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方法論記事

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

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DOI:

10.3791/61127

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2020年5月16日

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, St. Jude Children's Research Hospital

この記事について

サマリー

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。

要約

エクソソームは、ほぼすべての細胞から放出され、すべての体液中に分泌される小さな細胞外小胞です。これらの小胞を単離するために、超遠心分離、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィーなど、多くの方法が開発されています。しかし、すべてが大規模なエクソソームの精製や特性評価に適しているわけではありません。ここでは、成体マウスの骨格筋から単離された初代線維芽細胞の培養を確立し、その後、これらの細胞の培養培地からエキソソームを精製および特性評価するためのプロトコルを概説します。この方法は、連続した遠心分離ステップとそれに続くスクロース密度勾配の使用に基づいています。次に、エキソソーム調製の純度を、一連の標準マーカー(Alix、CD9、CD81など)を用いたウェスタンブロット解析によって検証します。プロトコルは機能調査のための電子顕微鏡検査、質量分析および通風管の実験のためのbioactiveexosomesを隔離し、集中する方法を記述する。スケールアップやスケールダウンが容易で、さまざまな細胞タイプ、組織、体液からのエクソソーム単離に適応させることができます。

概要

エクソソームは、30〜150nmのサイズの不均一な細胞外小胞です。それらは、組織や器官に遍在的に分布していることから、生理学的および病理学的プロセスにおける確立された主要なプレーヤーです1,2。エクソソームは、タンパク質、脂質、DNAタイプ、RNAタイプの複雑なカーゴを運び、それらはそれらが由来する細胞の種類によって異なります1,2,3。エクソソームは、異なる機能を持つタンパク質(すなわち、CD9およびCD63を含むテトラスパニン)が豊富であり、融合イベントの原因となります。例えば、熱ショックタンパク質であるHSP70やHSP90は、抗原の結合や提示に関与しています。さらに、アリックス、Tsg101、およびフロチリンは、エクソソームの生合成と放出に関与し、これらのナノベシクルのマーカーとして広く使用されています2,3,4。

また、エクソソームにはさまざまなRNA(マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA)が含まれており、これらはレシピエント細胞に伝達され、下流のシグナル伝達に影響を与えます3。単一の単位膜で囲まれているため、エクソソームの生理活性は、タンパク質および核酸のカーゴだけでなく、制限膜1の脂質成分にも依存する。エキソソーム膜には、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、コレステロール、スフィンゴミエリン、アラキドン酸、その他の脂肪酸が豊富に含まれており、これらはすべてエクソソームの安定性と膜トポロジーに影響を与える可能性があります2,3。カーゴと脂質の配置の結果として、エクソソームは受容細胞のシグナル伝達経路を開始し、正常組織生理学の維持に関与します1,2,4,5。特定の病理学的条件(すなわち、神経変性、線維症、および癌)の下で、それらは病理学的刺激を誘発し、伝播することが示されています4,6,7,8,9,10,11。

エクソソームは、近隣または遠隔の部位にシグナルを伝播する能力があるため、疾患の診断や予後のための貴重なバイオマーカーとなっています。さらに、エクソソームは治療用化合物のビヒクルとして実験的に使用されている2,12。これらのナノベシクルを臨床に応用する可能性は、最大の収量、純度、および再現性を達成するために、単離法をますます重要にしています。エクソソームを単離するためのさまざまな技術が開発され、実施されています。一般に、エキソソームは、示差遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、および免疫捕捉(市販のキットを使用)によって、馴化細胞培養培地または体液から単離することができる。各アプローチには、前に説明した独自の長所と短所があります1、2、13、14。

概説されたプロトコルは、1)成体マウス腓腹筋からの一次線維芽細胞の単離と培養、および2)これらの細胞によって培地に放出されたエクソソームの精製と特性評価に焦点を当てています。機能研究のための初代線維芽細胞からのエキソソームの単離のための十分に確立されたプロトコルは、現在不足しています。初代線維芽細胞は大量のエクソソームを分泌しないため、単離と精製のプロセスが困難になります。このプロトコルは形態学的な完全性および機能活動を維持している間大きい培養容積からのたくさんの純粋なexosomesの浄化を記述する。馴化培地から得られた精製エキソソームは、レシピエント細胞に特異的なシグナル伝達経路を誘導するために、in vitroでの取り込み実験で成功裏に使用されています。また、複数の生体試料から採取したエキソソームカーゴの比較プロテオミクス解析にも使用されています4。

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プロトコル

マウスにおけるすべての処置は、St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use CommitteeおよびNational Institutes of Healthのガイドラインによって承認された動物プロトコルに従って実施された。

1. 溶液と培地の調製

  1. 15.4 mL の PBS と 2.5 mL の 20 mg/mL コラゲナーゼ P(最終濃度 5 mg/mL)、2 mL の 11 U/mL ディスパーゼ II (最終濃度 1.2 U/mL)、1.0 μL の 1.0 M CaCl2 (最終濃度 5 mM)を混合して消化溶液を調製します。
  2. 440 mLのDMEMと50 mLのFBS(10%)、5.0 mLのペン/連鎖球菌(それぞれ100 U/mLおよび100 μg/mL)および5.0 mLのグルタミンサプリメント(2 mM)を混合して、500 mLの一次線維芽細胞培地(DMEM完了)を調製します。孔径0.22μmの真空フィルターで培地をろ過滅菌します。
  3. 38.5 mLのポリプロピレンチューブ中で、4°C、100,000 x g のFBSを一晩超遠心分離して、エキソソームフリー血清を調製し、上清を新しいチューブに移します。
  4. 440 mL の DMEM と 50 mL のエキソソームフリー血清(10%)、5 mL のペン/ストレプ菌 (100 U/mL および 100 μg/mL)、5 mL のグルタミンサプリメント (2 mM) を混合して、500 mL のエキソソームフリー培地を調製します。孔径0.22μmの真空フィルターで培地をろ過滅菌します。
  5. 6.057gのトリス塩基を90mLのdH2Oに溶解し、pHをHClで7.4に調整することにより、0.5 M Tris-HCl(pH 7.4)を調製します。
  6. 97.9 mLのdH 2 Oと2mLの0.5 M Tris-HCl(pH = 7.4)および100 μLの1 M Mg(Ac)2を混合して、10 mM Tris-HCl(pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2溶液(スクロースワーキング溶液)を調製します。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を溶液に添加し、溶液を氷上に保管してください。
  7. 表1に従って氷上でスクロース密度勾配溶液を調製します。これらの溶液は、2本のスクロースグラジエントチューブを調製するのに十分です。
  8. 100gのTCA粉末に40 mLのdH2Oを加えて100%TCAを調製し、完全に溶解するまで混合します。dH2Oで最終容量を100 mLに調整します。
  9. 20mLのdH2Oと80mLの100%エタノールを混合して80%エタノールを調製する。
  10. 1.8 Lの精製水(dH2O)と200 mLの10倍のランニングバッファーを混合して、ウェスタンブロットのランニングバッファーを調製します。
  11. 1.4 LのdH2Oと200 mLの10x転写バッファーおよび400 mLのメタノールを混合して、ウェスタンブロット転写バッファーを調製します。転写バッファーを4°Cに予冷します。
  12. 122 gのトリス塩基と180 gの塩化ナトリウムを850 mLのdH2O(pH 8.0)に溶解して、20xトリス緩衝生理食塩水(TBS)を調製します。容量をdH1Oで2 Lに調整します。
  13. 5 gの脱脂粉乳を1 mLの10% Tween-20、5 mLの20x TBS、および94 mLのdH2Oに溶解してブロッキングバッファーを調製します。
  14. 3 g の BSA を 1 mL の 10% Tween-20、5 mL の 20x TBS、および 94 mL の dH2O に溶解して抗体バッファーを調製します。
  15. 100 mL の 20x TBS と 20 mL の 10% Tween-20 (10 x) を 1.88 L の dH2O と混合して、洗浄バッファーを調製します。
  16. 1容量のルミノール/エンハンスと1容量の安定な過酸化物緩衝液を混合して現像液を調製します。

2. マウス腓腹筋(GA)の解剖15,16

  1. 氷上で10 mLのPBSを含む50 mLチューブを調製します。
  2. CO2チャンバーでマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼させます。
  3. 両足から腓腹筋を取り除き、氷上でPBSを使用してチューブに移します。
    注:GA筋をPBSに移す前に、GA筋からヒラメ筋を取り除きます。

3. マウス初代線維芽細胞の単離と培養

  1. 筋肉の重さを量り、バイオセーフティフードの下の10cmの皿に移します。筋肉をメスで細かいペーストになるまで細かく刻みます。
  2. 細かく刻んだマッスルペーストを50 mLチューブに移し、3.5倍の体積/mg組織の消化液をチューブに加え、37°Cで45分間インキュベートします。 懸濁液を10分ごとに5 mLピペットで完全に混合します(これにより、完全な解離に役立ちます)。
    注:あるいは、このステップには組織解離剤を使用することができる。
  3. 20 mLのDMEM completeを細胞懸濁液に加え、消化液を不活化します。50 mLチューブに置かれた70 μmのナイロンセルストレーナーに移します。フロースルーを回収し、さらに5 mLのDMEMでセルストレーナーを洗浄します。
  4. 細胞懸濁液を室温(RT)で300 x g で10分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。
  5. ペレットを10 mLのDMEMコンプリートに再懸濁し、細胞を10 cmのディッシュに播種します。
  6. 細胞を37°C、5%CO2、3%O2 (継代0またはP0)で培養する。
    注:1)これらの培養物は、生理学的に類似した状態(骨格筋のO2 レベルは約2.5%)を確保するために、低酸素レベルに維持する必要があります17。2)細胞培養の継代数(例:P0)は、培養物が継代培養された回数の記録です。3)P0の初代線維芽細胞は、100%コンフルエントに1日を加えるまでルーチン培養されます(P0のみ)。これは、他の種類の細胞をパージし、培養物に存在する細胞が線維芽細胞のみであり、顕微鏡検査に基づいて筋原性細胞が枯渇していることを保証するためです。生後2ヶ月の成体動物の骨格筋には、約2%の筋原性前駆細胞が含まれています4。さらに、筋原性前駆細胞は通常、コーティングされていない皿に付着しません。したがって、それらは継代培養中に失われます18、19、20。筋原性細胞には、20%FBSと塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加した別の培地(F10)が必要です18。DMEMコンプリートでは、中程度の線維芽細胞は筋原性細胞よりも増殖率が高く、その結果、最初の継代の前にこれらの汚染細胞が排除されます。
  7. 100%コンフルエントプラス1日でP0細胞をPBSですすぎます。1 mLのトリプシン化溶液を加え、37°C、5%CO2、3% O2 でインキュベートして細胞を剥離します。10 mLのDMEMコンプリートを使用して酵素活性を停止します。
  8. 細胞を300 x g で10分間室温で遠心分離し、ペレットを20 mLのDMEMコンプリートに再懸濁し、15 cmのディッシュ(継代1またはP1)に播種します。細胞は80%〜90%のコンフルエントまで増殖し、継代3まで増殖させることができます。
    注:下流の実験に応じて、通路1、通路2(P2)、または通路3(P3)を使用できます。

4. 細胞の播種と馴化培地の採取

  1. 線維芽細胞(P1、P2、またはP3)を10mLのPBSで洗浄し、2.5mLのトリプシン処理溶液を細胞に加え、37°C、5%CO2、3%O2でインキュベートします。10 mLのDMEMコンプリートを使用して酵素活性を停止します。
    注:継代4以降、初代細胞は廃棄され、特性が変化するため、それ以上の実験には使用しないでください。
  2. 細胞を回収し、室温で300 x g で10分間遠心分離します。
  3. 細胞ペレットを10 mLのエキソソームフリー培地に再懸濁し、細胞をカウントします。
  4. 1皿あたり1.5–2.0 x 106個の細胞(15 cm)で細胞を播種し、37°C、5%CO 2、3%O2でインキュベートします。
  5. コンディショニングした培地を氷上の50 mLチューブに16〜24時間集めます。
    注:細胞が80%コンフルエントでない場合は、新鮮なエキソソーム遊離培地を再度添加し、さらに16〜24時間後に回収することができます。この 2 つのコレクションは、さらに処理するために組み合わせることができます。

5. 差動および超遠心分離によるエクソソームの精製

注意: すべてのステップは、4°Cまたは氷上で実行されます。必要に応じて、水で満たされたチューブとチューブのバランスを取ります。

  1. 馴化培地を300 x g で10分間遠心分離して生細胞を除去し、上清を新しい50 mLチューブに移します。
  2. 2,000 x g で10分間遠心分離して死細胞を除去し、上清を38.5 mLのポリプロピレンチューブに移します。
  3. 上清を10,000 x g で30分間遠心分離し、細胞小器官、アポトーシス小体、および膜断片を除去します。上清を38.5 mLの超透明チューブに移します。
  4. 上清を100,000 x g で1.5時間超遠心分離し、エクソソームをペレット化します。
  5. 上清を慎重に廃棄し、約1 mLの馴化培地を残し、エキソソームペレットを総量30 mLの氷冷PBSで洗浄します。
  6. 100,000 x g で1.5時間遠心分離し、エキソソームペレットを乱さないように注意しながら、ピペッティングにより上清を慎重に廃棄します。
  7. ペレットを氷冷PBS(15 cmディッシュあたり~25 μL)に再懸濁し、BCAタンパク質アッセイキットとマイクロプレートリーダーを使用して562 nmでタンパク質濃度を測定します。
    注:タンパク質濃度は、0.1% Triton-X100 in dH 2 Oで1:2希釈して測定します。80%のコンフルエントさでの一次線維芽細胞の15cmディッシュ(20mLのコンディショニング培地)からのエキソソームの収量は、3~4μgです。

6. ショ糖密度勾配によるエクソソームのキャラクタリゼーション

  1. 1.5 mL の 2.0 M、2.5 mL の 1.3 M、2.5 mL の 1.16 M、2.0 mL の 0.8 M、2.0 mL の 0.5 M スクロース溶液をピペッティングして、13 mL の超透明チューブにスクロースグラジエントをロードします。
  2. 30〜100 μgのエキソソームを0.25 Mショ糖溶液と混合し、容量を1 mLに調整します。
  3. グラジエントの上にエキソソームを慎重にロードし、サンプルを 100,000 x g および 4 °C で 2.5 時間超遠心分離します。
  4. 超遠心分離機からチューブを取り出し、氷上に置き、グラジエントの上部から 1.0 mL のフラクションを回収します。氷上で1.7 mLのチューブに移します。
  5. 110 μL の 100% TCA を各チューブに添加し、よく混合し、室温で 10 分間インキュベートします。
  6. 10,000 x g およびRTで10分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。
  7. ペレットを予冷した80%エタノール500μLに再懸濁し、サンプルを-20°Cで10分間洗浄します。
  8. 10,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  9. ペレットを室温で10〜15分間乾燥させ、in vitro実験のためにペレットをPBSに再懸濁します。BCAタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定するか、ウェスタンブロット分析のために14.5 μLのdH2O、5 μLの4x Laemmliバッファー、および0.5 μLの1 M DTTにペレットを直接再懸濁します。

7. ウェスタンブロット解析によるエクソソーム検出

  1. ステップ5.7のエキソソーム5〜10 μgを5 μLの4x Laemmliバッファー、および0.5 μLの1 M DTTと混合し、最終容量をdH2Oで20 μLに調整します。 ステップ6.9のサンプルを含むすべてのサンプルを98°Cで5分間加熱します。
  2. サンプルを10%TGX染色フリーゲルにロードし、メーカーの推奨に従ってタンパク質ラダーをロードします。
    注:目的のタンパク質の分子量に応じてゲルの割合を選択してください。
  3. ローディング色素がゲルの底部に達するまで、ゲルを100 Vで流速バッファー中で~1時間泳動させます。
    注:実行時間は、使用する機器、またはゲルの種類と割合によって異なる場合があります。
  4. ゲルを画像化します。染色されていないゲルの画像は、イムノブロットのローディングコントロールとして使用されます。
  5. PVDFメンブレンを使用して、80 Vで1.5時間、または30 V、4°Cで一晩ゲルを転写します。
  6. メンブレンをブロッキングバッファーで室温で1時間ブロッキングします。
  7. 特異的抗体のメンブレン(表2)を抗体バッファー中で、4°Cで一晩撹拌しながらインキュベートします。
  8. メンブレンを洗浄バッファーで洗浄し、メンブレンを適切な二次抗体(表2)とともに室温で1時間、攪拌しながらインキュベートします。
  9. メンブレンを洗浄バッファーで洗浄し、現像液とカメラベースのイメージャーを使用してメンブレンをイメージングします。または、X線フィルムを使用してメンブレンを現像します。

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結果

このプロトコルは、費用対効果の高い方法で大量の調整培地からエキソソームを精製するのに適しています。この手順は再現性が高く、一貫性があります。 図1 は、マウス初代線維芽細胞の培養液から精製したエクソソームの透過型電子顕微鏡(TEM)画像です。 図2 は、標準的なエキソソームマーカーのタンパク質発現パターンと、細胞質(LDH)およびER(カルネキシン)タンパク質汚染物質の不在を示しています。 図 3 は、スクロース密度勾配後の標準エキソソームマーカー(Alix、CD9、および CD81)の分布を示しています。

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図1:マウス初代線維芽細胞の培地から単離したエク...

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ディスカッション

このプロトコルで概説されているように、培地からのエキソソームの単離を成功させるための重要なステップは、成体骨格筋からの初代マウス線維芽細胞培養の適切な確立と維持です。これらの培養物は、生理学的に類似した状態(骨格筋のO2レベルは~2.5 %)を確保するために、低酸素レベルに維持する必要があります15。初代線維芽細胞は、培養に何度も通すと特性が変化します。したがって、理想的なエキソソーム収量を得るためには、継代数を低くすることが不可欠です。精製したエキソソームは、直ちに実験目的で使用するか、必要になるまで-80°Cでアリコートで凍結保存してください。プロトコルのもう一つの重要なステップは、毎回新鮮に調製されたスクロース溶液を使用することです。この方法の限界は、初代線維芽細胞は一般に、他の分泌細胞のように大量のエクソソームを分泌しないため、時間がかかることである。そのため、大規模な培養を行う必要があり、その結果、大量の馴化培地を処理することになります。

ここで使用される示差遠心分離の利点は、スケーラブルなアプローチ(...

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開示事項

著者の誰一人として、宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

Alessandra d'Azzo(アレッサンドラ・ダッツォ)は、Jewelers for Children(JFC)の遺伝学および遺伝子治療の寄附講座を保持しています。この活動は、NIHの助成金R01GM104981、RO1DK095169、CA021764、メンフィスのアッシジ財団、およびアメリカのレバノンのシリア関連慈善団体によって部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 cm皿中西部科学、TPPTP93100
15 cm皿中西部科学TP93150
BCAタンパク質アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック、ピアス23225
ウシ血清アルブミン フラクションVシュ10735094001
CaCl2シグマC1016-100G
ローター付き遠心分離機 5430R FA-35-6-30/ FA-45-48-11エッペンドルフ022620659/5427754008
Chemidoc MP イメージングシステムBioRad12003154
Collagenase PSigma, Roche11 213 857 001100 mg
cOmplete protease inhibitor CocktailMillipore/Sigma, Roche11697498001
Criterion Blotter with plate electrodesBioRad
Criterion TGX 無染色タンパク質ゲルBioRad5678034 10% 18 ウェル midi-gel
Criterion 縦型電気泳動細胞 (midi)BioRadNC0165100
Dispase IISigma, Roche04 942 078 001中性プロテアーゼ、グレード II
DithiothreitolSigma/Millipore, Roche10708984001
ダルベッコS モディフィケーション イーグルス ミディアコーニング15-013-CV
ダルベッコ 'S リン酸緩衝生理食塩水Corning21-031-CV
エタノール 200 プルーフPharmco by Greenfield Global111000200
Falcon 50 mL 円錐形遠心分離管Corning352070
ウシ胎児血清Gibco10437-028
Fluostar Omega マルチモード マイクロプレート リーダーBMG Labtech
GlutaMAXサプリメントThermo Fisher Scientific, Gibco35050-061
塩酸Fisher ScientificA144S-500
Immobilon-P 転写膜ミリポアIPVH00010
Laemmli サンプルバッファー (4x)BioRad1610747
酢酸マグネシウム溶液Sigma63052-100ml
脱脂粉乳LabScientificM-0842
O2/CO2インキュベーターSanyoMC0-18M
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, Gibco15140-12210,000 U/ml
プレミアム微量遠心チューブFisher Scientific, Midwest ScientificAVSC15101.7 mL
保護済み使い捨てメスフィッシャーサイエンティフィック、アスペンサージカルバードパーカー372610
ランニングバッファーBioRad1610732
塩化ナトリウムッシャーサイエンティフィック、フィッシャーケミカルS271-3
リカップクイックリリース-GP滅菌真空ろ過システムミリポアS2GPU05RE500mL
細胞ストレーナー(70 mm)フィッシャーサイエンティフィック、フィッシャーブランド22-363-548
ショ糖フィッシャー・サイエンティフィック、フィッシャー・ケミカルS5-500
スーパーシグナル ウェスト フェムトサーモフィッシャー・サイエンティフィック34096
薄肉 ポリプロピレンチューブベックマン・コールター326823
トランスファーバッファーBioRad16110734
トリクロロ酢酸Sigma91228-100G
トリスベースBioRad1610719
Triton-X100 溶液Sigma93443-100mL
TrypLE Express 酵素サーモフィッシャーサイエンティフィック, Gibco12604-013フェノールレッドなし
Tween-20BioRad#1610781
超遠心分離機 Optima XPMベックマン・コールターA99842
超透明チューブ (14x89mm)ベックマン・コールター344059
ウルトラクリアチューブ (25x89 mm)ベックマン・コールター344058
ウォーターバス Isotemp 220フィッシャーサイエンティフィックFS220
ロ1704070ム フィステ滅菌

参考文献

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