によってマークされた応答体(複製機械)の出現によっても可視化された(図3)。
先に示したように、このレタンコは、侵入細胞極(ピリポール)7で組み立てられ、再生相が進行するにつれて成長するB.バクテリオボルスフィラメント内で複数の応答体が観察された(.......
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ディスカッション
生きた抗生物質として B.バクテリオボルス を使用することに対する関心の高まりにより、捕食性のライフサイクル、特に捕食者と病原体の相互作用を観察するための新しいツールが必要です。提示されたプロトコルは 、B.バクテリオボルス のライフサイクル全体を、特にホスト内での成長中にリアルタイムで追跡するために使用されます。さらに、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素の蛍光タグ付きベータクランプを産生する株の適用により 、B.バクテリオボルスの再生段階を通じて染色体複製進行のモニタリングが可能になった。
この方法の重要なステップは、35 mm皿のレイアウトの適切な準備です。 B.バクテリオボルス のライフサイクルを顕微鏡で観察する際の課題は、捕食増殖を支える状態(宿主細胞として他のグラム陰性細菌細胞を含む)を確立し、捕食細胞運動性を提供することである。効果的な顕微鏡観察の重要な側面の1つは、細胞を接種ループで広めることによって達成されるアガロースパッド上の獲物の均一な分布の必要性である。ホストセル密度が高すぎないようにして、.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、国立科学センターの助成金Opusによってサポートされました 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 遠心分離機 | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | ローター ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology アガロース | BIO-RAD | 161-3100 | アガロースパッド用低蛍光アガロー |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | オープンソース画像処理パッケージ |
| ガラスボトムディッシュ 35 mm | ibidi | 81218-200 | コーティングされていないガラス |
| 顕微鏡 | GE | DeltaVision Elite | マイクロタイターステージ、アルティメットフォーカスレーザーモジュール、DV Elite CoolSnap HQ2 カメラ、SSI アセンブリ FP DV、キット obj. Oly 100x oil 1.4 NA、プリズム Nomarski 100x LWD DIC、ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
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参考文献
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Stap....
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再版と許可
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