高濃度単一分子顕微鏡のためのゼロモード導波ガイドの作製

サマリー

ここでは、フルオロフォアのナノからミクロモル濃度で単分子イメージングのための金属張りのガラス顕微鏡カバースリップにおけるナノパーチャーの配列であるゼロモードの導波管の平行作製のためのナノスフィアリソグラフィー法を説明する。この方法は、コロイド結晶自己集合を利用して導波管テンプレートを作成します。

要約

単一分子蛍光エンミノロジーでは、溶液中の標識基質からのバックグラウンド蛍光は、多くの生理学的リガンド濃度よりも数桁少ない数桁のピコからナノモルの範囲に蛍光を制限することが多い。アルミニウムや金などの薄い導電金属で作られた直径100~200nmの直径開口であるゼロモード導波管(ZMWs)と呼ばれる光学ナノ構造は、可視光励起をゼプトリットル有効体積に限定することで、蛍光色素のマイクロモル濃度で個々の分子をイメージングすることができます。しかし、高価で特殊なナノファブリケーション装置の必要性は、ZMWsの広範な使用を妨げている。典型的には、ZMWsのようなナノ構造は、逐次的かつ遅い電子ビームリソグラフィを用いて直接書くことによって得られる。ここで、コロイド、またはナノスフィアは、導波路製作のためのナノメートルスケールマスクを作成する代替戦略として用いられる。このレポートでは、各フェーズの実際的な考慮事項と共に、アプローチについて詳しく説明します。この方法により、数千のアルミニウムまたはゴールドのZMWを並列に作成でき、最終的な導波管の直径と深さは100〜200nmです。金属蒸着用の一般的なラボ機器と熱蒸発器のみが必要です。生化学的コミュニティにZMWsをよりアクセスしやすくすることで、この方法は細胞の濃度と速度での分子プロセスの研究を容易にすることができます。

概要

単一分子蛍光共鳴エネルギー伝達(smFRET)や単分子蛍光相関分光(FCS)などの単一分子技術は、分子生物物理学のための強力なツールであり、転写^1、2、3、翻訳^4、6などのプロセスにおける個々の生体分子の動的動き、立体構造、相互作用の研究を可能にする^7。smFRETの場合、多くのテザード分子が経つ場合があり、TIRによって発生するエバネッセント波はカバースリップ⁸に隣接する100-200 nm領域に制限されるため、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は一般的な方法である。しかし、励起体積に関するこの制限があっても、背景蛍光⁹を超える単一分子シグナルを検出するためには、関心のある蛍光体をpMまたはnM範囲に希釈する必要がある。細胞酵素のミカエル-メンテン定数は、典型的にはμMからmM範囲¹⁰であるため、単一分子研究における生化学的反応は、通常、細胞内の反応よりもはるかに遅い。例えば、タンパク質合成は大腸菌^11,12において1秒当たり15~20アミノ酸で起こり^、smFRET実験における原核生物リボソームの大部分^は、毎秒0.1~1アミノ酸で翻訳される。タンパク質合成において、失速リボソーム上の結晶構造およびsmFRETは、tRNA-mRNA転座ステップ^14,15の前に「ハイブリッド」状態と「古典的」状態の間でRNA(tRNA)の転移が変動することを示した。しかし、転座GTPase因子の生理的濃度が、EF−G、存在した場合、異なる立体構造、ハイブリッド状態と古典状態との中間体が、smFRET6で観察された。細胞内と同様の速度と濃度で動的分子プロセスを研究することは重要ですが、技術的な課題は残っています。

蛍光基質濃度を高める戦略は、ゼロモード導波ガイド(ZMWs)と呼ばれる金属ベースのサブ可視波長開口を用いて、開口¹⁶内に局在する生体分子を選択的に励起する限定励起場を生成することである(図1)。開口部は通常、直径 100~200 nm、深さ¹⁷で 100~150 nm です。ウェルの大きさと形状に関連するカットオフ波長(λ_c≈、水を有する円形導管の直径の2.3倍の誘電媒体^18)、導波路では伝播モードが認められません。しかし、振動電磁場は、エバネッセント波と呼ば、指数関数的に強度が減衰し、依然として導波管^18,19に短い距離をトンネルする。TIRエバネッセント波と同様に、ZMWエバネッセント波は減衰定数が短く、導波路内で10〜30nm有効な励起領域を生じます。蛍光標識リガンドのマイクロモル濃度では、励起領域内に同時に存在する分子は1個または数個に過ぎない。この励起体積の制限とそれに伴うバックグラウンド蛍光の減少により、生物学的に関連する濃度で単一分子の蛍光イメージングが可能になります。これは、多くのシステム²⁰に適用されているが、単一タンパク質拡散²¹のFCS測定、低親和性リガンドタンパク質²²およびタンパク質タンパク質相互作用²³の単一分子FRET測定、および単一分子ターンオーバーイベント²⁴の分光電気化学的測定を含む。

ZMWsは、イオンビームミリング^{25、26または}電子ビームリソグラフィ(EBL)を用いて金属層を直接パターン化し、続いてプラズマエッチング^16、27を生成した。これらのマスクレスリソグラフィ法は、一連の導波ガイドを作成し、通常、ZMW技術の普及を防ぐために、特殊なナノファブリケーション施設へのアクセスを必要とします。もう一つの方法は、紫外線ナノインプリントリソグラフィーリフトオフ^28、切手のようなレジストフィルムに逆ZMWテンプレートを押し込むために石英スライド型を使用する。この方法はより合理化されていますが、石英金型の製造にはEBLが必要です。本稿では、EBLやイオンビームミリングを必要とせず、リソグラフィマスクを形成するためにナノスフィアの密閉に基づく、シンプルで安価なテンプレート化された製造方法のプロトコルを紹介します。

1982年にDeckmanとDunsmuir^29,30によって最初に提案されたナノスフィアまたは「天然」リソグラフィーは、数十ナノメートルから数十マイクロメートル³¹までの単分散コロイド粒子の自己集合体を使用して、エッチングおよび/または材料の堆積を介した表面パターニングのテンプレートを作成します。2次元(2D)または3次元(3D)コロイド粒子の拡張周期配列は、コロイド結晶と呼ばれ、散乱および回折³²からの明るい虹彩を特徴とする。電子ビームやフォトリソグラフィよりも広く使用されていないが、このマスキング方法論は、シンプルで低コストで、100nm以下の特徴サイズを作成するために簡単に縮小されます。

コロイド粒子の自己集合性を導き、表面パターニング用のマスクとしてコロイド結晶を使用することの成功を決定します。粒子の大きさと形状が均質であれば、コロイド粒子は、六角形のパッキングで容易に自己組み立てすることができ、エントロピー枯渇³³によって駆動される。滴下後の水蒸発はコロイド粒子を沈降させる有効な経路であるが、他の方法としては、ディップコート^34、スピンコート^35、電気泳動堆積^36、空気水界面³⁷での定着が挙げられる。以下に示すプロトコルは、最も簡単に実装された蒸発堆積物法に基づいています。密梱されたポリスチレンビーズ間の三角形の間間に、犠牲金属をプレートする開口部を形成し、ポストを形成する(図2 および 補足図1)。このステップの前にビーズの短いアニーリングは、これらのポストの形状と直径を調整します。ビーズが除去され、最終的な金属層がポストの周りに堆積し、ポストが削除されます。コロイドナノマスクへの2つの金属蒸着ステップ、中間ポストの除去、およびパッシベーションおよびテザリングのための表面化学修飾の後、ZMWアレイは単一分子イメージングに使用する準備ができています。製造後のZMW光学特性のより広範な特性は、添付の記事³⁸で見つけることができます。金属の蒸着のための熱蒸発器のほかに、特別な用具は要求されない。

プロトコル

注: すべての手順は、一般的なラボスペースで完了できます。

1. ガラスカバースリップクリーニング

1. コロイド粒子の蒸発堆積のためのきれいな表面を提供するために、24 x 30 mmの光学ホウケイ酸ガラスカバーリップ(0.16-0.19 mm厚さ)を、コプリンガラス染色瓶の溝付きインサート内に配置して洗浄します。
   注: クリーニングプロセス中にすべての表面がはっきりと露出するように、カバーリップが直立し、十分に分離されていることを確認してください。
2. 染色瓶に十分なアセトンを注ぎ、カバーを覆い、カバーを置き、40°Cで10分間超音波処理します。
3. アセトンを注ぎ、染色した瓶に蒸留したH₂Oを充填し、水を注いでカバーリップをすすいだ。さらに2回繰り返します。
4. アセトン超音波処理(ステップ1.2と1.3)をもう一度繰り返します。
5. 40°Cで20分間カバーリップと超音波処理をカバーするのに十分な200 mM KOHを瓶に注ぎます。
   注:KOHはガラスを少しエッチングします。
6. 蒸留したH₂Oを6回でカバーリップをすすいでください。
7. カバーリップを覆うエタノールを加え、蓋を加え、40°Cで10分間超音波処理します。
8. 蒸留したH₂Oを3回でカバーリップをすすいでください。
9. 穏やかな鉗子を使用して端の各カバースリップを拾い、N₂ ガスでカバースリップを乾燥させる。カバースリップの端だけをタッチします。乾燥した洗浄されたカバーリップをそれぞれ、個々のきれいなペトリ皿に入れます。

2. ポリスチレンビーズの蒸発蒸着

1. ZMWアレイ用のコロイド結晶マスクを作成するために、直径1μmの遠心分離機50μL、非機能化ポリスチレンビーズ(水中2.5%w/v)を15,000xg、25°Cで5分間作成した。
   注:ビーズをピペットする前に、ビーズがボトルの底に落ち着いた場合に備えて、ストック液を短時間渦に入れる必要があります。
2. 上清を捨て、残りの水はできるだけ少なくします。
   注:残留水はエタノール再懸濁^液39の蒸発特性を変化させることができるので、すべての水を除去するために少量のビーズを除去することは許容される。
3. ステップ2.2からビーズを50 μLの1:400 TritonX-100:エタノール溶媒で再懸濁します。ピペットを数回上下にして、ビーズと溶媒を完全に混合します。
   注:TritonX-100:エタノール溶媒は、使用後パラフィンフィルムで密封し、月に一度新鮮に調製する必要があります。ビーズは、マイクロ遠心チューブなどのプラスチック容器の側面に付着する傾向があるため、側面に沿ってピペットがすべてのビーズを再懸濁するようにします。
4. 堆積のための湿度室を設置するには、蓋がわずかにアジャールを残したラインのベンチに、それぞれ1つのカバースリップを備えた6ペトリ皿を置きます。各皿で、次のステップで湿度が上がったときにカバーリップが環境にさらされるように、カバースリップを開いた領域に移動させます。
5. ペトリ皿の後ろに湿度計と小さな扇風機を置きます。
6. 開始相対湿度 (RH) をラボに記録します。200 mL ビーカーに約75°Cの水150~200 mLを充填し、ファンの後ろに置きます。
7. ファンの電源を入れ、ペトリ皿、ファン、ビーカー、湿度計を覆い、透明なプラスチック製の収納容器(66cm x 46 cm x 38 cm)で覆います。
8. チャンバー内のRHを70-75%に上昇させ、通常は5-10分かかります。
   注:アンビエントラボRHが低い(〜50%未満)場合は、チャンバーが高いRHに到達しますが、堆積中の湿度の損失を補うために80%以下にします(下記参照)。
9. RHが70-75%に達したら、RHを記録し、プラスチック製の貯蔵容器をわずかに持ち上げて、カバーをペトリ皿に素早く置き、カバースリップの過度の濡れを防ぎます。
   注: チャンバー内の温度は、加湿の結果として室温(通常は25-26 °C)よりもわずかに暖かくなります。カバーリップに水分が見える場合は、ガラス表面が濡れ過ぎる。商用グローブボックスは、プロトコルのこの部分を簡素化する可能性があります。
10. チャンバー内のRHは85%まで上昇し続けます。その時点で、湿度チャンバにRHを記録し、各カバースリップの中央にビーズサスペンションのピペット5μLを記録します。
11. 湿度の損失を最小限に抑えるために、各堆積物の後にチャンバーとペトリ皿を閉じます。2分以内に6つの堆積物をすべて仕上げるようにしてください。
12. 堆積後のチャンバーにRHを記録します。
    注: 堆積後の RH は、周囲の実験室の条件に依存する堆積中にどのくらいの速さで湿度が失われたかを測定するのに役立ちます。典型的な成功した走行のために、チャンバは堆積の前に85%RHで始まり、堆積後70-75%RHで終わる。
13. ビーズの液滴を広げて5分間乾燥させます。
    注:コロイド結晶が多くの穴や多層領域を持っている場合、チャンバーはそれぞれ湿度が高すぎたか乾燥している可能性があります。ペトリ皿を閉じる相対湿度を調整し、堆積を開始します(最適化の詳細については、結果セクションを参照)。

3. コロイド結晶テンプレートで毛穴のサイズを小さくするためのビーズアニーリング

1. ビーズ間のインタースティックスを狭め、インタースティックスのコーナーを丸めるポリスチレンビーズのアニーリングのための均一な温度表面を提供するために、標準的なセラミックホットプレートの上に平らな、粉砕されたアルミニウム板を置きます。
2. ホットプレートの温度を107°Cに設定し、ポリスチレン⁴⁰のガラス転移温度に設定する。
   注: 安定した正確な温度を得るために、熱電対プローブは幅2~3mm、アルミニウム板の深さ4~5mmの穴に保持されています。
3. ホットアルミプレートにビーズテンプレートを含むカバースリップを20sのアニールに置きます(融解時間の説明については、説明セクションを参照)。
4. 加熱後、カバースリップをアルミニウム板から取り出し、速やかに別の室温アルミニウム表面に置いて冷却します。
   注:カバーリップのピックアップを容易にするために、カバーリップがプレートの端に少し掛かっているか、またはプレートに浅いチャネル(付属のビデオを参照)を持っている方が便利です。

4. コロイド結晶テンプレートを用いたアルミニウムゼロモードの導波管のナノファブリケーション

1. 熱または電子ビーム蒸発堆積を使用して、300nmの銅をコロイド結晶テンプレート上に2Å/sに堆積させ、ビーズ間補間にポストを生成します。
2. テープで表面を軽く押して、ビーズの上に余分な金属を取り除きます。テープをゆっくりと剥がして金属を引き離します。
   注:テーププル後に反射過剰な金属の小さなパッチが残ることがあり、これらはしばしばN₂ ガスの流れによって除去することができます。テーププル後に反射過剰金属の相当なパッチが残っている場合は、ポリスチレンビーズを部分的に溶解させるために2時間トルエンにテンプレートを浸してみてください。カバーリップを蒸留水で洗い_、N2で乾かしてからテープを引き抜きます。追加の浸漬は、ビーズがテーププル中の損傷からポストを保護するのに役立つため、ビーズを完全に溶解しないでください。
3. ポリスチレンビーズを溶解するには、ビーズテンプレートをトルエンに入れ、一晩浸します。
   注意:トルエン煙は有毒である可能性があります。換気の良いフードの下でトルエンを使用し、手袋、安全メガネ、ラボコートなどの個人用保護具を着用してください。トルエンは、可燃性液体用に指定された換気キャビネットに保管する必要があります。
4. トルエンインキュベーション後、テンプレートをクロロホルムで1回、エタノールで2回リンスします。繊細な200-300 nmの高さの金属の柱が露出しているので、この時点で慎重にカバーリップを扱います。テンプレートを_N2 で乾燥させ、酸素プラズマクリーナーの残留ポリマーと汚染物質を30分間除去します。
   注意:クロロホルムの煙は有毒である可能性があります。換気の良いフードの下でクロロホルムを使用し、手袋、安全メガネ、ラボコートなどの個人用保護具を着用してください。クロロホルムは、他の可燃性溶剤から離れた換気キャビネットに保管する必要があります。
5. 熱または電子ビーム蒸着を使用して、チタン付着層の3nmを1Å/sに堆積させ、その後、銅ポストの周りと上に4Å/ sで100-150 nmのアルミニウムを堆積させます。
   注:より厚いクラッディングを使用して、より深いガイドを取得し、バックグラウンド蛍光をより良く減衰させることができますが、これはまた、次のステップで投稿を公開して溶解した後の収量を減少させます(説明セクションを参照)。
6. 金属ポストを溶解するには、カバーリップを銅エッチャント(クエン酸ベース)に浸します。 資料一覧)2時間。
   注意:金属エッチャントは皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。換気の良いフードの下でエッチャントを使用し、保護具を着用してください。取扱い後は手を十分に洗ってください。金属エッチャントは、腐食性液体用に指定された換気されたキャビネットに保管する必要があります。
7. カバーリップを蒸留水でリンスし、N₂で乾燥させ、レンズペーパーで金属クラッディングの表面を軽くバフして、クラッディングで覆われているポストを露出させます。カバースリップを別の2時間銅エッチャントに戻し、蒸留水で再びすすいでN₂で乾燥させます。
   注:ZMWのスライドは、汚染物質を含まないそれらを保つために、覆われた、きれいなペトリ皿に保存する必要があります。

5. コロイド結晶テンプレートを用いた金ゼロモードの導波管のナノファブリケーション

注: アルミニウム ZMWs を製造するためのプロトコルを反映したゴールド ZMW (補足図 1)を製造する方法は、このセクションで提供されています。

1. 熱または電子ビーム蒸発堆積を使用して、チタン付着層の3nmを1Å/sに堆積させ、その後4Å/sで300nmのアルミニウムを堆積させます。
2. テープで表面を軽く押して、ビーズの上に余分な金属を取り除きます。テープをゆっくりと剥がして金属を引き離します。
3. ポリスチレンビーズを溶解するには、ビーズテンプレートをトルエンに入れ、一晩浸します。
4. トルエンインキュベーション後、テンプレートをクロロホルムで1回、エタノールで2回リンスします。テンプレートを_N2 で乾燥させ、酸素プラズマクリーナーの残留ポリマー汚染物質を30分間除去します。
5. 熱ビームまたは電子ビーム蒸発堆積を使用して、アルミニウムポストの周りおよび上に5 Å /sで金の100-150 nmを堆積させます。
6. 金属ポストを溶解するには、カバーリップをアルミニウムエッチャント(リン酸ベース)に浸します。 資料一覧)1時間。
7. カバーリップを蒸留水でリンスし、N₂で乾燥させ、レンズペーパーで金属クラッディングの表面を軽くバフして、クラッディングで覆われているポストを露出させます。カバースリップをアルミニウムエチャントに1時間戻し、蒸留水で再びすすいでN₂で乾燥させます。
   注:ZMWのスライドは、覆われた、きれいなペトリ皿に格納する必要があります。

結果

蒸発沈着によるポリスチレンコロイド粒子の自己集合性(ステップ2.1−2.13)は、溶媒蒸発速度の制御を必要とするため、さまざまな結果を生み出すことができます。ただし、堆積は速いため(ラウンドあたり10〜15分)、手順は異なる環境実験室の条件に対して迅速に最適化することができます。 図3A は、蒸着および蒸発後の整形コロイドテンプレートを示す。マクロ的には、ビーズの領域は円形で、ボーダーは透明で多層のビーズのリングで定義されています。半透明では、画像内の白色の領域は望ましい単層領域です。 図3B は、過度に湿度の高い環境(ペトリ皿が閉じられた時の80%RH)に詰め込まれたコロイドテンプレートを示しています。これらのテンプレートは、円形の境界がクリーンではなく、多層テンドルが外側に伸びる傾向があります。堆積は許容可能であり、その後の段階で使用することができますが、ラティスの穴は単一分子イメージングに使用できるZMWアレイ領域の数を減らします。 図3C は、過度に乾...

ディスカッション

コロイド自己集合(プロトコルセクション2)では、懸濁溶媒として水ではなくエタノールを使用すると、以前の方法^48,49のように、テンプレートが1−2時間ではなく、堆積後2〜3分で準備ができるように、蒸発プロセスを高速化する。ここで提示される蒸発沈積分プロトコルは、サスペンション^49、50、51以上の表面傾斜、温度、および空気量を制御する必要がある以前の堆積物プロトコルよりも簡単である。このプロトコルで使用される粒子体積分率は2.4%であり、以前の沈降法⁴⁸で使用されていた0.2-0.5%よりも高く、水グリセロール混合物中のコロイドを再懸濁して、はるかに長いセトリングタイムスケールを行う。しかし、堆積物の品質は粒子体積分率の変化に強く、過去の研究では2-10%49、50、51の間で変化させるこ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>1.ガラスカバースリップクリーニング
アセトン	シグマ	32201	1 L
Coplinガラス染色ジャー	ッシャーサイエンティフィック	08-8178	と成形ガラスカバー付き染色ジャー
		48404-467	24 mm x 30 mm(No.1½、長方形)
エタノール	シグマ	E7023	1 L
KOH	シグマ	30603	水酸化カリウム
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	R80115TS	直径100 mm、深さ15 mm
ソニケーター	ブランソン	Z245143	卓上超音波洗浄機、5510
2。ポリスチレンビーズの蒸発堆積
Clear貯蔵容器	フィッシャーサイエンティフィック	50-110-8222	26 x 18 x 15インチ
デスクファン	O2Cool	FD05001A	どんな小さなデスク(~5インチ)でも使える
ガラスビーカー フィ	ッシャー・サイエンティフィック	02-555-25B	250mL
湿度計	フィッシャー・サイエンティフィック	11-661-19
マイクロ遠心チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	21-402-903	1.5 mL
ポリスチレン・マイクロスフィア	ポリサイエンス	18602-15	1.00 以上m径、非機能
化Triton X-100 deturgent	Sigma	X100	100 mL
3.コロイド結晶の細孔サイズを小さくするためのビーズアニーリング テンプレート
アルミニウムプレート	フィッシャーサイエンティフィック	AA11062RY	14 cm x 14 cm
ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	HP88857100	13 x 8.2 x 3.8インチ
温度調節器	McMaster-Carr	38615K71	熱電対プローブで温度を読み取り
ます 熱電対プローブ	McMaster-Carr	9251T93	Type K、表面プローブ
4/5。コロイド結晶テンプレート
	トランセン	A型
アルミペレット	Kurt J. Lesker	EVMAL40QXHB	電子ビーム蒸着用
クロロホルム	シグマ	288306	1L
銅エッチング液	トランセン	49-1
銅ペレット	Kurt J. Lesker	EVMCU40QXQA	電子ビーム蒸着用
金ペレット	Kurt J. Lesker	EVMAUXX40G	電子ビーム蒸着用
レンズペーパー	Thorlabs	MC-5
プラズマクリーナー	Harrick プラズマ	PDC-32G
スコッチテープ	ステープル	ズ MMM119
薄膜蒸着装置	Kurt J. Lesker	PVD-75	卓上熱蒸発システムは、
チタンペレット	Kurt J. Lesker	EVMTI45QXQA	電子ビーム蒸発用
トルエン	シグマ	244511	1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software	COMSOL, Inc.
デュアルビュースペクトルスプリッター	Photometrics, Inc.