ラットの慢性移植のための末梢神経刺激電極の調製

サマリー

小さなげっ歯類で使用するために慢性的に埋め込まれた末梢神経カフ電極を構築するための既存のアプローチは、多くの場合、特殊な機器および/または高度な訓練を受けた人員を必要とします。このプロトコルでは、慢性的に埋め込まれたカフ電極を作製するためのシンプルで低コストのアプローチを示し、ラットにおける迷走神経刺激(VNS)の有効性を実証する。

要約

末梢神経カフ電極は、神経科学および関連分野において、例えば迷走や坐骨神経の刺激に用いられてきた。最近のいくつかの研究では、運動リハビリテーション、絶滅学習、感覚的差別を改善するために中枢神経系の可塑性を高める上で慢性VNSの有効性が実証されています。このような研究で使用する慢性的に埋め込まれたデバイスの構築はラットの小さなサイズのために困難であり、典型的なプロトコルは、人員と時間のかかる微細加工方法の広範な訓練を必要とします。あるいは、市販の埋め込み型カフ電極は、大幅に高いコストで購入することができる。本プロトコルでは、ラットで使用するための小型で慢性的に埋め込まれた末梢神経カフ電極の構築のための、簡単で低コストの方法を提示する。ケタミン/キシラジン麻酔ラットのVNSが、移植時とデバイス移植後10週間の両方で、ヘリング・ブロイアー反射の活性化と一致する呼吸数の低下を生じることを実証することによって、カフ電極の短期および長期の信頼性を検証します。さらに、VNSと熟練したレバープレス性能を組み合わせて運動皮質マップの可塑性を誘導することにより、慢性刺激研究に使用するカフ電極の適合性を実証する。

概要

最近では、末梢神経の刺激のための慢性的に埋め込まれたカフ電極の需要が高まっており、研究が多数の炎症性疾患の治療のためにこの技術の前臨床有用性をますます実証するにつれて^{,2,3、1、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。,5,6,13,14,151,7,8,9,10,11,12}慢性VNSは、例えば、様々な学習文脈において新皮質可塑性を増強することが^,示されており、運動リハビリテーション^{4、5、6、7、8、5,6,7,8}絶滅学習⁴10、11、12、13、14、および感覚的識別¹⁵を改善する。^{10,1112,13,14}市販の末梢神経カフ電極は、多くの場合、注文のフルフィルメントのための延長時間と比較的高いコストに関連付けられており、アクセシビリティを制限することができます。あるいは、慢性的に埋め込まれたカフ電極の「社内」製造のためのプロトコルは限られたままであり、げっ歯類解剖学は、その小さなサイズのために特定の課題を提示する。慢性げっ歯類実験のためのカフ電極を構築するための現在のプロトコルは、多くの場合、複雑な機器や技術だけでなく、広範な訓練を受けた人員の使用を必要とします。このプロトコルでは、以前に公開され、広く使用されている方法^16、17,17に基づいてカフ電極製作への簡単なアプローチを示しています。左頸管迷走神経の周りのカフ移植時に、カフ電極に加えられる刺激がSpO2の呼吸と低下の停止に成功したことを実証することによって、ラットに慢性的に埋め込まれた電極の機能を検証します。心肺受容体バベイル繊維の刺激は、ヘリングブロイアー反射に関与することが知られており、脳幹におけるいくつかの呼吸核の阻害が抑制のインスピレーション¹⁸をもたらす。従って、ヘリングブロイアー反射と一致する呼吸の停止、および結果として得られるSpO2の低下は、麻酔下ラットにおける適切な電極注入およびカフ機能のための簡単なテストを提供する。慢性的に埋め込まれたカフ電極の長期機能性を検証するために、移植時に反射応答を測定し、移植後6週間後に同じ動物で得られた応答と比較した。ラットの第2のグループは、レバープレス作業の行動訓練の後、VNSカフ電極で移植された。これらのラットでは、VNSは正しいタスク性能と組み合わせることで、皮質運動マップの再編成を生じ、以前に発表された研究^{19、20、21、2220,21,22}と一致する。¹⁹デバイス移植後5~10週で起こった麻酔下での運動皮質マッピングの時点で、VNSが呼吸停止を誘発し_、SpO2の5%以上の低下を引き起こしたことを確認することで、VNS処理動物のカフ機能をさらに検証しました。

^,Childs et al.^8,17および Rios ら¹⁶の最近公開されたプロトコルは、この一般的な方法がげっ歯類^,,,,1、2、³、^4、5 、^,6、⁸、⁹、^10、511の慢性 VNS 研究を行う複数のラボで利用されてきたように、簡略化されたカフ電極の製造アプローチの適切な開始点^を提供します。オリジナルの方法では、カフ電極の製造が完了するまでに1時間以上かかるような微細なマイクロワイヤを操作するためのいくつかの高精度のステップと、確実に実行するための広範なトレーニングが含まれます。ここで説明する簡略化されたアプローチは、材料とツールを大幅に削減し、最小限の訓練を受けた人員によって1時間以内に完了できます。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ダラスのテキサス大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました。

1. 刺激カフ電極の製造

1. カフチューブを準備します。
   1. カミソリの刃を使用して、長さ2.5mmのポリマーチューブを切ります。チューブを通して鉗子の先端またはペーパークリップを挿入し、刃を使用して、袖口の片側の管の壁を通して縦にスリットを作ります。
   2. チューブから鉗子を取り外し、長軸に垂直なカフの正中線を通して大きな縫製針を挿入します。スリット(上)を通して、反対側のチューブの中央(下)に針を挿入します。残りの組み立てステップ中に袖口を固定するために、フォームボードに針を置きます。
2. 注入の間に袖口閉鎖を固定するための縫合を置く。
   1. 袖口の壁を通して小さな縫製針を中線に、一方の端の上のスリットから約0.5 mm挿入します。袖口の損傷を避けるために、内部から外装に針を挿入します。針の目を通して6/0縫合糸の2cmの長さを挿入し、糸を袖口に通すために管の壁を通して針を引っ張ります。
   2. 糸を所定の位置に残し、針を取り外し、袖口の正中線に沿って、最初の穴の下約0.5mm下のチューブウォールに2番目の穴を穿刺します。針の目から縫合糸を挿入し、チューブウォールを通して針を引き、縫合糸を再び袖口に通します。
   3. 縫合糸の両端が袖口の外側にあるはずです。上の穴から約1.5cm伸び、下穴から約0.5mm伸びるように縫合を調整します。
   4. 下の穴から伸びる縫合糸の短い端に少量のUV硬化接着剤を塗布し、下尾がチューブの外壁とほぼ同じになるまで長い縫合端を引っ張ります。UV杖を使用して接着剤を硬化させ、縫合糸をしっかりと所定の位置に保持します。
   5. カフの反対側で、ステップ 1.2.1 ~ 1.2.3 を繰り返します。
3. プラチナ:イリジウム(Pt:Ir)ワイヤーリードを配置します。
   1. カフの壁に4穴を作るために小さな縫製針を使用してください。各穴のペアは、垂直な正中線から約 0.5 ~0.8 mm、袖口の両側の上部スリットから約 0.5 ~ 0.8 mm の穴を配置する必要があります。
      注意: リードの最も一貫した正確な配置のために、ガイドとして縫合線の配置を使用して、すべての穴を作るために内部から外装に針を挿入します。
   2. 縫製針を再び挿入し、今度は外装から内部まで、リードホール1を通して作業します。約0.5cmの長さ7.5cmのPt:Irワイヤーを針の目に通し、チューブを通して針を引き、ワイヤーリードをカフの壁に通します。袖口の外側に約4.5 cmが伸びるようにワイヤーを調整します(図1A)。
   3. リードホール1を通して針を再び挿入し、再び外装から内部に作業し、さらにリードホール1の真向かいにリードホール2を通して針を挿入する。Pt:Irワイヤーの短い(内部)端の0.5cmを針の目に差し込み、チューブを通して針を引き、ワイヤーリードをカフの壁に通します。
      注: Pt:Ir ワイヤの両端がカフの外側側に、スリット エッジの周囲とリード ホール 1 (図 1B)を通るワイヤ ループが形成されます。
   4. ステップ 1.3.1 ~ 1.3.3 を繰り返して、Pt:Ir ワイヤをリード穴 3 と 4 に配置します。
   5. ブタンライターを使用して、リードホール2とリードホール4から延びるPt:Irワイヤの端部にある5~6mmの長さから断熱材を慎重に取り外します。
      注意:袖口に損傷を与えないように注意深く袖口アセンブリの残りの部分からリードの端を分離します。工具を使用して、損傷を防ぐためにワイヤーを保持します。
   6. 袖口の内側に裸のワイヤーを合わせて、リードを最終的な位置に配置します。これを行うには、穴 1 から延びる Pt:Ir ワイヤの端を、ワイヤの絶縁されていない部分が穴 1 でフラッシュされるまで、そっと引っ張ります。他のリードで繰り返し、リードホール3と4を通して配線の絶縁されていない端を揃えます。
   7. リードホール1と3のカフの外側側のワイヤーループに少量のUV硬化接着剤を塗布します。紫外線杖を使用して接着剤を硬化させ、リードを所定の位置に固定します。
   8. カフの内壁に対して絶縁されていないPt:Irワイヤーリードを押すために小さなピペットの先端を使用してください。リードが所定の位置に配置されたら、リード穴 2 と 4 から延びるワイヤの端部を切断し、約 1 mm のワイヤがカフの外側を越えて伸びるようにします。
   9. ワイヤーの1mmの尾を袖口の外面に対して平らに折り返し、それらを一緒に短くしないように注意してください。2つの尾を覆うだけで、少量のUV硬化剤を塗布し、接着剤を硬化させ、鉛配置を確保し、電気絶縁を提供します。
      注意:外部に露出したPt:Ir表面を接着剤で完全に覆い、ワイヤーを絶縁し、オフターゲット刺激を避けることは重要です。
4. 縫合線を固定して、Pt:Irワイヤリードを所定の位置に固定します。
   1. 泡板から袖口アセンブリと大きい針を取り外します。針の目を通して6/0縫合糸の3cmの長さを挿入し、中点の袖口の底に縫合を通すためにチューブを通して針を引っ張ります。
   2. 小さな縫製針に切り替えて、Pt:Irリード固定のための縫合糸を完了します。チューブとワイヤリードの変形を避けるために、内部から外部に再び作業して、同じ正中の穴を通して針を挿入します。針の目を通して縫合の外側の尾を挿入し、袖口の壁を通して針を引いて、袖口の端の周りに縫合のループを作成する(図1C)。
      注:鉗子を使用し、縫合が袖口の長い軸に沿って向き、管に対して平らに横たわっていることを確認するために顕微鏡の下で働きます。このステップは、リードが袖口の内側に分離されたままであることを保証し、袖口の正中線に横に保持されます。
   3. 袖口の外側の側面に、縫合糸の端を半分の結び目で結ぶことによって袖口の反対側の端のまわりの第2のループを作成する。縫合糸は袖口の長い軸に沿って動き、管に対して平らに横たわっていることを確認する。結び目をしっかりと保持しながらチューブに対して平らに横たわるように、少量のUV硬化接着剤をハーフノットに塗布し、所定の位置に保持するために硬化します。
   4. 縫合糸の端をできるだけ結び目の近くに慎重に切ります。必要に応じて、少量の追加のUV硬化剤を使用して縫合糸の短い端を接着し、チューブに対して平らに置きます(図1D)。
5. Pt:Ir ワイヤリードへのはんだコネクタ ピン。
   1. ブタンライターを使用して、各Pt:Irワイヤーリード線の端にある〜3mmから断熱材を取り外します。各リードの断熱されていない端まで、金のピンのカップ側を( 材料表を参照)はんだ。
6. 組み立てられたデバイスのインピーダンスをテストします。
   1. 金ピンをLCRメーターまたは電極インピーダンスチェックモジュールの入力に接続し、テスト周波数を1kHzに設定します。カフチューブ(およびPt:Ir刺激は、サリンで満たされた小さなビーカーに内部に接触します)を浸し、金のリードピンとプローブコネクタを乾燥させておきます。組み立てられた袖口が2 kΩ未満の1kHzでインピーダンスを持っていることを確認してから、移植を進めてください。
      注:高インピーダンスは、多くの場合、絶縁の不十分な除去、カフ内部の接着剤の偶発的な適用、壊れたワイヤストランドなどの要因のために発生する可能性のある不適切なPt:Ir表面積が露出したことを示します。カフスはまた、長期的な使用との接触を短くする可能性があり、壊れたり、不十分に配置されたワイヤーストランドを検査する必要があります。

2. ヘッドキャップ構造

注: ヘッドキャップアセンブリ手順は、以前に公開されたものと同様です (Childsら^17)、便宜上ここに要約されています。

1. ヘッドキャップ¹⁷を組み立てる
   1. 30 AWGワイヤーラップの小片を2つ、長さ1〜13mm、長さ1〜10mmをカットします。両方のワイヤの両端から断熱材の〜1.5ミリメートルを取り除きます。金のピン側を各ワイヤーの一端にできるだけカップに近づけます。ワイヤーカッターを使用して、はんだジョイントを超えるピンの余分な長さを切り取ります。
   2. AWG ワイヤの他の端を 4 ピン マイクロストリップ コネクタの 2 つの中央のはんだカップにはんだ付けします。
   3. ワイヤヘッドキャップをコネクタに向かって上に曲げ、図 2A に示すように、コネクタに対して金ピンを平らに配置します( 図 2Aを参照)。短いワイヤに接続されたピンは、長いワイヤに接続されているピンの下に配置する必要があります。ヘッドキャップリードを固定するために、ネイルアクリル、歯科用セメント、UV硬化剤を使用してください。

3. デバイスの使用

1. 慢性迷走神経刺激のためのカフ電極を埋め込む。
   注:すべての外科的処置は、適切な麻酔下で無菌または無菌技術を使用して、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドラインに従い、地元のIACUCの承認を得て行われるべきである。次の手順は、デバイスの代表的な使用方法を示すものであり、包括的なものではありません。
   1. ラットを立体性フレームに入れ、頭頂部および後頭部骨の上に矢状切開を行い、ヘッドキャップ/コネクタの移植のための頭蓋骨表面を明らかにします。慎重に頭蓋骨に4穴を開け、宝石商のネジを配置します。頭蓋骨とネジにヘッドキャップを固定するために歯科アクリルを使用してください。
   2. 立体フレームからラットを取り出し、右側に置きます。首の左側の皮膚に垂直切開を行い、胸骨腫とステルノイドの筋肉の間とオモヨイド筋肉の下に位置する頸動脈から左迷走神経を慎重に解剖する。
   3. カフを頭蓋骨に向かって皮下に通う。ゴールドピンを使用してリードをヘッドキャップに接続します。
   4. カフの内側に迷走神経を置き、カフ縫合糸に二重結び目を結んでデバイスを固定します。鈍い、非導電性フックで神経を操作するか、または神経を取り囲む結合組織をつかむことで、移植中に神経を損傷しないように注意してください。
   5. 装置に刺激を加えることによってインプラントをテストする(0.8 mA、30 Hz、100 μsの二機的脈拍の10 s列車)。適切な移植は呼吸の停止と5%以上のSpO₂ の低下をもたらす。
   6. 金ピンと露出したリードを歯科アクリルで覆い、縫合糸で傷を閉じ、生理食酒、アルコール、ポビドンヨウ素溶液で切開部位をきれいにします。
   7. NIHガイドラインとIACUCの承認に沿って、交換液、鎮痛薬、術後ケアを提供します。
2. 目を覚ます行動の間に迷走神経を刺激する。
   注:動物としてのVNSの送達は、以前にタスク関連の筋肉のモーターマップ表現を拡大するために示されています。この検証済みのパラダイムを使用してデバイスの使用の代表的な例を提供しますが、他の多くの行動パラダイムや刺激パラメータは代替アプリケーションに関連している可能性があります。ラットは、デバイスの移植前にここで使用されるレバープレスタスクの習熟度を訓練しました。手術後、VNS送達前に再び良好な性能が検証された:ラットは1日2回の30分トレーニングセッションで少なくとも100回の成功試験を行った。VNSは、5日間にわたる10回のトレーニングセッションで正しいレバープレスとペアになった。
   1. 埋め込まれたヘッドキャップを介してラットを刺激発生器に接続し、適切な刺激設定に調整します。VNSによる運動皮質マップの再編成では、各正しいレバープレスを15個の二機体パルスの1本の列車とペアにし、それぞれ幅100μs、振幅800μAを30Hzの周波数で送ります。
   2. 刺激列車は10 30分のトレーニングセッションを通して成功したレバープレスの検出後すぐに配達される。VNS-配信中に、オシロスコープを使用して、電流刺激の正常な送達を監視します。
3. 慢性的に埋め込まれたカフ機能を検証します。
   1. 最後のVNSペアトレーニングセッションの24時間以内に、頭蓋内微小刺激(ICMS)を使用して、運動皮質^{19、20、21、2220,21,}の機能的な体性図を定量化する。¹⁹²²
   2. 運動皮質のICMSマッピングのための麻酔の誘導後、30Hz、0.8 mA電流刺激(100 μsの二相パルス)の10 s列車を適用してカフ機能を再び検証し、呼吸停止とSpO₂ レベルの低下を少なくとも5%の低下させ、ヘリング・ブロイアー反射と一致させる。
      注意:用途によっては、5%未満の信頼性の高い_SpO2 低下が観察された場合、またはより高い電流振幅(最大1.6mA)が確実に_SpO2で少なくとも5%の減少を生じる場合、カフ機能は許容可能と考えられる。呼吸の停止および/またはSpO₂ の信頼できる減少を観察する失敗は、インプラントの失敗を示す。

結果

迷走神経カフ電極およびヘッドキャップは、以前に公表された外科手術17、19、20、21、22に従ってラットに慢性的に移植された。^{17,19,20,21,22}移植の前に、1 kHzでのインピーダンスは、カフリードを横切って測定され、カフ管は生理食い物に沈んだ(インピーダンス= 1.2 ± 0.17 kΩ[平均±std];N = 9)。生理食前のインピーダンスが2kΩ未満のカフスのみが埋め込まれました。すべての袖口はこの基準を満たしました(0/9カフは除きます)。移植手術中に、すべてのカフスの機能的検証は、刺激による呼吸の短い停止とその後のヘリングブロイアー反射に起因する血中酸素飽和度の低下のテストによって行われた。この応答を呼び起こすために、10 sの30 Hz、0.8 mA電流刺激(100 μsの二分の二着パルス)...

ディスカッション

ここでは、げっ歯類で使用するための慢性的に埋め込まれた刺激カフ電極の組み立てのための簡単で低コストのアプローチを説明し、この新しい治療法の前臨床調査を促進する。この簡略化された方法は、特別な訓練や機器を必要としない、そしてほとんどの研究室で簡単にアクセスできるツールや物資の少数を使用し、他のアプローチ^{16、26、27、28,27}と比較して、デバイス製造の金銭的および人件費の両方を削減する。^16,,28縫合糸とPt:Irリードの適切な機械的安定性を確保しながら、UV硬化剤の過剰な適用を避けるために、組み立て全体にケアが必要です。過度の接着剤は、デバイスの移植を複雑にし、手術後の周囲の組織を刺激する可能性がありますが、不十分な接着剤は、時間の経過とともにリードが神経との良好な接触を維持しない可能性を高め、デバイスの性能または障害を低下させます。カフルーメン内の絶縁解除Pt:Irワイヤの一...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
生体適合性ポリウレタンベースのポリマーチューブ、0.080インチOD×0.040インチID	ブレインツリーサイエンティフィック	MRE080 36 FT
解剖顕微鏡	AMスコープ	#SM-6T-FRL
ファインセレーションハサミ、ストレート、22mm刃先	ファインサイエンスツール	#14058-09	Pt/Irワイヤーおよび縫合糸を切断するための
鉗子、#5デュモン鉗子、ストレート、11cm、0.1 x 0.06 mmtip	ファインサイエンスツール	#11626-11
鉗子、セラミック先端鉗子、0.3 mm x 30 mm tips	電子顕微鏡科学#	78127-71
ゴールドピン、PCBプレスフィットソケット	ミル-マックス	#1001-0-15-15-30-27-04-0	同様の小さなピン カフリードをヘッドキャップに接続するための
小さなピン イソブタン		#LCP21	Pt/Irワイヤー
の絶縁解除用ラッチ付きマイクロストリップコネクタ、4ピン	Omnetics	A24002-004 / PS1-04-SS-LT
ピペットチップ、10 uL	VWR	89079-464
イリジウム(90/10%)ワイヤー、0.001インチ(直径)x 9ストランド、PTFE絶縁	Sigmund Cohn	10IR9 / 49T
カミソリブレード、シングルエッジ、MicroRenathaneチューブ
ミシン針、長さ約4.0cm×直径0.7mm(サイズ6-7)	シン	ガー00276	Pt/Irワイヤーを通すための小さな針
ミシン針、長さ約4.5cm×直径0.8mm(サイズ2-3)	シン	ガー00276	組み立て中の袖口のピン留めと縫合糸の通し用の大きな針
小さなフォームボード	Juvo+/Amazon	B07C9637SJ	製造プラットフォーム用;私たちの寸法は約2.5 "x 3.5" x 1 "(L x W x H)
はんだ、多芯鉛フリー、直径0.38mm	ロックタイト/マルチコア	#796037
ステーション	Weller	WES51	または同様のはんだごてと長い円錐形のチップと互換性があります(この部分は中止されています)
はんだ付けチップ、長い円錐形、0.01 "/ 0.4 mm	Weller	1UNF8
縫合糸、非吸収性編組シルク、サイズ6/0	ファインサイエンスツール	#18020-60
UV(405 nm)スポットライト	ヘンケル/ロックタイト	#2182207
UVライト硬化接着剤 25 ml	ヘンケル/ロックタイト	AA 3106	または同様の生体適合性UV硬化接着剤
ワイヤーラッピングワイヤー、30 AWG	Digikey	K396-ND