このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

5.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

2020年6月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) タンパク質のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明します。

要約

キネトコレスとセントロメアの構造とダイナミクスを研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解する上で重要である。染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、正確な染色体分離に参加しているかは、根本的な問題である。CENP-Aは、中心性同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることが提案されており、細胞分裂間の二量体化によって継承されたCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビキテレンスが必要であり、細胞生存能に不可欠である。

ここでは、CENP-A K124R変異タンパク質におけるEYFPタギングのために異なるリジンでのユビキタス化が誘導されることを示唆する、EYFP-CENP-A K124R変異体のユビ分量を同定するための質量分析分析について述べている。EYFP-CENP-A K124Rにおけるリジン306(K306)のユビキタス化が同定され、これは、質量分析を通じてCENP-Aのリジン56(K56)に相当する。GFP/EYFPの使用、またはタンパク質の機能を分析するツールとしての高分子量タンパク質のタグ付けについて注意点が説明されています。現在の技術的限界は、ユビキタスバンドの検出、部位特異的なユビキタス性の同定、および細胞全体の周期の間に生きている細胞または特定の単一細胞におけるユビキタス化の視覚化についても議論されている。

ここで提示される質量分析法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。いくつかのアッセイ/分析からなるこれらの組み合わせ方法は、ユビキタスの機能的役割を特定することに興味を持っている研究者に推奨される可能性があります。

概要

ほとんどの真核生物では、スピンドル微小管は、セントロメアと呼ばれる各染色体の単一領域に付着する必要があります。キネトコレは、セントロメアに位置するタンパク質の複合体です。セントロメアとキネトコレタンパク質の動きのタイミングとキネトコレスとセントロメレスの構造を研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解するために重要です。重要な問題は、染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、それらが正確な染色体分離にどのように関与しているかである。ほとんどの種では、CENP-Aと呼ばれる特定のヒストン様タンパク質を含む特殊なヌクレオソームの存在がセントロメア同一性を定義する。そこで、CENP-Aが中心同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることを提案する。CENP-Aがヒトのセントロメア同一性をどのように定義するかを解明することが重要です。

ホリデイ接合認識タンパク質(HJURP)は、CENP-A特異的シャペロンであり、CENTP-Aを中心核組中11、2、32,3に沈着させる。我々は、リジン124(K124)およびセントロメレローカリゼーション4のCENP-A ubiquityationに、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼが必要であることを以前に報告している。また、我々の結果は、新たに合成されたCENP-Aのセントロメア募集には、既存のユビキタスCENP-A5が必要であることを示した。したがって、CENP-Aのユビキタス化は細胞分裂間の二量体化によって継承されることを示唆するモデルが提供された。

我々の調査結果及びYuらのそれとは対照的に、CENP-Aとその中心局在化に関する否定的な結果が最近発表された6.記事は、リジン124(K124)に対するCENP-A修飾は、K124Rの突然変異がCENP-Aの局在性に影響を及ぼさなかったことを示す否定的な結果に基づいて、ヒトセントロメレの確立、維持、および長期機能に欠かせないと主張した。しかし、彼らの結果と結論には議論の余地が十分にあり、我々はすでに彼らの前の出版物7にどのような問題があるかを説明しました。彼らは内因性CENP-Aのサイズよりもはるかに大きな分子量を持つCENP-Aとタンパク質を融合させることに注意を払う必要があります:例えば、彼らは〜30 kDa強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)を〜16 kDa CENP-Aに融合し、RPE-1 CENP-A-Fノックアウト中のEYFP-CENP-A K124R融合タンパク質を分析しました。K124ユビキチンは、構造予測4に基づいてHJURPに直接結合するとは考えられていないが、モノユビキチンの添加はCENP−Aのタンパク質の立体構造に影響を与えると予測される。CENP-Aの立体構造は、大きな融合タンパク質の存在によって変化する可能性があり、この立体構造変化は、ユビキサリ化の喪失によって引き起こされる構造変化を隠す可能性がある。我々は、大型タンパク質の融合が、EYFP-CENP-A K124R変異体におけるK124以外のリジンでのユビキスチン化を誘導し、別の部位におけるこのユビキタス化が、元のK124R単一変異型を阻害/マスクすることを示唆する。大きなタグタンパク質を有するCENP-A K124R変異タンパク質(EYFP)の異なるリジンにおいてユビキタンスが起こるという証拠は、我々の前の出版物8で報告された。EYFPタグはEYFP-CENP-A K124Rの別のリジン部位のユビキチン化を誘導し、EYFP-CENP-A K124R変異体がHJURPに結合することを発見した。その結果、別の部位でのこのユビキタス性は、元のK124R単突然変異表現型を阻害/マスクし、EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体の両方がセントロメア局在化を示した(pBabe-EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体をpBabe-EYFP対照と共に使用し、比較した)。この結果は、Flagタグ付きまたはタグなしCENP-A K124R変異体が致死的であるが、モノウビキチン融合によって救出できることを示し、CENP-Aのユビキタス化が細胞生存に不可欠であることを示唆した。

近年、多くの研究では、IN IN 9、10、11の両方で、CENP-Aタンパク質および他のセントロメアキネトコレタンパク質の翻訳後修飾(PTM)を同定するための異なるアッセイ,10を11開発している。9クロマチンの機能を調節する主要なメカニズムであるヒストンタンパク質のPTMに類似した、中心クロマチン成分のPTMはまた、全体的な構造と中心の機能を調節するために不可欠なメカニズムに関与しています。CENP-A PTM部位の大部分はCENP-A含有ヌクレオソームに特異的であるが、それらのいくつかはヒストンH3で保存されているが、これらの残基の修飾が中心基質特異的な機能に寄与することを示唆している。リン酸化、アセチル化、メチル化、およびユビ価化を含むCENP-AのPTMは、以前に報告された9であり、CENP-Aがそのアミノ末語およびC末語ヒストンフォールドドメイン上の様々なPTMおよびその組合せ配列を受けていることを示唆した。複数の機能におけるCENP-Aの変更の重要性は、我々を含む多くのグループによって明らかにされた。これらの機能は、セントロメアでのCENP-A沈着、タンパク質安定性、およびCCAN(構成中心性関連ネットワーク)9の募集を伴う。しかし、CENP-A PTMの限られた研究と所見は、直接的または間接的にその機能を調節する正規のヒストンの1つと比較される場合に前形化される。これらのCENP-A PTMを特定するための方法論に焦点を当てた技術報告書も制限されています。

CENP-Aの積み重ねには、細胞分裂5の間の二量体化によって継承され、細胞生存率8に不可欠なCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビメンテーションが必要であるため、CENP-Aのユビキタス性を同定する方法は、将来的には、中心の機能活性、位置、構造を研究するために不可欠である。そこで、ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質8中の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明する。他の制御アッセイおよび分析のプロトコル(免疫蛍光分析、コロニー成長アッセイ、インビボのユビキタスアッセイ)も提示され、主要な質量分析分析の結果を適切に議論する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトの細胞培養およびレトロウイルストランスフェクション

注:EYFP-CENP-Aは、内因性CENP-Aと同様のタンパク質レベルでpBabe-EYFP-CENP-Aから発現されます。総細胞性CENP-Aタンパク質は、RPE-1 CENP-A-----細胞6のようにCREリコンビナーゼによるCENP-A-/Fアレルの破壊後に、このEYFP-CENP-Aと置換される。

  1. 293T包装細胞を用いたレトロウイルスを含む上清の調製。
    1. 0日目:6ウェル培養プレート(1.0 x 106細胞/ウェル)に293T包装細胞を広げます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。細胞を37°Cで5%CO2の雰囲気で24時間2インキュベートします。
      注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。
    2. 1日目:広がった後23時間前後でトランスフェクション反応を調製する(24時間点はトランスフェクションの0hポイント)。各pBabe-EYFP(B3182)のトランスフェクト発現プラスミド、pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161)、およびpBabe-EYFP-CENP-A K124R(B3164)(表1参照)
    3. 表2に記載されているヘルパー/パッケージングプラスミドの組み合わせを1つ選択し、上記のプラスミドの1つを含むチューブに追加します。ヘルパー/パッケージングプラスミドのこれらの3つの組み合わせが主にあります(表2)。これらの実験で任意の組み合わせが働き、同様のトランスフェクション効率を示した。
    4. 50 μLの減らされた血清培地を調製し、各pBabe-EYFP(B3182)、pBabe-EYFP-CENP-A WT(B3161)、およびpBabe-EYFP-CENP-CenP-A K124R(B3164)を混合します(表1) Table 2この混合物を室温で5分間インキュベートする。この混合物は、溶液Aである。
    5. さらに50μLの減らされた血清培地を調製し、それぞれ1.5μLのトランスフェクション試薬IとIIを混合する(材料表)。この混合物を室温で5分間インキュベートする。この混合物は、溶液Bである。
      注:必要に応じて、トランスフェクション試薬III(ポリエチレンイミン[PEI];1.0 mg/mL)のみを溶液Bに添加するか、トランスフェクション試薬IおよびIIに加えてトランスフェクション試薬Iiiを6.0 μL添加する(材料表)。
    6. 溶液AとBを混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。
    7. 培養細胞をPBSで1回洗浄した後、溶液AとB(すなわち、DNA-脂質複合体)の混合物を、500μL減少した血清培地を有する6ウェル培養板の各ウェルに直接添加する。プラスミドの最終濃度は3.3μg/mLです。
    8. 4.5時間5%CO2の雰囲気で37°Cで細胞をイン2キュベートした後、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンで培地を高グルコースDMEMに変更します。培地交換後に培地を6ウェル培養板に2mL/ウェル入れる。
    9. トランスフェクション後48時間5%CO2の雰囲気で37°Cの細胞を培養した。レトロウイルスを含む上清を用いて3日目にレトロウイルス感染を行う。
  2. CENP-A-/FRPE-1標的細胞のレトロウイルス感染。
    1. 2日目:感染の前日、CENP-A-/FRPE-1標的細胞を広げて6ウェル培養ウェル(2.25 x 105細胞/ウェル)にトランスフェクトする。DMEMの培養細胞:F12培地(材料表)10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
      注:コロニー伸長アッセイ、免疫蛍光、およびウェスタンブロット分析のための細胞をコントロールとして広げます。最適な結果を得るには、シード処理に使用する細胞密度を経験的に決定します。
    2. 3日目(ウイルス感染日):293T包装細胞のトランスフェクション後48時間で、0.45 μmフィルターを介してウイルスとフィルターを含む上清を収集します(ウイルスエンベロープをせん断する0.2 μmフィルタを使用しないでください)。ポリエーテルサルホン(PES)フィルタを使用することをお勧めします。
    3. CENP-A-/F RPE-1細胞をウイルスに感染させる。6ウェル培養プレートの1ウェルに対して、新鮮な培地1mL、1mLウイルス上清、ポリブレンを8μg/mLの最終濃度に加えます。CENP-A-/F RPE-1細胞をトランスフェクション後7日目まで4日間5%CO22の雰囲気で37°Cでインキュベートします。
      注:CENP-A-/F RPE-1細胞増殖のインキュベーション期間は、最適な結果を得るための分析を次のようにして経験的に決定する必要があります。

2. pBabe-EYFP-CENP-Aを含む細胞の蛍光免疫分析

  1. 7日目:pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルス感染の4日後、吸引により培地を除去する。TBS(25 mMトリス-HCl、pH 7.5;125 mM NaCl)で細胞を一度リンスします。細胞の表面を乱さないように培養井戸の側面にTBSを適用します。
    注: 細胞固定の最適な時間ポイントは経験的に決定する必要があります。EYFP-CENP-A WTおよびK124Rの両方の免疫蛍光シグナルは、クレ感染がなくてもpBabe-EYFP-CENP-A構築物のレトロウイルス感染後少なくとも4日後のセントロメアで検出可能である(Cre感染を伴うデータについては図Figure 11C-E)。
  2. メタノール細胞固定及び免疫蛍光染色を行う13.
  3. 一次抗体は、抗GFP抗体(1:1,000希釈)および抗CENP-B抗体(希釈比1:200)を4%ヤギ血清を含むTBS中のセントロメア位置マーカーに使用します(抗体使用の表を参照)。
  4. ペーパータオルで余分な取り付け媒体を取り除き、最後のステップでマニキュアでカバースリップの端を密封します。
  5. 免疫蛍光画像観察、取得、定量、およびセントロメアでのEYFP-CENP-Aの残りのシグナルの分析については、前述の方法13を参照してください。
  6. ソフトウェア A またはソフトウェア B1 および B2 を使用した画像取得処理、デコンボリューション、定量化、および解析を行います (資料表を参照)。コンフォーカルレーザー走査顕微鏡には、オプションでソフトウェア C1-C3 (材料表を参照) を使用します。
    注: ソフトウェア A で使用されるすべてのコマンドについては、補足コード ファイルの 2.6.1 を参照してください。ソフトウェア B1 および B2 で使用されるすべてのコマンドについては、補足コーディングファイルの 2.6.2 を参照してください。

3. レトロクレウイルス感染後のpBabe-EYFP-CENP-Aを用いたコロニーの成長アッセイ

注:このアッセイを行う理由は、CREリコンビナーゼによるCENP-A-/F対立遺伝子の破壊後のEYFP-CENP-A WTとK124R変異体の細胞生存率を比較するためです(全細胞CENP-Aタンパク質の置換後)。

  1. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルストランスフェクション。
    1. セクション1に記載されているようにCENP-A-/F RPE-1細胞のレトロウイルストランスフェクションを行う。DMEMにおける培養細胞:F12培地は、ウイルス感染後72時間、10%FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを有する。
    2. pBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのレトロウイルス感染の3日後(6日目)、コロニー成長アッセイおよびコントロール実験に使用されるトランスフェクション細胞を含むウェルにブラストシジンS(10μg/mL)を添加する。細胞は、ブラストシジンS.の存在下でウイルス感染後少なくとも14日後に増殖し、5日ごとにブラストシジンSを含む培地を変化させる。
      注:コロニーアッセイの播種前に細胞が約80%の合流率に達した場合(3.2.7.および3.2.8)、トリプシン法と6ウェル培養プレートでのめっきにより、細胞を1:2および1:5比で通過させます。
    3. 7日目にウェスタンブロットの細胞を採取し、Cre感染のないpBabe-EYFP-CENP-Aコンストラクトのタンパク質発現を確認します。セクション 4 で説明されているように、ウェスタン ブロット分析を実行します。結果は図1B(レーン1-4)に示されている。
    4. クレウイルス感染によるコロニーの成長アッセイについては、ブラストシジンSの存在下でウイルス感染後14日間細胞を増殖させ続ける(すなわち、ここで提示された結果については17日目まで培地を含むブラストシジンSで細胞を増殖させる)。
  2. pBabe-po-Creのレトロクレウイルス感染
    注: ステップ 3.2.1 の 0 日目はセクション 3.1 の 13 日目に対応します。
    1. 0日目から3日目まで:pBabe-puro-Cre(B3027)を発現プラスミドとして使用してCENP-A-/F RPE-1細胞のレトロウイルストランスフェクションを行う(詳細はセクション1を参照)。ブラストシジンS(10μg/mL)を培地に添加してください。
    2. 4日目:細胞をトリプシン化してプレートから取り外す。プレート500または5,000細胞を6ウェル培養プレートに三重化する。DMEMにおける培養細胞:F12培地10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する。
    3. 5日目:ブラストシジンS(10μg/mL)を培地に添加します。5,000または500細胞のメッキの場合、ブラストシジンS(10 μg/ml)3-24日([3.2.7]の14日目まで)または3-28日([3.2.8]の18日目まで)を含む細胞を選択します。
      注:このコロニーの成長アッセイでは、pBabe-EYFP-CENP-Aのトランスフェクションと共にpBabe-puro-Creのトランスフェクションが追加されます。pBabe-EYFP-CENP-Aのトランスフェクションは3.1で行われます。pBabe-puro-Creのトランスフェクションは3.2.1で行われます。
    4. 10日目(レトロクレウイルス感染から7日目):10日目にレトロクレウイルス感染後の内因性CENP-Aのタンパク質枯渇および/またはpBabe-EYFP-CENP-A構築物のタンパク質発現を確認するために、ウェスタンブロッティング分析用の細胞を収集します。
    5. 同じ10日目のセクション4に記載されているように、ウェスタンブロッティングを行います。結果は図1B(レーン5-7)に示されている。
    6. 免疫蛍光分析(上記2項)を行い、残存する内因性CENP-Aアレルの不活性化から7日後にEYFP-CENP-A WTおよびK124Rの両方がセントロメアに局在することを確認した。結果は 図1C-1Eに示されています。
    7. 14日目:5,000個の細胞を播種したプレートでコロニーの成長アッセイを行う。メタノール中の10分間の細胞を固定し、結晶バイオレット溶液中で10分間染色する(2.3%結晶バイオレット、0.1%シュウ酸アンモニウム、20%エタノール(図2B参照)。OpenCFU ソフトウェアを使用してコロニーの数をカウントします (図 2Cを参照)。
    8. 18日目:500個の細胞を播種したプレートを使用します。ステップ 3.2.7 で説明されているようにセルを固定して染色します (図 2Bを参照)。コロニーの数をカウントします (図 2Cを参照)。

4. pBabe-EYFP-CENP-Aを用いたウェスタンブロット分析

注:図1Bおよび図2AおよびEYFP-CENP-Aタンパク質の材料表に示されている抗体を用いたウェスタンブロット分析については、前述の方法13を参照してください。

  1. 異なるウイルス感染で増殖した細胞を除去することによってタンパク質を分離する。次に、20 μgのタンパク質をSDS PAGEゲルの1ウェルに使用します。上記のとおりにPVDF膜にタンパク質を移す13.
  2. 一次二次抗体でインキュベーション後に膜3xを洗浄します。免疫ブロット検出用の赤外線画像システムおよび/または化学発光イメージャーを用いて、膜上のタンパク質バンドを検出して分析します。これらの結果は、図 1Bおよび図 2Aに示されています。
    1. 赤外線イメージングシステムでタンパク質バンドを検出して解析するには、「補足的なコーディングファイル」のステップ4.2.1を参照してください。
    2. 化学発光イメージャーを使用してタンパク質バンドを検出して分析し、補足的なコーディングファイルのステップ4.2.2を参照してください。このシステムでは、超高感度の高められた化学発光(ECL)基板(材料表)を使用します。
    3. 必要に応じて、ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、PVDF膜から事前インキュベートされた抗体を取り除き、ウェスタン分析の次のターンのために異なる抗体でリブロットします。使用する最適なインキュベーション時間と温度を経験的に決定します。

5. 細胞培養、トランスフェクション、および生体内での pQCXIP-EYFP-CENP-A を用いたインビボユビエキシトリションアッセイ

注:pQCXIP-ベクターから発現されるEYFP-CENP-Aのタンパク質レベルは、内因性CENP-Aタンパク質レベルよりも〜10倍高い。このベクターの使用は、EYFP-CENP-Aタンパク質の高い量の免疫沈降、EYFP-CENP-Aのユビキタスバンドの観察、および質量分析を通じたEYFPタグ付きCENP-A(EYFP-CENP-A)タンパク質のユビキタス性の同定を促進する。

  1. pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いたインビボのユビキタス化アッセイのトランスフェクション。
    1. シード 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 細胞を 10 cm の組織培養皿に入れます。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。
      注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも2つの皿を準備し、最低1mgの総タンパク質を得る。
    2. 5%CO2の雰囲気で37°Cで細胞を18時間2インキュベートします。
    3. 播種後17時間で、トランスフェクション試薬を調製する。
    4. 各pQCXIP-EYFP(B3252)、pQCXIP-EYFP-CENP-A WT(B3254)、pQCXIP-EYFP-CENP-A-A K124R(B3256)(表1)を335μLの減らされた血清培地の335 μLに混合することによって、溶液Aを作る、 室温で5分間インキュベートし、pCGN-HA-ユビキチン(B2806)の6.7 μgプラスミドを全てのサンプルに加えます。
      注 : すべてのベクトルは、表 1に示されています。
    5. トランスフェクション試薬IとIIをそれぞれ335μL減らした血清培地に混合し、室温で5分間インキュベートして溶液Bを作ります。
      注:オプションのステップは、40.2 μLトランスフェクション試薬III(ポリエチレンイミン[PEI];1.0 mg/mL)のみを溶液Bに添加するか、またはトランスフェクション試薬IおよびIIに加えて、40.2 μLトランスフェクション試薬IIIを加える(材料表) です。
    6. 溶液AとBを混ぜ合わせ、室温で15分間インキュベートします。
    7. 培養細胞をPBSで1回洗浄した後、3.35 mL μL減少した血清培地を有する個々の10cm組織培養皿のそれぞれに、溶液AとB(すなわちDNA-脂質複合体)の混合物を直接加える。
      注意:最終濃度はプラスミドの1.67 μg/mLです。
    8. 37°Cインキュベーターで細胞を4.5時間5%CO2でインキュベートします。4.5時間後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンで培地を高グルコースDMEMに変更します。
    9. トランスフェクション後48時間5%CO2で237°Cで細胞を培養した。細胞ライセート調製のための細胞を収集します。
  2. 抗GFP抗体と結合したプロテインAビーズの調製。
    1. 25 μL (50% v/v) のプロテイン A ビーズを使用して、免疫沈降(IP)の1つの反応を行います。バッファーA1(材料表)を使用して洗浄してEtOHを除去し、バッファーA1(20 mM Tris-HCl、pH 7.4;50 mM NaCl;0.5%ノニデットP-40;0.5%デオキシコール酸;0.5%SDS;1 mM EDTA;完全なEDTA阻害剤)で50%溶液を作る。
    2. 上で調製したビーズに抗GFP抗体(Anti#76:自家製抗体)を2.0 μL添加し、純ビーズ量と比較して10倍のバッファーA1を追加します。
    3. 4~18時間4°Cでエンドツーエンド回転を行います。エンドツーエンド回転の最適な時間長さは、免疫沈降の効率に基づいて経験的に決定されなければならない。
    4. 100 x gでビーズを 1 分間遠心し、バインドされていない上清を取り除きます。バッファ A1 を追加して、ビーズの 50% (v/v) 溶液を作り直します。IPの1つの反応のためにこの解決の25 μL(50%v/v)を使用して下さる。
  3. 抗GFP抗体と結合したプロテインAセファローズビーズを用いた免疫沈降(IP)
    1. ステップ5.1.9で得られた細胞を超音波処理および凍結融解処理によりバッファA1で行う。
    2. 異なるIPサンプル間でタンパク質濃度を測定し、タンパク質量を正規化します。各チューブからサンプルの5%を取り出し、SDS-PAGEで5%入力サンプルとして実行します。
      注:5%入力サンプルは、液体窒素で凍結し、1日以内にロードされていない場合は-80°Cでストックすることができます。
    3. 残りの95%のリセートを、ステップ5.2で調製した抗GFP抗体に結合したプロテインAビーズの25μL(50%v/v)と混合します。4~18時間4°Cでエンドツーエンド回転を行います。
      注: エンドツーエンド回転に最適な時間の長さは、経験的に決定する必要があります。
    4. 遠心分離タンパク質Aは、100xgで100xgのタンパク質に結合したタンパク質(すなわち、免疫g沈降物)を有するビーズを1分間、上清を除去する。100 x gで1分間遠心分離して緩衝A1で免疫沈降物を洗浄し、このステップ4xを行います。
    5. 5%入力と残りの95%の免疫沈降物を2xおよび4x SDS-PAGE負荷バッファー14とそれぞれ混合する。これらの2つのサンプルを5分間沸騰させ、異なるレーンで電気泳動のために10.0%変性SDSポリアクリルアミドゲルにロードします。電気泳動には大きなSDS-PAGEゲル(例えば、17cm x 15 cm)を使用してください。サンプルを小さなゲルで実行すると、明確/鋭いユビキタスバンドを観察できないことがあります。
    6. 前の報告8に示された抗体を用いて、セクション4で説明したようにウェスタンブロット分析を行う。結果は図 2Aに示されています。
    7. ウェスタンブロットストリッピングバッファーを使用して、PVDF膜から事前インキュベートされた抗体を取り除き、次のウェスタンブロット分析のために異なる抗体でレブロットします。

6. EYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス部位を同定するための質量分析

  1. pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いた質量分析のためのトランスフェクション
    1. 10 cmの組織培養皿にCENP-A-/F RPE-1細胞をシードします。細胞密度が1皿あたり36.2 x 105セルであることを確認してください。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを有する高グルコースDMEM中の培養細胞。1つの免疫沈降(IP)サンプルに対して少なくとも20個の皿を準備し、少なくとも10mgの総タンパク質を得る(5.3参照)。
      注: 最適な結果を得るには、シード処理に使用するセル密度を実証的に決定します。
    2. 37°Cの細胞を18時間5%CO2の雰囲気で2インキュベートし、広がった後にトランスフェクション試薬~23時間(24時間点はトランスフェクションの0hポイント)を準備します。
    3. 播種後17時間で、トランスフェクション試薬とトランスフェクト細胞を(4.1.3)として調製する。トランスフェクトされた細胞は、pCGN-HA-ユビキチン(B2806)およびpQCXIP-EYFP-CENP-A K124R(B3256)を有する。
    4. トランスフェクション後48時間5%CO2の雰囲気で37°Cの細胞をインキュベートします。細胞のライセートのための細胞を収集します。
    5. リーゼ細胞は緩衝A1内で、(5.2)および(5.3)として免疫沈降を行う。以下の2つの免疫沈降法を(6.1.6)および(6.1.7)として実行します。
      注: (6.1.6) では、サンプルを標準のトリスグリシンゲルで実行します。(6.1.7)で、市販のビストリスタンパク質ゲルでサンプルを実行します。「ディスカッション」も参照してください。
    6. EYFP-CENP-Aのユビキタンスを確認し、セクション5に記載されているようにユビキチン化EYFP-CENP-Aの位置を正確に決定するために、免疫沈降剤全体の10%に対して1つのサンプルを保持します。このサンプルを標準的なトリスグリシンゲルで実行します。SDS-PAGEおよびウェスタンブロットは(5.3)として行った。
    7. 質量分析のために、免疫沈降物質全体の90%を別のサンプルに保管してください。市販の4%-12%ビストリスタンパク質ゲルの2つのウェル内でこのサンプルを実行します。クマシーブルー溶液を使用してクマシーブルー染色を行います。50-70 kDaのゲル領域を切り出して切り出す(推定モノ-Ub-EYFP-CENP-A K124R領域)。質量分析分析にこのゲル領域を使用します。
  2. インゲル消化を用いた質量分析法解析
    1. 目的の各ゲルスライスを小さく(1mm2)にダイスし、0.5mLのタンパク質低結合チューブに入れる。
    2. 100 μL 50%(v/v)アセトニトリルを25 mM NH4HCO3で洗浄し、渦10~15分、スピンダウン、上清を捨て、3倍に繰り返します。
    3. ベンチトップ真空濃縮器を使用してサンプルを30分間濃縮し、ゲル片を乾燥させます。
    4. 10 ng/μLシーケンシンググレードのトリプシンを10 μL加え、ゲル片を5分間水分補給します。
    5. 25 mM NH4HCO3を追加するだけでゲル片をカバーし、一晩で37 °Cで消化します。
    6. 消化した上清をクリーンな0.65 mLシリコンチューブに移します。50%(v/v)アセトニトリル/5%(v/v)ギ酸(30 μLまたはカバーするのに十分)、渦10分、スピン、および同じ抽出管への転写を加えます。3x を繰り返します。
    7. ゲル片に10μLのアセトニトリルを加え、5分で渦を巻き、スピンダウンします。上清を同じチューブに移します。
    8. ベンチトップ真空濃縮器を使用してサンプルを2 μLに濃縮し、サンプルに8 μL 3%(v/v)アセトニトリル/2%(v/v)ギ酸、15分間の渦、30分間16,000 x gでスピンダウンします。
    9. 液体クロマトグラフィーシステム(表)と質量分析計装置(材料表)を使用して、LC-MS/MSでMSデータ取得を行います。
    10. 再構成したサンプルを8 μLの逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)カラムに注入します。
    11. 60分間に2~80%の溶媒Bの勾配でペプチドを分離し、勾配は40分間で2%から22%、12分間で22%から35%の溶媒Bに増加し、4分で80%の溶媒Bに上昇し、最後の40分間は一定の量で80%の溶媒Bで保持することを確認します。
      注:ソルベントAは0.1%のギ酸および2%アセトニトリルを含み、溶媒Bは0.1%のギ酸および98%のアセトニトリルを含んでいる。すべての濃度は体積/体積として表示されます。
    12. データ依存取得モードを使用して質量分析データを収集します。簡単に言えば、MSスペクトルを350~1500 m/zで250 msで収集し、さらに断片化を行う場合は、チャージ2~5の上位50個の強烈な前駆体を選択します。MS/MSスペクトルを100~2000 m/zで100 msで収集し、15秒の再選択から前駆体イオンを除外します。
    13. データベース検索の場合は、デスクトップ上の質量分析データを分析するために、商用ソフトウェア(「材料表」を参照)を開きます。
    14. 新しい検索を行う場合は、上部メニューの[LC]ボタンをクリックします。次に、[追加] ボタンをクリックして、元の MS 生データ ファイルをアップロードします。
    15. データベース検索方法として「パラゴン法」の「ヒトタンパク質ID」を選択します。元の MS 生データ ファイルを UniProt Homo Sapiens データベース (160,566 のシーケンスを含む)から検索http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640。
    16. 次のように検索パラメータを設定:消化酵素としてトリプシンを選択し、最大3つの欠損切断、4つの修飾および2〜5の電荷をペプチドあたり可能にする。最初の検索では最大 20 ppm の質量誤差を設定し、断片化したイオンの場合は 0.02 Da に設定します。タンパク質、ペプチド、および修飾部位の偽発見率(FDR)閾値を1%未満で指定します。ソフトウェアの他のすべてのパラメータをデフォルト値に設定します(質量分析解析の場合は図3を参照)。
    17. 上部メニューの右側にある [名前を付けて保存]ボタンをクリックし、検索結果を保存するフォルダを選択し、検索名を入力して [保存] ボタンをクリックします。
    18. 上部メニューの右側にある [処理] ボタンをクリックして、検索を開始します。検索が終了すると、入力した検索名を持つデータが、選択したフォルダに自動的に保存されます。データはソフトウェアFによって容易に開くことができる。
    19. 特定のペプチドの MS/MS スペクトルを取得するには、検索結果をダブルクリックしてソフトウェア F で開きます。まず、メニュー上部のタンパク質リストでタンパク質をクリックし、メニューの中央にあるペプチドをクリックします。このペプチドのMS/MSはメニューの下部に表示されます。
    20. MS/MS スペクトルをエクスポートして保存するには、メニューの下部にある MS/MS スペクトルを右クリックし、[コピー] を選択して、PPT 形式や doc. 形式などの適切なファイルに貼り付けます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

EYFP-CENP-A K124変異体は、ユビエキタリミン、HJURPとの相互作用、およびセントロメア局在化の欠陥を示さない細胞致死性を示す。ここでファキネッティらによって報告されたシステム(2017)66は再構成された:1つの破壊を運ぶ二倍化ヒト(RPE-1)細胞と1つの'floxed'CENP-Aアレル(CENP-A-/F)、EYFP-CENP-AはpBabe-EYFPウイルスベクターから発現した。CENP-A-/F CENP-Aこのシステムでは、CENP-A-/Fアレルからの内因性CENP-Aの発現は、クレリコンビナーゼ6によって破壊される可能性がある。内因性CENP-Aの喪失を救うEYFP-CENP-A WTまたはK124R変異体(図1A)の遺伝子構築物は、レトロウイルス集積が行われたときに安定的に発現した。CENP-A-/Fア...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質8の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタンスを同定するための質量分析分析の方法を説明した。結果として、質量分析によりCENP-Aのリジン56(K56)に対応するEYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)のユビキタンスを同定しました。ここで説明する質量分析法は、以前にCENP-A WT-Flag12のリジン124(K124)のユビキタスサイトを同定した模擬法である。12したがって、この方法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。LC-MS/MSに基づく質量分析は、広い範囲のタンパク質の潜在的な翻訳後修飾(PTM)を同定するために一般に受け入れられています。いくつかのアッセイ/分析(すなわち、インビボのユビキタス化アッセイ、コロニー成長アッセイ、質量分析)からなる組み合わせ方法は、標的タンパク質のユビキタス化の機能的役割を特定...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは競合する利益を宣言しない。

謝辞

南京大学モデル動物研究センターのChao-Jun Liに質量分析に感謝します。ヤンミニ・ダラル、深川達夫、そして南京大学・グリーヒー小児がん研究所のモデル動物研究センターの研究者の皆さんに、有益な議論、実験指導、試薬をありがとうございました。ドン・W・クリーブランド,ダニエレ・ファキネッティ,ヤンミニ・ダラル,ミン・ブイ,グスタボ・W・レオーネ,ジョン・トンプソン,ローレンス・S・キルシュナー,アムルタ・アシュテカール,ベン・E・ブラック,グレニス・A・ログドン,田先健二,ドーン・S・チャンドラーに試薬の寛大な贈り物に感謝します。Y.N. 江蘇省「二重一流」建設基金、江蘇省自然科学基金(SBK2019021248)、江蘇省第16回シックス・ビッグ・タレント・ピークス・ファンド(TD-SWYY-001)、江蘇省「外国人専門家百人財プログラム」基金(SBK2019010048)、国立自然科学財団(3666年)この研究の一部は、NCI助成金R21 CA205659によってサポートされました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equpiments/Tools
0.5 ml タンパク質低結合チューブEppendorf022431064質量分析用
10cm細胞培養皿BIOFIL/JET, China70022410 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)
6 well Cell Culture ClusterFisher/Corning Incorporated07-200-836-well cultureプレート
CentriVapLABCONCO-質量分析用真空乾燥ペプチド用卓上真空濃縮器
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μmEksigent Technologies805-00120質量分析用液体クロマトグラフィー(RPLC)カラム
HCX PL APO 100x 油浸レンズライカ LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X 油浸レンズ
HCX PL APO 63x 油浸レンズライカLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X 油浸レンズ
Immobilon-FL PVDF トランスファーメンブレンEMD ミリポアIPVH00010ウェスタンブロット用
ライカ DM IRE2 電動蛍光顕微鏡ライカ電動蛍光顕微鏡
ライカ EL6000 コンパクト光源ライカ蛍光励起用外部光源
マイクロカバーガラス (22 mm x 22 mm)Surgipath105カバーガラス (22 mm x 22 mm)
モデル V16-2 ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010ゲル電気泳動装置 I より大きなSDS-PAGEゲル
を適用する nanoLC.2DEksigent Technologies-質量分析用液体クロマトグラフィーシステム
NuPAGE 4%-12% Bis-Trisタンパク質ゲルサーモフィッシャーNP0335BOX質量分析
用の市販の4%-12% Bis-Trisタンパク質ゲルオリンパス FLUOVIEW FV3000 共焦点レーザー走査型顕微鏡オリンパス-共焦点レーザー走査型顕微鏡 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ ダウンロード/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 デジタルCCDカメラ浜松C10600-10BCCDカメラ
PAP ペン結合部位AD100.1免疫蛍光染色組織における撥水バリア用
培養皿 10CMVWR25382-16610 cm 組織培養皿
ゲルランニング用垂直電気泳動 (ビッグサイズ)中国 駿義JY-SCZ6+ゲル電気泳動装置 II より大きな SDS-PAGE ゲル (洋平研究室、PE23)
VWR マイクロスライド、つや消しVWR インターナショナル48312-013マイクロスライド
Primary antibodies
抗CENP-A抗体Stressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006マウスモノクローナル抗体
抗CENP-B抗体Novus BiologicalsH00001059-B01Pマウスモノクローナル抗体
抗GAPDHABCAMab37168ウサギポリクローナル抗体
抗GAPDHInvitrogenPA1987ウサギポリクローナル抗体
抗GFP抗体ANTI #76 (自家製抗体)ウサギポリクローナル抗体
抗HA (3F10)Roche11815016001ラットモノクローナル抗体
抗HJURPProteintech Group15283–1-APウサギポリクローナル抗体
抗ユビキチンベチル研究所A300-317A-1ウサギポリクローナル抗体
試薬
Bio-Rad タンパク質アッセイバイオ・ラッド500-0006タンパク質濃度の測定用市販タンパク質アッセイ試薬 I (0.1% SDSと互換性あり)
Branson SONIFIER 450ソニケーター
ブランソン 超音波ソニケーター マイクロチップ ステップ、ソリッド、ねじ式 9.5 mmVWR サイエンティフィック プロダクツ33995-325超音波処理用ディスラプターホー
ソン超音波超音波発生器マイクロチップテーパー6.5 mmVWRサイエンティフィックプロダクツ株式会社33996-185超音波処理用マイクロチップ
バッファー A1--20 mM Tris-HCl、pH 7.4、50 mM NaCl、0.5% ノニデット P-40、0.5% デオキシコール酸、0.5% SDS、1 mM EDTA、完全 EDTA-free プロテアーゼ阻害剤試薬 完全 EDTA-free プロテアーゼ阻害剤
EDTA-free プロテアーゼ阻害剤 カクテルRoche11-873-580-001バッファー A1
クマシー ブリリアント ブルー R-250BBI ライフサイエンス用CAS 6104-59-2質量分析用クーマシーブルー溶液
クリスタルバイオレット溶液 (2.3% クリスタルバイオレット、0.1% オキシ酸アンモニウム、20% エタノール)SigmaI-AldrichHT90132-1Lコロニー染色用
DAPISIGMA-SLDRICHD9542核染色用
DMEM: F12 中型ATCC30-2006DMEM: F12 中
型ウシ胎児血清、認証済み、熱不活化、米国原産Life Technologies/Gibco10082FBS(ウシ胎児血清)
高グルコースDMEM(Dulbecco'修正されたイーグル」LifeTechnologies/BioWhittaker12-604High-glucose DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000Transfection reagent I for chemical transfection
Lipofectamin 3000, P3000 solutionLife Technologies/InvitrogenL3000Transfection reagent II for chemical transfection
MethanolFisherA412-4Fixationreagant
無脂肪粉乳(カーネーション粉ミルクの代替品として承認Fisher ScientificNC9255871(再注文番号190915;Lot# 90629)脱脂脱脂乳
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985還元血清培地
p-フェニレンジアミンSIGMA-SLDRICHP6001
ペニシリン、ストレプトマイシンの封入用;LiquidFisher/Gibco15-140Penicillin-streptomycin
Poly-L-Lysine SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, 水中
ポリエチレンイミン [PEI]; 1.0 mg/mlPolysciences23966–2化学トランスフェクション用トランスフェクション試薬 III
プロテインAセファロースCL-4BビーズGE Healthcare/Amersham17-0963-03プロテインAセファロースCL-4Bビーズ、pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いたin vivoユビキチン化アッセイ用
ウェスタンブロットストリッピングバッファーの復元Thermo ScientificPI21059ウェスタンブロットストリッピングバッファーI
ケンシンググレードトリプシンPromegaV5111質量分析用
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo34095超高感度化学発光(ECL)基質
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977滅菌組織培養グレード水
ウェスタンブロットストリッピングバッファー II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-メルカプトエタノール)--Western Blot Stripping Buffer II
Secondary Antibodies
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies/InvitrogenA11008fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody)
Softwares
Acquisition FV31S-SW softwareOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analysis FV31S-DT softwareOlympus-ソフトウェアC2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ ダウンロード/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension software Ver. 1. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ ソフトウェア/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0LI-COR Biosciences-SoftwareD
Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-イムノブロット検出用化学発光イメージャー
Odyssey CLx 赤外線イメージングシステムLI-COR Biosciences-イムノブロット検出用赤外線イメージングシステム
OpenCFU saftware--コロニーカウント用 (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab version 5.5.2.サイエンティフィックイメージングソフトウェアImprovision/PerkinElmer-Software
A ProteinPilotソフトウェアバージョン4.5AB SCIEX-ソフトウェアF 質量分析分析用
Quantity One 1-D解析ソフトウェアBio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-Massspectrometry instrument
Volocityバージョン6.3 3D画像解析ソフトウェア(Volocity Acquisition)PerkinElmer-ソフトウェアB1
Volocityバージョン6.3 3D画像解析ソフトウェア(Volocity Quantification)PerkinElmer-ソフトウェアB2
ウサギポリクローナル抗体 ンブラン試薬 完全) シー

参考文献

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

ユビキチン化の同定免疫沈降プロトコルLC-MS/MS解析ゲル切り出し法トリプシン消化プロテインAビーズ抗GFP抗体セントロメア同一性
EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。