方法論記事

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

DOI：

10.3791/61124

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2020年8月14日

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1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

この記事について

サマリー

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ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。

要約

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ゲノム上の特異的タンパク質とDNA相互作用の同定は、遺伝子調節を理解するために重要である。ハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)と組み合わせたクロマチン免疫沈降法は、DNA結合タンパク質のゲノム全体の結合場所を同定するために広く使用されています。しかし、ChIP-seq法は、超音波処理されたDNA断片および非特異的バックグラウンドDNAの長さの不均一性によって制限され、DNA結合部位におけるマッピング分解能と不確実性が低い結果となる。これらの制限を克服するために、ChIPとエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)の組み合わせは、5'〜3'エキソヌクレアーゼ消化を利用して、タンパク質-DNA架橋部位に異種サイズの免疫沈降DNAをトリミングする。エキソヌクレアーゼ処理は、非特異的なバックグラウンドDNAも除去する。ライブラリー調製およびエキソヌクレアーゼ消化 DNA は、ハイスループットシーケンシングのために送ることができます。ChIP-exo法は、より大きな検出感度と背景信号の低減を伴うニアペアマッピング分解能を可能にします。哺乳類細胞および次世代シーケンシング用に最適化されたChIP-exoプロトコルを以下に説明する。

概要

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タンパク質とDNA相互作用の場所は、遺伝子調節のメカニズムに関する洞察を提供します。クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を組み合わせると、1,2の生細胞におけるゲノム全体のタンパク質とDNAの相互作用を調べるために10年間使用されてきた。しかし、ChIP-seq法は、低マッピング分解能、誤検出、不在着信、および非特異的バックグラウンド信号につながるDNA断片化および非結合DNA汚染における不均一性によって制限されています。ChIPとエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)の組み合わせは、ChIP DNAをタンパク質-DNA架橋点にトリミングすることにより、ChIP-seq法を改善し、ベースペアの分解能に近い分解能と低バックグラウンド信号3、4、5を提供する。ChIP-exoによって提供される大幅に改善されたマッピング分解能および低い背景はゲノム全体で決定される正確で、広範囲な蛋白質DNA結合の場所を可能にする。ChIP-exoは、機能的に異なるDNA結合モチーフ、転写因子(TF)との協調的相互作用、および特定のゲノム結合位置における複数のタンパク質−DNA架橋部位を明らかにすることができ、他のゲノムマッピング方法3、4、6、7では検出できない。

ChIP-exoは、最初は出芽酵母で使用され、TFの配列特異的DNA結合を調べ、転写開始前複合体の正確な組織を研究し、またゲノム4、8、9を横切る個々のヒストンの核下構造を研究した。2011年4月に導入されて以来、細菌、マウス、ヒト細胞7、10、11、12、13、14、15、16、17など、他の多くの生物に利用されています。2016年、Rhee et al.14は哺乳類ニューロンで初めてChIP-exoを使用して、別のプログラミングTF Isl1とヘテロダイマー複合体を形成するプログラミングTF Lhx3のダウンレギュレーション後にニューロン遺伝子発現がどのように維持されたかを理解した。この研究は、Lhx3がない場合、Isl1がニューロンエフェクター遺伝子の遺伝子発現を維持するためにOnecut1 TFによって結合された新しいニューロンエンハンサーに募集されることを示した。本研究では、複数のTFが、ほぼヌクレオチドマッピング分解能で、細胞型および細胞ステージ特異的DNA調節要素を組み合わせで動的に認識する方法を明らかにした。他の研究はまた、他の哺乳類細胞株におけるタンパク質とDNAの相互作用を理解するためにChIP-exo法を使用した。Han et al.7は、ChIP-exo を使用して、マウスエリスロイド細胞における GATA1 および TAL1 TF のゲノムワイド組織を調べるために、ChIP-exo を用いた。この研究では、TAL1はエリスロイド分化を通じてGATA1とタンパク質タンパク質相互作用を介して間接的ではなくDNAに直接リクルートされることを発見した。最近の研究はまた、ヒト細胞株18、19におけるエピゲノムおよび転写機構を研究するためにCTCF、RNAポリメラーゼII、およびヒストンマークのゲノムワイド結合位置をプロファイリングするためにChIP-exoを用いた。

ChIP-exoプロトコルには、3、5、20のバージョンが用意されています。しかし、これらのChIP-exoプロトコルは、次世代シーケンシングライブラリの準備に精通していない研究では従うのが難しいです。ChIP-exo プロトコルの優れたバージョンは、簡単に従う手順とビデオ21で公開されましたが、完了するまでにかなりの時間を要する多くの酵素的ステップが含まれていました。ここでは、酵素ステップとインキュベーション時間を削減したChIP-exoプロトコルの新しいバージョンと、各酵素ステップ21の説明を報告します。エンドリペアとdA-テーリング反応は、エンドプレップ酵素を用いた一回のステップで組み合わされます。インデックスおよびユニバーサルアダプターライゲーションステップのインキュベーション時間は、ライゲーションエンハンサーを使用して2時間から15分に短縮されます。キナーゼ反応は、上記のChIP-exoプロトコルに記載されたインデックスアダプタライゲーションステップ後に除去される。代わりに、オリゴDNA合成中にリン酸基が、ラムダエキソヌクレアーゼ消化ステップに使用されるインデックスアダプタの5'末端(表1)のいずれかに添加される。以前のChIP-exoプロトコルはRecJfエキソヌクレアーゼ消化を使用して一本鎖DNA汚染物質を排除しましたが、この消化ステップはChIP-exoライブラリの品質にとって重要ではないので、ここで取り除かれます。また、ChIP溶出後に逆架橋DNAを精製するために、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(PCIA)抽出法の代わりに磁気ビーズ精製法が用いられます。これにより、DNA抽出のインキュベーション時間が短縮されます。重要なことに、インデックスアダプタライゲーション中に形成されるアダプタダイマーの大部分を除去し、結紮媒介PCRの効率に影響を与える可能性があります。

ここで紹介するChIP-exoプロトコルは、マウス胚性幹細胞(ES)細胞と区別される哺乳類ニューロンにおける正確なタンパク質とDNA相互作用の検出に最適化されています。簡単に言えば、採取および架橋された神経細胞が溶解され、クロマチンが超音波処理にさらされることを可能にし、次に適切なサイズのDNA断片が得られるように超音波処理する(図1)。抗体被覆ビーズは、その後、目的のタンパク質に断片化した可溶性クロマチンを選択的に免疫沈降させるために使用されます。免疫沈降DNAがビーズ上に残っている間、エンドリペア、シーケンシングアダプターの結紮、フィルイン反応および5'〜3'ラムダエキソヌクレアーゼ消化ステップが行われる。エキソヌクレアーゼ消化ステップは、ChIP-exoに超高分解能と高い信号対雑音比を与えるものです。ラムダエキソヌクレアーゼは、免疫沈降DNAを架橋部位から数塩基対(bp)でトリミングし、汚染DNAを分解させる。エキソヌクレアーゼ処理のChIP DNAは、抗体被覆ビーズから溶出し、タンパク質-DNA架橋が逆転し、タンパク質が分解される。DNAを抽出し、一本鎖のChIP DNAに変性させ、続いてプライマーアニーリングおよび拡張して二本鎖DNA(dsDNA)を作る。次に、エキソヌクレアーゼ処理末端へのユニバーサルアダプターの結紮が行われる。得られたDNAを精製し、次いでPCR増幅し、精製し、次期シーケンシングを行う。

ChIP-exo プロトコルは ChIP-seq プロトコルよりも長いですが、技術的にはそれほど困難ではありません。正常に免疫沈降したChIP DNAは、いくつかの追加の酵素ステップで、ChIP-exoに供することができる。極度の高いマッピング解像度、背景信号の減少、ゲノム結合部位に関する偽陽性および陰性の減少などのChIP-exoの顕著な利点は、時間コストを上回る。

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プロトコル

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注:オートクレーブ蒸留水と脱イオン水(ddH2O)は、バッファーと反応マスターミックスを作るのに推奨されます。セクション1-4は細胞溶解と超音波処理について説明し、セクション5-7はクロマチン免疫沈降(ChIP)を説明し、セクション8-11はビーズに対する酵素反応を説明し、セクション12および13はChIP溶出とDNA精製について説明し、セクション14-19は図書館の準備を記述する。

1. 細胞の収穫と架橋

  1. マウスES細胞をポストミトシックニューロンに分化した後、収穫した細胞に11%ホルムアルデヒドを加えて、最終的な濃度1%(v/v)にします。ロッキングプラットフォーム(ロッカー、シェーカー、またはローテーター)上のロックセルを室温(RT、25°C)で15分間ロックします。
    注:架橋する標的タンパク質に応じて、ホルムアルデヒド架橋が少ない(例えば、0.5%またはジスチーニミジルグルタレート(DSG)との二重架橋を使用することができる。
  2. 2.5 Mグリシンを最終濃度の150mMに加えると、架橋反応を止めます。RTのロッキングプラットフォーム上のロックセル、5分間。
  3. 遠心分離 15 mL 円錐管で 15 mL 円錐形チューブ, 6 分間, 1,350 x g.溶液を吸引し、次いでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5mLで細胞を再懸濁した。
    注:架橋された細胞ペレットは、液体窒素でフラッシュ凍結後-80 °Cで保存することができます。

2. 細胞の起水

注: このプロトコルの次の手順は、マウス ES 細胞から分化された約 2 x 107 の ニューロン セルに対して行われます。開いた細胞を壊すために、様々な洗剤を含むリシスバッファーが使用されます。使用直前に50mLのバッファーに1000x完全プロテアーゼ阻害剤(CPI)ストックの50 μLを加えます。

  1. 表 2の説明に従って、リシス バッファ 1~3 を準備します。
  2. 氷上の架橋された細胞ペレットを解凍し、その後、15 mL円錐管の1のリシスバッファー1の細胞ペレットを十分に再懸濁する。ロッキングプラットフォーム上で15分間4°Cでロック。遠心分離機は4°Cで5分間1,350xgで吸気上清を用いた。
  3. ペレット化細胞を3mLのリシスバッファー2に徹底的に再懸濁する。ロッキングプラットフォーム上で10分間4°Cでロック。遠心分離機は4°Cで5分間1,350xgで吸気上清を用いた。
  4. 各ペレットに1mLのライシスバッファー3を加え、氷の上に置いておく。すぐに超音波処理に進みます。

3. クロマチンの超音波処理

注:クロスリンク反転を減らすために、この超音波処理手順中に氷上または4 °Cでサンプルを保管してください。

  1. 無菌ヘラを使用して、15 mLポリスチレンチューブ上の0.2 mLの卒業マークまで超音波ビーズ(材料表)を追加します。乾いたスポットが見えないまで、1x PBSの600 μLで渦を入れ、超音波処理ビーズを洗浄します。30 x g で 5 s のチューブを遠心分離し、1x PBS を吸引します。
    注:ポリスチレンチューブの超音波処理は、ポリプロピレンチューブの超音波処理よりも効率的です。少数の細胞(例えば、<106 細胞)が超音波処理されている場合は、超音波ビーズを添加することなく1.5 mLポリスチレンチューブを使用してください。
  2. 1 mLのリシスバッファー3(ステップ2.4から)で核ライセートを徹底的に再懸濁し、超音波ビーズを含む15 mLポリスチレンチューブに移します。ポリスチレンチューブを簡単に渦。
  3. 架橋クロマチンDNAを断片化するには、30 Wの電力振幅で最適化されたサイクル数で4°Cで核溶解物を超音波処理し、超音波サイクルを30 s on/30 s offに設定します。
    注:各セルの種類とバッチの超音波処理の最適化は、最高のChIP-exo収率になります。2 x 107 マウス神経細胞の場合、上記の設定で20-30の超音波処理サイクルは100-500 bpの範囲でクロマチンを断片化します。
  4. 超音波処理が完了した後、すべての上清(超音波処理ライセート)を各サンプルから1.5 mLチューブに移します。1%の最終濃度で各サンプルに10%2-[4-[2,4-トリメチルペンタン-2-イラ]エタノールを加えます。ピペットで混ぜます。
  5. ペレット細胞デブリに、遠心分離機サンプルは13,500 x g で4°Cで10分間用いた。 新しい1.5 mLチューブに各サンプルからすべての超音波処理ライセート(上清)を転送します。
  6. 各サンプル(超音波処理されたライセートの3%)から超音波化されたライセートの30 μLを取り、超音波処理をチェックするために新しい1.5 mLのチューブに追加します。残りの超音波処理されたライセートを4°Cで保存し、抗体コーティングされたビーズでインキュベーションする準備が整います。

4. 超音波処理をチェックする

  1. 2mLの2mLを0.5 M Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M EDTAの2mL、10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の10mL、オートクレーブdDH2 Oの6mLを加えて20mLを作ります。このバッファに CPI を追加しないでください。RTで50mLチューブに保管してください。
  2. タンパク質-DNA架橋を逆にする タンパク質を除去することにより、各サンプルから30μLの超音波クロマチンを取り(ステップ3.6から)、オートクレーブddH2Oの166 μL、2xプロテイナーゼKバッファーの200 μL、20mg/mLプロテイナーゼK.の4 μLを20 mg/mLプロテイナーゼK.簡単にvoratして65°Cでインキュベート
  3. 注:超音波処理されたライセートは、一晩で65 °Cで逆リンクすることができます。
  4. 以下のように、PCIA(25:24:1)およびエタノール沈殿法を用いてDNAを抽出する。
    注意: PCIA は有毒です。標準的な個人的な保護具(PPE)が付いている煙のフードの下で使用する。
    1. 1.5 mLチューブの各サンプルに400 μLのPCIAを加え、最大速度にボルテックスを、20秒の渦サンプルに設定します。遠心分離機 18,400 x g で 6 分 RT.2つの段階が観察されます。各サンプルの上層水層(クリアフェーズ)を新しい1.5 mLチューブに慎重に移します。
    2. 37 °Cで10 mg/mL RNase A.インキュベートサンプルを30分間1μL加えます。
    3. 各サンプルに20 mg/mLグリコーゲンを1 μL加え、1 mLの氷冷100%エタノール(-20°C冷凍庫に保存)で沈殿します。簡単に混ぜ合わせ、-80°C冷凍庫でサンプルを30分から1時間インキュベートします。遠心分離機サンプルを18,400 x g で4°Cで10分間10分間、100%エタノールを慎重に注ぎます。
    4. 500 μLの氷冷70%エタノールで洗浄します(-20°Cの冷凍庫に保管)。遠心分離機 18,400 x g で 5°C で 5 分. 70%のエタノールを慎重に注ぎます。
    5. 残存エタノールが蒸発するまで50°Cで1.5mLのチューブにサンプルをインキュベートする。DNAペレットをオートクレーブddH2OまたはヌクレアーゼフリーddH2Oの15μLで再懸濁させる。
    6. 抽出したDNAサンプルをDNAラダーと共に1.5%のアガロースゲルで120-180Vで実行し、超音波処理されたDNAのサイズを確認します。

5. ビーズによる抗体インキュベーション

注: このプロトコルの次の手順は、マウス ES 細胞から分化された約 2 x 107 の ニューロン セルに対して行われます。ビーズが割れてサンプルの汚染を引き起こしたり、抗体の性能が損なわれる可能性があるため、ChIP-exo プロトコル中の任意の時点で磁気ビーズを凍結および解凍しないでください。

  1. 細胞のリシスと超音波処理の後、タンパク質G磁気ビーズ(材料表)をChIP用に調製し、均質になるまで磁気ビーズを混合し、2mLタンパク質低結合チューブに25μLの磁気ビーズを加えます。
    注:使用される磁気ビーズの種類は、抗体の種によって異なります。
  2. 1 mLのブロッキング溶液(表2)でビーズを洗浄し、よく混ぜ合わせ、磁気ラックに1分間置きます。磁気ラックに乗ったまま、はっきりしたら上清を取り外します。
  3. 磁気ビーズにブロッキング溶液を1 mL加えます。ロッキングプラットフォーム上の4°Cで10分間のロックチューブ。簡単に回転し、磁気ラックにチューブを置き、上清を取り除きます。
  4. ステップ 5.3 をさらに 2 回繰り返します。
  5. 500 μL のブロッキング溶液を磁気ビーズに加えます。Isl1(0.04 μg/μL、 材料表)に対して抗体を簡単にスピンし、ブロック溶液中の磁気ビーズを含む2 mLタンパク質低結合チューブに4μgの抗体を加えます。
  6. 抗体なしでステップ5.5を繰り返す(すなわち、ChIPに対する抗体制御なし)。
    注:添加する抗体の量は、抗体の品質とChIPに使用される細胞数を考慮して経験的に決定することができます。
  7. ロッキングプラットフォーム上で6-24時間4°Cの岩石サンプル。

6. クロマチン免疫沈降(ChIP)

  1. 1 mLのブロッキング溶液で、ステップ5.8から抗体コーティングビーズを洗浄します。サンプルを4°Cのロッキングプラットフォームに5分間置き、上清を取り除きます。
  2. ステップ 6.1 をさらに 2 回繰り返します。
  3. 50 μL のブロッキング溶液で抗体コーティングビーズを再中断し、新しい 2 mL タンパク質低結合チューブに移します。各ChIPサンプルについて、超音波処理されたライセート(ステップ3.6から約1.0 mL)を、2 mLタンパク質低結合チューブ内の抗体コーティングビーズに添加します。
  4. 各サンプルを4°Cで一晩ロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。

7. ChIPのすき

注意:ChIPの使用時にタンパク質とDNAの架橋を維持するために、サンプルを氷上または4°Cに保ちます。

  1. 高塩洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファーおよび 10 mM Tris-HCl バッファー (pH 7.4) を 表 3に記載されるようにする。50mLチューブを4°Cで保管してください。 使用直前にすべてのバッファに、1000x CPIストックの50 μLを追加します。
  2. サンプルを2 mLタンパク質低結合チューブで簡単にスピンしてキャップから液体を採取し、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を慎重に取り除きます。
  3. ChIPの場合は、各チューブに1mLのリシスバッファー3(4°C)を加えます。4 °Cのロッキングプラットフォームで5分間混ぜます。サンプルを簡単に回転させ、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り外します。
  4. 各チューブに1mLの冷たい高塩洗浄バッファーを加えます。4 °Cのロッキングプラットフォームで5分間混ぜます。サンプルを簡単に回転させ、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り外します。
  5. 各チューブに冷たいLiCl洗浄バッファーを1 mL加えます。4 °Cのロッキングプラットフォームで5分間混ぜます。サンプルを簡単に回転させ、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り外します。
  6. 各チューブに1mLのコールド10 mM Tris-HClバッファー(pH 7.4)を加えます。4 °Cのロッキングプラットフォームで5分間混ぜます。サンプルを簡単に回転させ、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り外します。
    注: トリス-HCl バッファ(pH 7.4)の代わりに、トリス EDTA バッファ(pH 8.0)を使用できます。
  7. 手順 7.4 ~7.6 を 3 回繰り返します。
  8. 500 μL の Tris-HCl バッファー (pH 7.4) を使用してサンプルビーズを新鮮な 1.5 mL チューブに移します。サンプルを簡単に回転させ、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り外します。

8. ビーズの修理とdAテーリング反応を終了

注:超音波処理は、多くの場合、非鈍終了dsDNAを生成します。dA-tailing反応の前に鈍い終了DNAを作るためにエンドリペア反応が必要であり、続いてインデックスアダプタライゲーションステップが続きます。インデックスアダプターDNAを用いた粘着末端DNAライゲーションの場合、dA-tailing反応によりdATPは鈍いdsDNA断片の3'末端に付加される。エンドプレップ反応ミックスはdATPを含む。

  1. ChIP洗浄後、1.5 mLチューブのサンプルビーズに38μLのオートクレーブddH2 Oを加え、エンドリペア反応とdAテーリング反応を行います。
  2. 各サンプル(全反応量:46μL)に、5.6 μLのエンドプレップ反応ミックスと2.4 μLのエンドプレップ酵素ミックス(材料表)を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。
  3. 以前の ChIP ウォッシュステップ 7.4-7.6 に記載されているようにビーズを洗浄します。

9.ビーズ上のインデックスアダプタライゲーション

注: インデックス アダプタには 6 ~10 のベースのバーコード付きインデックス シーケンスがあり、これは、高スループット シーケンスで複数のサンプルを多重化するために使用される特定のサンプルに固有です。インデックスアダプタのDNA配列については、 表1を参照してください。

  1. インデックスアダプターのライゲーションの場合、サンプルビーズに27 μLのコールド10 mM Tris-HClバッファー(pH 7.4)を加えます。各サンプル(全反応量:44.5μL)に、2μLの15μMインデックスアダプタ、0.5μLのライゲーションエンハンサー、15 μLのリガーゼマスターミックス(材料表)を加えます。
  2. 20°Cで15分間インキュベートします。ステップ 7.4-7.6 の説明に従ってビーズを洗浄します。

10. ビーズへのフィルイン反応

注意:アダプターのライゲーションの後、アダプターの5'の端とChIP DNAの3'末端との間にホスホジエター結合はありません。ニックは、充填反応によって修復することができます。

  1. サンプルビーズに47 μLのコールド10 mM Tris-HClバッファ(pH 7.4)を加えます。
  2. 充填反応ミックス(表4 と 材料表)を氷の上に作ります。
  3. 各サンプルに11.1 μLの充填ミックスを加えます(総反応量:58.1 μL)。30°Cで20分間インキュベートします。ステップ 7.4-7.6 の説明に従ってビーズを洗浄します。

11. ビーズのラムダエキソヌクレアーゼ消化

  1. ビーズに充填反応した後、サンプルビーズに50 μLのコールドオートクレーブddH2Oを加えます。
  2. ChIP DNAを5'~3'方向に消化するには、10倍のラムダエキソヌクレアーゼバッファーの6μLと5 U/μLラムダエキソヌクレアーゼの2μLを加えます(材料表、総反応量:58 μL)。37°Cで30分間インキュベートします。ステップ 7.4-7.6 の説明に従ってビーズを洗浄します。

12. 溶出と逆架橋

  1. 表5に記載されているように、ChIP溶出バッファを作る。
    注意: CPI を ChIP 溶出バッファに追加しないでください。
  2. ビーズからChIPサンプルを溶出するには、75 μLのChIP溶出バッファーでサンプルを再懸濁し、65°Cで130 x gで15分間インキュベートします。
  3. サンプルに20 mg/mLプロテイナーゼK(材料表)の2.5 μLを加えます。短時間渦を、その後、65°Cで一晩サンプルをインキュベートする。

13. DNA抽出

  1. サンプルを65°Cで一晩インキュベートした後、サンプルを短時間回転させ、磁気ラックに1分間置き、上澄み物を各サンプルから新しい1.5 mLチューブに移します。
  2. サンプルに10 mg/mL RNase Aの1 μLを加えます。短時間渦を、37°Cで30分間インキュベートする。最大100 μLのボリュームにオートクレーブddH 2 Oの約25μLを加えます。
  3. 磁気ビーズ(材料表)を使用してDNAを精製する。16 μLのオートクレーブ ddH2O またはヌクレアーゼフリー ddH2O を持つエルテ DNA。

14. 変性、プライマーアニーリングおよびプライマー延長

  1. ChIP溶出および逆架橋後、抽出したDNAサンプルの16 μLをステップ13.3からPCRチューブに移す。
  2. 変性とプライマーアニールミックス(表6 と 材料表)を氷の上に作ります。各サンプルに1.2 μLの変性およびプライマーアニーリングミックスを加えます(総反応量:17.2 μL)。 表6 に記載のプログラムを用いてサンプルを実行し、鋳型DNAに変性およびアニールプライマーを付ける。
  3. 氷の上にプライマーエクステンションミックス(表7 と 材料表)を作ります。
  4. 変性およびアニールプライマーのプログラムが完了したら、サンプルにプライマー拡張ミックスの3 μLを加えます(総反応量:20.2 μL)。 表 7で説明されているプライマー拡張用のプログラムを使用してサンプルを実行します。
  5. すぐにdA-テーリング反応に進みます。

15. dA-テーリング反応

注:ユニバーサルアダプターDNAを用いた粘着性末端DNAライゲーションの場合、dA-tailing反応によりdATPが鈍いdsDNAの3'末端に加えられます。

  1. 氷の上にdA-テーリングミックス(表8 と 材料表)を作ります。
  2. 各サンプルに4.1 μLのdA-テーリングミックスを加えます(総反応量:24.3 μL)。dA-tailing 用のプログラムを使用してサンプルを実行します (表 8)。
  3. すぐにユニバーサルアダプターの結紮に進みます。

16. ユニバーサルアダプターライゲーション

注: ユニバーサル アダプタには、シーケンスケミストリー用の DNA サンプル認識用のハイスループット シーケンシング固有のシーケンスが含まれています。ユニバーサル アダプタの DNA 配列については、 表 1を参照してください。

  1. dA-tailing反応後、ユニバーサルアダプターライゲーションのミックス(表9 および 材料表)をユニバーサルアダプターライゲーションにします。
  2. 各サンプルに21.5 μL(総反応量:45.8 μL)を加え、20°Cで15分間インキュベートします。

17. DNAのクリーンアップ

  1. 磁気ビーズ(材料表)を使用してDNAを精製する。21 μLのオートクレーブddH2OまたはヌクレアーゼフリーddH2Oを有するエルテDNA。
  2. ライゲーション媒介PCR(LM-PCR)およびPCR精製を行う準備ができるまで、サンプルを-20 °Cで保存します。

18. ライゲーション媒介PCR

注: LM-PCR プライマー配列については 、表 1に説明します。

  1. DNAのクリーンアップ後、LM-PCRミックス(表10 および 材料表)を氷上に作ります。
  2. 各サンプルに29 μLのLM-PCRミックス(総反応量:50 μL)を加え、LM-PCRプログラムを用いてサンプルを実行します(表10)。
  3. すぐにPCR増幅DNAのゲル精製に進み、続いてハイスループットシーケンシングのためのDNA精製を行う。

19.LM-PCR増幅DNAのDNApの分泌

  1. 1.5%アガロースゲル(120-180V)のアガロースゲルで、120~180VのDNAラダーとともにLM-PCR増幅DNAサンプルを実行し、200~400bp帯を切除します。
  2. ゲル抽出キット(材料表)を用いて、切除ゲルからDNAを精製する。
  3. DNA精製後、各ChIP-exoライブラリーサンプルの濃度(材料表)を確認します。シングル読み取りシーケンスのハイスループットシーケンス用サンプルを送信します。
    注: シングル読み取りシーケンスの推奨読み取り長さは少なくとも 35 bp であり、これは、配列読み取りをマウスまたはヒト細胞の参照ゲノムに一意に整列するのに十分です。マウスまたはヒト細胞のほとんどの転写因子では、1つのChIP-exoサンプルあたり10〜2000万読み取りでゲノム結合位置を特定するのに十分です。哺乳類細胞のヒストンマークに富んだゲノム領域をマッピングするには、サンプルあたり少なくとも3,000万読み取りが必要です。

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結果

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図2Aは、マウスES細胞から分化した運動ニューロン細胞の様々なサイクルを有する、細胞のリシスおよび超音波処理後の超音波処理結果を示す。超音波処理サイクルの最適な数(例えば、 図2Aの12サイクル)は、100-400 bp DNA断片に強いDNA強度を生成しました。高品質のChIP-exoライブラリは、断片化したクロマチンDNAのサイズと量に基づいています。したがって、ChIP-exoを開始する前に、各細胞タイプと細胞のバッチに対して超音波処理の最適化が推奨されます。

図2B は、18-21回のPCRサイクルで増幅されたChIP-exo DNAサンプルのライゲーション媒介PCR(LM-PCR)産物を示しています。LM-PCR は次世代シーケンシング用に DNA アダプターと連結された ChIP-exo DNA フラグメントを増幅します。PCRプライマーはDNAアダプタ配列の一部である。超音波処理されたDNA...

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ディスカッション

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このプロトコルでは、ChIPに続いてエキソヌクレアーゼ消化を行い、超高マッピング解像度で哺乳類細胞におけるタンパク質とDNA相互作用を同定するためのDNAライブラリーを取得する。多くの変数は、ChIP-exo実験の品質に寄与します。重要な実験パラメータには、抗体の品質、超音波処理の最適化、およびLM-PCRサイクルの数が含まれます。これらの重要な実験パラメータは、ChIP-exo実験を制限する可能性もあり、以下で説明する。

どのChIPプロトコルでも、抗体の品質は最も重要な考慮事項の1つです。ChIP-exoには、ChIPグレードの抗体を使用することを推奨します。抗体の品質は、ChIP-exo プロトコルを実施する前に確認できます。ChIP-seqまたはChIP-qPCRは、対象となるタンパク質の特異的DNA結合位置を確認することによって、ChIPグレードの抗体を検証するために使用することができる。続いて、ビーズに添加する抗体の濃度を最適化することは、タンパク質−DNA複合体が免疫沈降22,23

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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未発表のデータや貴重な議論を共有してくれたRhee研究所のメンバーに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)がRGPIN-2018-06404(H.R.)を助成金で支えました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロース、UltraPureInvitrogen16500LM-PCR増幅DNAの超音波処理(セクション4.3.6)およびゲル精製の確認(セクション19.1)
アルブミン、ウシ血清(BSA)、プロテアーゼフリー、ヒートショックアイソレーション、最小98%BioShopALB003
Isl1DSHB39.3F7による抗体注入(セクション5.6)
Bioruptor Pico DiagenodeB01060010Sonicating Chromatin (Section 3.3)
ウシ血清アルブミン (BSA)、分子生物学グレードNew England BioLabsB9000Sビーズへの充填反応 (セクション 10.2) および変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長 (セクション 14.2)
遠心分離機 5424 REppendorf5404000138クロマチンの超音波処理 (セクション 3.5)、超音波処理のチェック (セクション 4.3.1、4.3.3、4.3.4)
Centrifuge 5804 REppendorf22623508収穫、細胞の架橋および凍結 (セクション 1.3)、細胞溶解 (セクション 2.2 および 2.3)、超音波処理クロマチン (セクション 3.1)
cOmplete、Mini、EDTA-free Protease Inhibitorロシュ4693159001プロテイナーゼ K バッファーと ChIP 溶出バッファーを除くすべてのバッファーに添加
dATP 溶液New England BioLabsN0440SdA-Tailing 反応 (セクション 15.1)
デオキシコール酸ナトリウムソルトフィッシャーサイエンティフィックBP349溶解バッファー3、高塩ウォッシュバッファーおよびLiClウォッシュ
バッファーdNTPミックス、分子生物学グレードThermo ScientificR0192ビーズへのフィルイン反応(セクション10.2)および変性、プライマーアニーリングおよびプライマーエクステンション(セクション14.2)
DreamTaqグリーンPCRマスターミックス、2x Thermo ScientificK1081ライゲーション媒介PCR(セクション18.1)
EDTA、0.5 m、滅菌溶液、pH 8.0BioShopEDT111バッファー1-3、超音波処理のチェック(セクション4.1)、高塩洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファーおよびChIP溶出バッファー
エチルアルコール無水、100%P006EAAN市販アルコール(セクション4.3.3)
ホルムアルデヒド、36.5-38%、10-15%を含むメタノールSigmaF8775細胞の採取、架橋および凍結 (セクション 1.1)
グリセロール、試薬グレード、最小 99.5%BioShopGLY002溶解バッファー 1
グリシン、バイオテクノロジーグレード、最小 99%BioShopGLN001細胞の採取、架橋および凍結 (セクション 1.2)
グリコーゲン、RNA グレードThermo ScientificR0551超音波処理のチェック (セクション 4.3.3)
HEPES、1 M 滅菌ろ過溶液、pH 7.3 BioShopHEP003Lysis Buffer 1, High Salt Wash
Buffer Klenow Fragment (3->5 exo-)New England BioLabsM0212SdA-テーリング反応 (セクション 15.1)
ラムダ エキソヌクレアーゼNew England BioLabsM0262Sラムダ エキソヌクレアーゼ ビーズの消化 (セクション 11.2)
リガーゼエンハンサーNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNAライブラリーキット。インデックスアダプターライゲーション on ビーズ (セクション 9.1) およびユニバーサルアダプターライゲーション (セクション 16.1)
Ligase Master MixNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA Library Kit.ビーズ上のインデックスアダプターライゲーション(セクション9.1)およびユニバーサルアダプターライゲーション(セクション16.1)
塩化リチウム(LiCl)、試薬グレードBioshopLIT704LiCl Wash Buffer
ChIP用磁気ビーズ(Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G(ChIP用磁気ビーズ)Dynabeads Protein G(ChIP用磁気ビーズ)ビーズによる抗体インキュベーション(セクション5)
DNA精製用磁気ビーズ(AMPure XP Beads)ベックマン・コールターA63880DNA 抽出 (セクション 13.3) および DNA クリーンアップ (セクション 17.1)
磁気ラック (DynaMag-2 マグネット)Invitrogen12321Dセクションの多くのステップで使用されます: 5 - 11, 13
MinElute ゲル抽出キットQiagen 28604PCR増幅DNAのゲル精製(セクション19.2)
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液、30%水溶液、≥97.0% (HPLC)Sigma61747溶解バッファー 3
オクチルフェノール エトキシレート (IGEPAL CA630)BioShopNON999溶解バッファー 1 および LiCl 洗浄バッファー
フェノール:クロロホルム:イソアミル アルコール、バイオテクノロジー グレード (25:24:1)BioShopPHE512超音波処理の確認 (セクション 4.3.1)
phi29 DNA ポリメラーゼニューイングランド バイオラボM0269Lビーズへの充填反応(セクション10.2)および変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長(セクション14.3および14.4)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1x Corning21040CV細胞の収穫、架橋および凍結 (セクション 1.3) および超音波処理クロマチン (セクション 3.1)、ビーズによる抗体注入 (セクション 5.1)
PowerPac 基本電源BioRad1645050超音波処理 (セクション 4.3.6) および LM-PCR 増幅 DNA のゲル精製 (セクション 19.1)
ProFlex PCR システムApplied BiosystemsProFlex PCR システムセクションで使用:14.2、14.4、15.2、16.2、18.2
LoBindチューブ、2.0 mL Eppendorf22431102Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3)
Proteinase K Solution, RNA GradeInvitrogen25530049Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)Qubit
4.0 FluorometerInvitrogenQ33226Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Quibit dsDNA BR assayキットInvitrogenQ32853PCR 増幅 DNA のゲル精製 (セクション 19.3)
Rnase A、Dnase およびプロテアーゼフリーThermo ScientificEN0531超音波処理 (セクション 4.3.2) および DNA 抽出 (セクション 13.2)
塩化ナトリウム (NaCl)、BioReagent SigmaS5886バッファー1-3、高塩洗浄バッファード
デシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動グレードBioShopSDS001超音波処理(セクション4.1)、高塩洗浄バッファーおよびChIP溶出バッファー
超音波処理ビーズおよび15mLバイオラプターチューブジアゲノードC01020031クロマチン超音波処理(セクション3.1および3.2)
ThermoMixer F1.5 エッペンドルフ5384000020セクション 4.2、4.3.2、4.3.5、8.2、9.2、10.3、11.2、12.2、12.3、13.2、16.2
Trizma 塩酸塩溶液 (Tris-HCl)、BioPerformance 認証済み、1 M、pH 7.4SigmaT219410 mM Tris-HCl バッファー
Trizma 塩酸塩溶液 (Tris-HCl)、BioPerformance 認証済み、1 M、pH 8.0SigmaT2694Lysis Buffer 2、Lysis Buffer 3、Checking Sonication (Section 4.1)、LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)New England BioLabsE7546SEnd Prep Reaction mix および End Prep Enzyme Mix です。ビーズのエンドリペアおよびdA-テーリング反応(セクション8.2)
VWRミニチューブロッカー、可変速VWR10159-752多くのステップで使用されます:1、2、5、6および7
2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール、トリトンX-100、試薬グレードBioShopTRX506溶解バッファー1、超音波クロマチン(セクション3.4)および高塩洗浄バッファー
に対する抗体のビーズ カクテル 溶解超音波処理のチェックタンパク質溶解セクションの

参考文献

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