方法論記事

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

DOI：

10.3791/61140

⸱

2020年6月7日

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞機能には、タンパク質およびタンパク質複合体の正しい折り畳みと組み立てが不可欠です。細胞は、損傷したタンパク質を正し、隔離し、または排除する品質管理経路を採用して、健康なプロテオームを維持し、細胞プロテオスタシスを確保し、さらなるタンパク質損傷を防ぎます。プロテオスタシスネットワーク内の冗長な機能のため、多細胞生物 カエノルハブディティス・エレガン スにおけるノックダウンまたはシャペロンコード遺伝子の変異を用いて検出可能な表現型のスクリーニングは、ほとんどの場合、マイナーまたは全く表現型の検出をもたらす。特定の機能に必要なシャペロンを同定し、表現型と機能のギャップを埋める目的でスクリーニング戦略を策定しました。具体的には、RNAi合成相互作用スクリーンを用いた新規シャペロン相互作用、ノックダウンシャペロン発現、一度に1つのシャペロン発現、シャペロンコード遺伝子の変異を運ぶ動物、または目的のシャペロンを過剰発現する動物を監視する。個々にグロス表現型を呈しない2つのシャペロンを破壊することによって、我々は両方が摂動したときに特定の表現型を悪化させるか、または暴露するシャペロンを同定することができる。我々は、このアプローチが、特定の表現型に関連するタンパク質またはタンパク質複合体の折り畳みを調節するために一緒に機能するシャペロンの特定のセットを同定できることを実証する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞は、損傷したタンパク質1,2を修復、隔離、除去する品質管理機械を採用することで、タンパク質の損傷に対処する。タンパク質複合体の折りたたみおよび組立は、分子シャペロンによって支持され、損傷したタンパク質3、4、5、6、7を修復または隔離することができる高度に保存されたタンパク質の多様なグループである。損傷したタンパク質の除去は、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)8またはオートファジー機械9によってシャペロン10、11、12との協調で媒介される。タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、従って、折りたたみおよび分解機3,13

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RNAi用線虫増殖培地プレートの製造

  1. 1 Lボトルに、NaClの3g、バクトペプトンの2.5g、寒天17g、蒸留水1Lとオートクレーブを加えます。
  2. 55°Cに冷却ボトル。
  3. 25 mLの1 M KH2PO4、pH6.0、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、コレステロール溶液1 mL(表1)を加え、線虫増殖培地(NGM)を作る。
  4. 1 mL のアンピシリン (100 mg/mL) と 0.5 mL の 1 M IPTG (表 1) を加えて NGM-RNAi 溶液を作ります。
    注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 は、dsRNAコードプラスミドを発現するために使用されるIPTG誘導性T7 DNAポリメラーゼを含んでいます。これらのプラスミドはまた、アンピシリン耐性をコードする。
  5. ボトルを渦巻いて温かい溶液を混ぜます。
  6. ボンネット内または滅菌手順を使用して、NGM溶液をプレートに注ぐか、蠕動ポンプを使用して、溶液をプレートに分配します。この画面には、6ウェル、12ウェル、40 mmまたは60mmプレートを使用してください。寒天は、プレートの深さの約2/3を埋める必要があります。
  7. プ....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UNC-45の温度感受性変異を使用して、許容的または制限的な条件下での相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニング
筋肉のアセンブリとメンテナンスは、組織特異的なシャペロン相互作用を研究する効果的なシステムを提供します。収縮性筋肉の機能的単位であるサルコメアは、構造タンパク質と調節タンパク質の結晶状の配置を示す。運動タンパク質ミオシンの安定性と収縮性筋サルコメアの厚いフィラメントへの組み込みは、シャペロンおよびUPS成分30の協力に依存する。そのようなシャペロンの一つの例は、主に体壁筋肉31、32、33、34、35で発現される保存および専門化ミオシンシャペロンUNC-45である。UNC-45の変異は、Cにお.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロテオスタシスネットワークの統合画像は、それがどのように組織化され、異なるメタゾアン細胞および組織で機能するかを反映しています。この欠点に対処するためには、開発や老化の過程で、分子シャペロンなどのこのネットワークの様々な構成要素の相互作用に関する具体的な情報が必要です。ここでは、組織特異的摂動を使用して、特定の組織におけるシャペロンネットワークを調べることがどのように可能であるかを示した。組織特異的シャペロン遺伝的相互作用を探求するために、3つの異なるアプローチが検討された。第1のアプローチでは、筋肉細胞において高発現されるシャペロンであるUNC-45を、摂食RNAi25を介してシャペロン相互作用をスクリーニングするために使用した。特殊なシャペロンの使用は、識別組織特異性を可能にするが、それはそれが貢献するその非常に焦点を当てたサブネットワーク上でのみ報告することができます。ほとんどのC.エレガンスニューロンは、摂食ベースのRNAi送達50に耐性であり、したがって、ニューロン細胞における遺伝的相互作用を同定するためにこのア.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、線虫株の一部のために、NIH国立研究資源センター(NCRR)が資金を提供するカエネルハブディティス遺伝学センターに感謝します。H.F. エプスタインによって開発されたモノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物学部によって維持された開発研究ハイブリドーマ銀行から得られました。本研究は、イスラエル科学財団(278/18)、イスラエル科学技術省、外務省、イタリア共和国国振興総局(助成金第3-14337)からの助成金によって支援されました。この原稿の作成に協力を寄せられるよう、Ben-Zvi研究室のメンバーに感謝します。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12ウェルプレートSPLBA3D16B
40 mm プレートGreiner Bio-one627160
60 mm プレートGreiner Bio-one628102
6 ウェルプレートThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
アンピシリンフォーミディアム69-52-3
ブロモフェノール ブルーシグマBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
カメラQimagingq30548
コレステロールAmresco0433-250G
共焦点ライカDM5500
フィルター(0.22 µm)シグマSCGPUO2RE
蛍光体顕微鏡ライカMZ165FC
グリセロールフルタロム2355519000024
IPTGフォーミディアム367-93-1
KClメルク104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4sub>Fisher22189-08-8森本研究室からの贈り物
ミオシン MHC A (MYO-3) 抗体ハイブリドーマ バンク5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
プレート注湯ポンプIntegradoes it p920
RNAi シャペロン ライブラリNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-メルカプトエタノールワールド41300000-1
実体顕微鏡カMZ6
トラサイクリンデュチェファバイオケミー64-75-5
スバイオラボ
Tween-20ッシャーBP337-500
バイオライテトリ002009239100 フィ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

RNAi HSP6

関連記事