マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

骨折修復は、胚性骨格の発達やリモデリングとは異なる動的な多細胞プロセスです。この過程で、損傷した組織からの傷害シグナルの誘導は、骨格幹細胞/前駆細胞の迅速な導入、増殖、およびその後の分化が続き、骨折の全体的な安定性および固定化に重要である¹。特に、骨折治癒の初期段階では軟質カルス形成が必要であり、これは主にペリオスチールの居住細胞²に起因する。骨が負傷すると、骨膜細胞のサブセットが急速に反応し、^carus3内の新たに分化した軟骨中間体および骨芽細胞に寄与し、骨膜内に明確な骨格幹細胞/前駆細胞集団の存在を含む。したがって、骨膜内に存在する骨格幹細胞(SSC)の同定および機能的特徴付けは、変性骨疾患および骨欠損に対する有望な治療アプローチを構成する^。

SSCは、骨髄を含む複数の組織の位置に存在すると考えられている。骨髄と同様に、骨形成/軟骨性SSCも骨膜^4,5,6で同定されている。 これらの骨膜SSC(P-SSC)は胎児の骨の発達の間に初期間葉系の系統マーカー(すなわち、Prx1-Cre5、Ctsk-Cre7、およびAxin2-CreER8)で標識することができる4,7,8,9,10。これらの単一の遺伝的系統追跡モデルの重要な制限は、標識された細胞集団内に実質的な不均一性があることである。さらに、ラベル付きSSCと生体内の子孫を区別することはできません。この制限に対処するため、我々は最近、骨髄SSC(BM-SSC)¹¹からP-SSCを明確に可視化するためにデュアルレポーターマウス(Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺)を開発しました。このモデルでは、P-SSCはMx1⁺αSMA⁺デュアルラベリングでマークされ、より分化されたMx1⁺細胞は骨髄、内層および骨層の表面、および皮質および骨柱骨^11,12に存在すると判断されました。

複数のサイトカインおよび成長因子は骨のリフォームおよび修復を調節することが知られており、重要なセグメント欠陥における骨格修復の増強について試験された^1,13。しかし、骨室の物理的障壁の破壊によって生じる傷害モデルの細胞複雑さのために、これらの分子が治癒中の内因性P-SSCの移動および活性化に及ぼす直接的な影響は不明である。SSCの機能的特性および回遊性の動態は、多くの場合、他の細胞集団における移行を誘導することが知られているサイトカインまたは成長因子と組み合わせて、トランスウェルまたはスクラッチアッセイを行うことによってインビトロで評価される。従って、これらのインビトロ実験の結果を、対応するin vivoシステムでの応用に対する解釈は困難である。現在、骨格幹細胞/前駆細胞の移動のインビボ評価は、通常、リアルタイムでは観察されません。むしろ、それは骨折後の固定された時点で測定される^{5、7、14、15、16}。

この方法の制限は、移行が単一セル レベルで評価されないことです。むしろ、細胞集団の変化によって測定される。最近では、生きた動物の生体内顕微鏡検査や追加レポーターマウスの生成が進んでいるため、生体内での個々の細胞の追跡が可能になりました。生きた動物の生体内顕微鏡を用いて、Mx1/Tomato/αSMA-GFPマウスの24~48時間の損傷後のカルバリア縫合糸ニッチから骨損傷へのP-SSCの明確な移行を観察した。

CCL5/CCR5は最近、早期傷害反応の間にP-SSCの採用および活性化に影響を与える規制メカニズムとして同定された。興味深いことに、傷害に対する実質的なP-SSC移行の検出はリアルタイムでなかった。しかし、CCL5による損傷の治療は、リアルタイムでキャプチャできるP-SSCの堅牢で方向性的に異なる移行を生み出します。したがって、このプロトコルの目的は、CCL5での処理後にリアルタイムでP-SSCのin vivo移行を記録するための詳細な方法論を提供することにある。

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. マウスの準備

1. クロスMx1-Cre17とRosa26-loxPストップロックスP-tdTomato(トム)¹⁸マウス(ジャクソン研究所から購入)は、αSMA-GFPマウス(イヴォ・カラジッチ博士とヘンリー・クローネンバーグ博士が提供)を使用してMx1-Cre⁺Rosa26トマト⁺α SMA-GFP+(Mx1/トマト/αFP⁺)を生成します。
2. Mx1-Cre誘導の場合、1日おきに25mg/kg pIpCを10日間注射します。
3. 野生型C57BL/6マウス(WT-BMT)¹⁹から1 x ¹⁰⁶全骨髄単核細胞の静脈移植の1日前に9.5Gyでマウスを照射する。
4. 6〜8週間の回復の後、被験者マウスは、以下に説明するペリオスチール細胞移行プロトコルのin vivoイメージングに。
   注: Mx1-Creマウスの照射およびWT-BMTは、傷害に反応する可能性のある内因的に Mx1標識造血細胞を排除するために必要です。照射後6~8週間、宿主の造血細胞数は<5%であり、したがってイメージング¹⁹の準備ができている。

2. マウスの拘束とイメージングマウント

1. 50 mL の円錐チューブでマウスの拘束を作成します(図 1A)。
   1. 尖ったはさみを使用して、円錐形の底に穴を突きます。底部の穴から円錐形の上端にカットします(カット側が拘束の上部になります)。
   2. 前のカットと平行に約4〜5cmの長さのカットを行い、拘束の上部から半分下(〜2cm)します。円錐形のこのセクションを削除し、エッジを滑らかにする必要がありました。
2. 調整可能な角度プレート、0.5インチの光ポスト、0.5インチポストの直角クランプ、0.1875インチ16進数(図1B および 材料表)を使用して、円錐形のチューブイメージングマウントを構築します。
   1. 角度プレートを35°の角度に調整します。角度プレートの左側で、光学ポストをプレートの背面から2番目の穴にねじ込みます。
   2. 調整可能なプレートの右側に、バネ付きの 0.1875 インチ六角ロック 0.25 インチのつまみねじをプレートの前面と最後の穴から 2 番目の穴に挿入します。直角クランプは、コニカルマウスの拘束を所定の位置に固定するために、光学ポストと一緒に使用されます。

3. 術前手術の手術

1. マウス麻酔
   1. 疼痛管理のために、手術前に持続的放出ブプレノルフィン(1mg/kg BW)30~60分でマウスを皮下注射します。
   2. 37.5 mg/mLケタミン、1.9 mg/mLキシラジン、および0.37mg/mLアセプロマジンを含むげっ歯類III CCM併用(コンボIII)麻酔を使用してマウスを麻酔する。マウスの適切な投与量は体重1kgあたり0.75〜1.50 mLである。投与量は30〜45分続く。
   3. マウスを麻酔したら、眼の脱水を防ぐために、無菌綿棒で眼に眼軟膏を適用します。
   4. 長期イメージング(>45分)の場合、麻酔を再び投与し、適切な麻酔深さを次のように維持する。
      1. 1 mL シリンジを十分な量のコンボ III で準備して、計画されたイメージング期間(追加のセデレーションの 30 分あたり 0.75 mL/kg BW)の麻酔を維持します。12インチのチューブセットを備えた25Gバタフライニードル注入を注射器に取り付け、チューブと針を通して麻酔薬を押します。
      2. 腹腔内に蝶の針を挿入し、針を所定の位置にテープで貼ります。
         注:これは、画像処理中に追加のコンボIIIを管理する方法であり、動物を動かしたり、視界を乱したりする必要はありません。
   5. 手順全体を通して37°Cに保たれた加熱パッドで熱サポートを提供します。長時間のイメージング(>1時間)のために、追加の流体サポートが必要になります。 補足液は、イメージング中に追加のコンボIIIをI.P.または33 mL /kg生理食物(0.9 NaCl)皮下に提供することができます。
2. 手術部位のマウス拘束と準備
   1. 頭の上からできるだけ多くの髪を除去するためにバリカンを使用してください。剃毛部位に脱毛クリームを塗布し、外科部位の残りの毛を取り除きます。
   2. つま先のピンチに対する応答が不足している場合に、マウスが完全に麻酔状態になっていることを確認します。15分後、マウスが完全に麻酔されていない場合は、コンボIII(<0.75 mL/kg BW)の第2の小さな用量を投与する。
   3. 拘束尾から最初にマウスを置き、鼻が円錐形の端にわずかに掛かるようなほど後方にスライドさせます。
   4. 医療テープを使用して、前足を円錐管の底にテープで貼ります。
   5. 35°の角度に設定され、直角クランプを使用して固定されたイメージングマウントにマウスを使用した円錐チューブを配置します(図1C)。
   6. マウスがイメージングマウントで固定されたら、ベタジンスクラブと70%イソプロピルアルコールの交互スクラブで手術部位3xをきれいにします。繰り返しますが、動物が完全に鎮静されていることを確認してください。
   7. マウスをきれいな吸収パッドに移動し、マウスの上にドレープを置いて、大きな無菌フィールドを作成します。

4. 外科的処置

1. 開口切開
   1. 細かい先端の鉗子を使用して、すぐに右耳に内側に皮膚を拾う。マイクロディシスはさみで、鉗子に保持されている皮膚を切断します。
      注: 上記の方法を使用して切開を起用すると、手順後の縫合に適した丸い切開が作成されます。
   2. 左耳(<1cm)に向かって最初の切開から始まる横断切開を行います。 最初の切開から始めて、動物の鼻に向かって別の切開を行います(右目を通り過ぎるのは〜2〜3mm)。
   3. 鉗子とはさみを使用して皮膚を骨膜から分離し、皮膚とカルバリア骨膜を分離する結合組織を穏やかに切断する。
   4. 滅菌綿棒を使用して、皮膚のフラップの上部にいくつかの眼科軟膏を適用します。 皮膚のフラップをそっと拾い、左目の上に折りたたみます。矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点ははっきりと露呈する必要があります(図1E)。
      注:眼科軟膏は、皮膚のフラップを所定の位置に保つために使用されます。
   5. 無菌PBSで開いた表面を洗い流して、血液や残留毛の領域をきれいにします。
      注:必要に応じて、細かいチップの鉗子を使用して、フラッシュ後に残っているヘアを除去しますが、骨膜を損傷しないように注意してください。
2. 微小骨折
   1. カルヴァリアに微小骨折を発生させるには、29Gインシュリンシリンジのプランジャーを取り外し、300〜400uLマークの周りにシリンジのバックエンドを切断します。
      注: このステップは、損傷を生成する際に解剖スコープの下で操縦することが容易になります。
   2. 傾斜角の先端(1~2針幅)を、冠状縫合糸から鼻の方に、矢状縫合糸の右側に1~2本の針幅を置きます(図1E)。
   3. シリンジを時計回りに軽く回転させ、反時計回りに数回回転させます。
      注:若いマウスでは、円形の微小骨折を作成するために非常に少量の下降圧力が必要です。これは出血を引き起こし、イメージングを妨げるので、針が脳に浸透しないように注意してください。
   4. 27G針を使用して微小骨折を~0.4mmに広げます。骨片が微小骨折に残っている場合は、PBSで領域をフラッシュします。骨片が依然として微小骨折に残っている場合は、29Gの針を使用して穏やかにそれらをすくい取ります。
   5. ステップ 4.2.1 ~ 4.2.4 を繰り返して、矢状縫合の左側に損傷を起こす。
      注: この時点で、2 つのオプションがあります: 1) すぐに CCL5 処理 (セクション 4.3) とイメージング (セクション 5) に進みます。または2)セクション6の術後処置に従って外科部位を閉じる。24時間後、再びマウスを麻酔し、手術視力を再開し、CCL5(セクション4.3)で傷害を治療し、生体内イメージング(セクション5)および術後ケア(セクション6)を行う。
3. CCL5治療
   1. RANTES(100 ng/mL)の在庫から、基膜マトリックス(材料表)を使用して10 ng /mLの溶液を作ります。この溶液を氷の上に置いて、マトリックスを液体の形に保ちます。
   2. 2~20 μLのピペットを使用して、各損傷を2~20 μL(10 ng/μL)で処理します(このピペットチップは、粘性液体を使用する場合にはより効果的です)。マトリックスを固めます。
   3. マトリックスが固まったら、カルバリアを皮膚フラップで静かに覆い、組織が脱水にならないようにします。イメージングの前に1時間インキュベートする。

5. 生体内イメージング

1. 顕微鏡の設定
   1. マルチフォトンレーザー(フェムト秒チタンサファイアレーザー)をオンにします。波長を880 nmに設定し、骨の第2高調波発生(SHG)イメージング(440 nm)の電力を調整します。
   2. GFPおよびtdTomato発現細胞の励起用に、488 nmおよび561 nmの固体レーザーをオンにします。
   3. 第2ハーモニック発生(405~455 nm検出)およびGFP(505~550 nm検出)信号用のPMT(光増倍管)検出器をオンにします。トマト(590-620 nm検出)信号のHyD 3検出器をオンにします。
2. マウンティング
   1. マウスをスコープに移動する前に、マウスの頭部の後ろを軽く押してカルバリアのビジュアルプレーンを確認します。平面がレベルでない場合は、マウスの拘束を左または右に軽く回転させることで、位置を調整します。
      注: これは、十分な画質を確保するための重要な手順です。
   2. 滅菌2%メチルセルロースを水中(w/v)に塗布して、カルバリアと皮膚のフラップ全体を覆い、組織の乾燥を防ぎます。
   3. XYZ軸の電動顕微鏡ステージにマウスを置きます(図1G)。蛍光光を用いて、マウスを1)顕微鏡に向くように、2)角縫合糸と矢状縫合糸の交点がステージの中心参照点になるように位置合わせする。
   4. ガラスカバーを撮像領域に置き、位置合わせを再確認します(図1H)。
3. タイムラプスイメージング
   1. 低倍率レンズ(NA = 0.95の25倍の水浸し目的)を使用してカルバリアをスキャンします。矢状および冠状縫合線の交差の参照画像を取得します。
   2. 細胞からのSHGおよび蛍光信号を使用して、各傷害視力を見つけ、XYZ座標と矢状および冠状縫合糸からの距離を記録します(図2B)。
   3. 長期的なイメージングのために、コロナまたは矢状縫合線の位置を選択します。イメージング中の参照から、この領域の詳細なZスタック画像を撮ります。
      注:縫合線は既知のP-SSCニッチを表すので、カルバリアの損傷に応答して細胞が移行する場所です。
   4. タイムラプスソフトウェアの設定を使用して、1分ごとに1時間ごとに画像を記録します。スナップショット間の時間で、現在の視野と初期視野を比較します。これらの値が異なる場合は、Z スタック イメージを使用して、視野を調整する必要がある方向を決定します。

6. 術後動物のケア

1. イメージング後、露出したカルバリアを無菌PBSでリンスし、メチルセルロースを除去する。
2. 切開を閉じるには、皮膚フラップをカルバリアの上にそっと置きます。無菌綿棒を使用して、残りの眼軟膏を除去し、切開部位を乾燥させます。
3. モノフィラメントナイロン5-0サイズの非吸収性縫合糸をC-1逆切断針付きで使用し、外科部位を閉じる。滅菌綿棒を使用して、閉切開にトリプル抗生物質軟膏を塗布します。
   注:瘢痕化は高品質の縫合技術および最低出血と減少する。
4. 暖かい表面にきれいなケージにマウスを置き、胸部の不全が達成されるまで15分ごとにチェックします。
5. 第2回投与後のブプレノルフィン72時間を投与する。
6. 縫合糸が取り除かれるまで、寄り添う挙動、フリルファー、および/または外見の欠如を毎日監視します(〜1週間)。

骨格前駆物質は、回遊性または循環器の可能性を有することが提案されている20。最近、Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+(Mx1/Tomato/αSMA-GFP)レポーターマウスが生成され、P-SSCはMx1+α SMA+デュアルラベリング(図2A、B)でマークされています。Mx1+α SMA+ P-SSCの実質的な移行は、24〜48時間の負傷後11時間以内に縫合間間葉から発生した。 また、カルバリア欠損後24時間にリアルタイムでインビボP-SSC移行を検出する可能性も試験した。イメージングの1時間以内にMx1+αSMA+ P-SSCの移行はほとんど観察されなかった(図2C)。

Mx1+α SMA+ P-SSCは、CCR511として知られるCCL5受容体を独自に発現します。従って、CCL5によるカルバリア欠損24時間後損傷の治療は、冠状縫合から離れ、傷害視力に向かって方向的に異なる移動を誘発した(図2D、E)。イメージングの1時間以内に、 Mx1+αSMA+ P-SSCの1つが損傷に向かって約50μm移動しました(図2E)。他の Mx1+αSMA+ P-SSCもCCL5治療に応答して移行することが観察されたが、より少ない程度に。

図1:マウスカルバリアのインビボイメージングのセットアップ マウス拘束(A)およびイメージングマウント(B)の代表的な画像を、ライブイメージング中に使用した。(C)マウスを拘束し、撮像台に固定する。(D)マウスカルバリア構造の模式的表現、前頭(FS)、コロナル(CS)、矢状(SS)、およびラムドイド(LS)縫合糸を同定する。(E) カルバリア微小骨折傷害の代表配置。(F) 最適な治癒と将来のイメージングのための術後の外科的縫合の配置。顕微鏡ステージ(G)およびカバースリップ配置(H)におけるマウント配置の代表的な画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:Mx1+αSMA+P-SSC移行 のリアルタイムインビボイメージング。(A) Mx1/トマト/αSMA-GFPデュアルレポーターマウス製剤の概略図。 マウスは1日おきに25mg/kg pIpCを10日間注射した(1)。Mx1/トマト/αSMA-GFPマウスは、WT C57BL/6マウスから1 x 106個の骨髄単核細胞を静脈内移植する1日前に9.5Gy(2)を無死死敏に照射した(3)。 6~8週間の回復の後(宿主の造血細胞が5%未満の場合)、マウスは骨損傷実験を行った。Mx1+(トマト+)、αSMA+(GFP+)、Mx1+α SMA+(トマト+GFP+)、骨(青)。(B) Mx1/トマト/αSMA-GFPマウスのサジタル(SS)およびコロナ(CS)縫合糸に関連する代表的なカルバリア損傷(白い円)および画像(白い正方形)の位置の最大Z投影。 点線はカルヴァリア縫合糸を表します。(C) Mx1+α SMA+ P-SSCのインビボイメージングは、損傷後24時間応答する。スケールバー= 25 μm(D)24時間後損傷、CCL5を傷害視力で投与し、そして、1時間後に、冠状縫合糸(CS)に関連してインビボイメージングを行った。白い四角は(E)に示す細胞移動イメージの位置を表す。スケールバー= 75 μm (E) 骨(青)表面上のMx1+α SMA+P-SSCの損傷視力(右上)への移行。スケールバー= 25 μm(C,D,E)では、数値は撮像時間を示します。黄色の矢印は、傷害位置の方向を示します。アスタリスクは Mx1+α SMA+ P-SSC の移行パスを示します。画像は、3匹から5匹のマウスの結果を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

L.C O.とD.P.は、「骨修復におけるペリオスチール骨格幹細胞」(BAYM)と題する保留中の特許を開示しています。P0264US.P1)。残りの著者は、競合する利益を宣言しません。