チオバルビト尿酸反応性物質アッセイの目的は、532nmの可視波長分光光度測定を用いて、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒドの生産を測定することによって生体試料中の酸化ストレスを評価することです。ここで説明する方法は、ヒト血清、細胞ライセート、および低密度リポタンパク質に適用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
分析上の特異性と堅牢性は限られているにもかかわらず、チオバルビツール酸反応性物質(TBARS)アッセイは、生体液中の脂質過酸化の一般的な指標として広く使用されています。生体試料内の酸化ストレスのレベルを示す良い指標と考えられることが多く、サンプルが適切に処理され保存されていることが考えられます。このアッセイは、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒド(MDA)、チオバルビツール酸(TBA)との反応を伴い、TBARSと呼ばれるMDA-TBA2付加物の形成につながります。TBARS は 532 nm で分光光度を測定できる赤ピンク色を生成します。TBARSアッセイは、酸性条件下(pH = 4)で、95°Cで行います。 純粋なMDAは不安定ですが、これらの条件はMDAビス(ジメチルアセタール)からMDAを放出することを可能にし、この方法で分析標準として使用されます。TBARSアッセイは、約2時間で完了できる簡単な方法です。アッセイ試薬の調製について、詳細を説明します。予算重視の研究者は、単一の標準曲線の構築のみを可能にする高価なTBARSアッセイキットを購入するのではなく、これらの試薬を低コストで複数の実験に使用することができます(したがって、1つの実験にのみ使用できます)。このTBARSアッセイの適用可能性は、ヒト血清、低密度リポタンパク質、および細胞ライセートで示されている。アッセイは一貫して再現可能であり、1.1 μMの検出限界に達することができる。分光光度TBARSアッセイの使用および解釈に関する推奨事項が提供される。
概要
脂質過酸化は、活性酸素種や反応性窒素種などのフリーラジカルが、脂質中の炭素炭素二重結合を攻撃するプロセスであり、炭素からの水素の抽象化と酸素分子の挿入を伴うプロセスである。このプロセスは、主要な製品として、脂質ペルオキシルラジカル、およびヒドロペルオキシドを含む複雑な製品の混合物、ならびに主要な二次製品としてマロンジアルデヒド(MDA)および4-ヒドロキシノンを含む。
MDAはチオバルビツール酸(TBA)との容易な反応による脂質過酸化のマーカーとして、生物医学研究で広く使用されています。この反応は、532 nmの可視スペクトルで吸収し、赤-ピンク色2を生成するコンジュゲートであるMDA-TBA2の形成につながります。MDA以外の脂質過酸化に由来する他の分子も、TBAと反応して532nmで光を吸収し、測定される全体的な吸収シグナルに寄与する。同様に、MDAは生体分子の他のほとんどの主要クラスと反応することができ、TBA3,4との反応に対するアクセシビリティを制限する可能性があります。したがって、この伝統的なアッセイは、単に「チオバルビツール酸反応性物質」またはTBARS5を測定すると考えられています....
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プロトコル
ヒト血清検体は、IRBの承認の下で同意したボランティアから、そしてヘルシンキ宣言で述べられている原則に従って得られた。検体は、分析室に移る前にコード化され、同定を解除した。
1. サンプル準備
- ヘプG2細胞ライセート
- 16 T75フラスコに16個のT75フラスコに種子約10 x 106 HepG2細胞があり、10%のウシ胎児血清(FBS)を補充したEMEM培地14mLで、2日間細胞を増殖させる。
- RIPAバッファーを準備する:50 mLチューブに、5 M NaClの1.5 mL、1 MトリスHCl(pH = 7)の2.5 mL、NP-40試薬の500 μLを加え、DI水で50 mLに最終容積を持って来ます。
- 溶解バッファーを準備する:50 mLチューブにRIPAバッファーのアリコート20 mLを追加し、タンパク質と脂質分解を阻害するために100xプロテアーゼ阻害剤溶液の200 μLを追加します。4 °Cで保管。
注意:リシスバッファーはTBARS試薬と互換性があり、532 nmでの吸光度を妨げません。別のリシスバッファーを使用するか、またはリシスバッファーに追加の成分を追加する場合は、リシスバッファーコンポーネントがTBARSアッセイと互換性があることを確認するために予備検証研究を行う必要があります。 - 10%F....
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結果
酸性条件下(pH = 4)および95°Cでは、マロンジアルデヒド(MDA)ビス(ジメチルアセタール)はMDA23を生成します。MDAと密接に関連する化学共因は、チオバルビツール酸(TBA)の2分子と反応してチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)と呼ばれる化合物を生成し、赤色ピンク色を与え、532nmで吸光度λmax を有する(図1、 図2)。標準としてMDAビス(ジメチルアセタール)を用いて、標準曲線(図3、 表1)を生成し、3つの異なる生物学的試料におけるアッセイの検出と感度および酸化レベルの限界を決定した。異なる日に3つの異なるサンプルの酸化レベルを決定するために合計9つのTBARSアッセイが行われました。したがって、 図 3 に示すように、合計 9 つの標準曲線が生成されました。最小二乗法.......
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ディスカッション
その限界にもかかわらず1、3、4、7、8、10、12、13、14、15、19および実験室間の比較のための適合性の欠如、TBARSのアッセイは最も古い29,30
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益やその他の利益相反を開示する必要はありません。
謝辞
ここで報告された研究は、賞の下で国立衛生研究所の国立がん研究所によって部分的にサポートされました。R33 CA217702 と学生育成(IMSD)プログラムを最大化するためのイニシアチブ。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1x 滅菌済み PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642--262 | 細胞溶解試薬 |
| 50 mL 自立型遠心分離管 | Corning, NY | CLS430897 | 一般材料 |
| 96 ウェルプレート, 未処理, 透明, 蓋付き, 非滅菌 | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | 吸光度を測定するには |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD 遠心スピンフィルター装置 | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL精製 |
| ガラス管用キャップ | サーモフィッシャーサイエンティフィック、MA | 14-930-15D | TBARSアッセイ |
| 塩化銅II塩化銅 | SIGMA、MO | 222011-250G | 誘発する |
| 培養チューブ、使い捨て、スクリューキャップ仕上げ、ホウケイ酸ガラス (13 x 100 mm) | VWR、PA | 53283-800 | TBARSアッセイ |
| イーグルの最小必須培地(EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf, NY | 22363204 | 一般材料 |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | 一般材料 |
| ウシ胎児血清 米国 Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | 細胞溶解試薬 |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL 溶媒 |
| HepG2 細胞 | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloring acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| レジェンドマイクロ17遠心分離機 | Thermo Scientific, MA | 75002431 | 一般材料 |
| 低密度リポタンパク質、ヒト血漿 | アテネ研究 &技術、GA | 12-16-120412 | 生物マトリックスのプロトタイプ |
| の磁気攪拌棒、八角形6-Assortment | VWR、PA | 58948-025 | 一般材料 |
| Malondialdehyde bis (ジメチルアセタール) | SIGMA、MO | 8207560250 | TBARS 標準 |
| Multiskan Go マイクロプレート分光光度計 | Fisher Scientific、NH | 51119200 | 吸光度 |
| NP-40 | を測定するにはEMD Millipore Corp、MA | 492016-100ML | 細胞溶解試薬 |
| 塩化ナトリウム | SIGMA、MO | S7653-1KG | 細胞溶解試薬 |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | SIGMA、MO | 436143-100G | TBARS試薬 |
| 水酸化ナトリウム | SIGMA、MO | 367176-2.5KG | TBARS試薬 |
| SpeedVac濃縮器 | Thermo Scientific、MA | SC250EXP | 濃縮細胞溶解物 |
| T-75 フラスコ、組織培養処理済み、250 mL、フィルターキャップ付き | USA Scientific、FL | 658175 | 細胞培養 |
| チオバルビツール酸 | SIGMA、MO | T5500-100G | TBARS 試薬 |
| TRIS ベース | Fluka、GA | 93362 | 細胞溶解試薬 |
| トリプシン (1x) | VWR、PA | 16777-166 | HepG2 細胞を剥離するには |
参考文献
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.
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再版と許可
