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方法論記事

インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化

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DOI:

10.3791/61171

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2020年5月6日

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Human Technopole, 3Landesdirektion Sachsen, 4Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

この記事について

サマリー

ここで提示されるのが、子宮エレクトロポレーションで使用する胚フェレット脳における遺伝子操作を行うプロトコルである。この方法は、生体内の新皮質における神経前駆細胞の標的化を可能にする。

要約

胚発生時の生体内での遺伝子発現の操作は、哺乳動物の発達中に個々の遺伝子の役割を分析する際に選択する方法である。子宮内エレクトロポレーションは、生体内の胚哺乳類脳における遺伝子発現の操作に関する重要な技術である。小さな食動物であるフェレットの胚性新皮質の子宮内電気散挿のためのプロトコルがここに提示される。フェレットは、新皮質がヒトおよび非ヒト霊長類にも存在する一連の解剖学的、組織学的、細胞的、分子的特徴を示すが、マウスやラットなどのげっ歯類モデルには存在しないため、新皮質開発のモデルとしてますます使用されている。子宮内電気ポレーションでは、フェレット中発性の中発性ステージである胚期(E)33で行った。子宮内電気ポレーションでは、脳の側心室を裏打ちする神経前駆細胞を標的とする。神経新生の間に、これらの前駆細胞は他のすべての神経細胞タイプを生み出す。この研究は、E37、出生後(P)1、およびP16において、それぞれ子宮エレクトロポレーション後4、9、および24日後に対応する代表的な結果と分析を示す。初期の段階では、標的細胞の子孫は主に様々な神経前駆細胞サブタイプからなり、後の段階ではほとんどの標識細胞がポストミトジンクニューロンである。このように、子宮エレクトロポレーションでは、様々なタイプの神経細胞の細胞および分子特徴に対する遺伝子操作の効果の研究が可能になる。様々な細胞集団に対するその効果を通じて、子宮エレクトロポレーションでは、フェレット新皮質の組織学的および解剖学的特徴の操作にも使用することができる。重要なことに、これらすべての効果は急性であり、ユーザーによって決定される時空間的特異性で行われる。

概要

新皮質は哺乳類大脳の外側のシートであり、高い認知機能の座席,21、2、3、4、53,4,5である。胚発生時に生体内で哺乳動物新皮質で急性の遺伝子操作を達成するために、ウイルス感染6および子宮エレクトロポレーション7の2つの異なる方法が検討されている。どちらの方法も新皮質細胞の効率的な標的化を可能にするが、いくつかの制限に苦しんでいる。ウイルス感染と比較して子宮エレクトロポレーションにおける主な利点は、電界の方向を調節することによって達成される新皮質内の空間特異性を達成する能力である。

エレクトロポレーションは、インビトロ8で細胞へのDNAの侵入を容易にすることが最初に示されたことから、生体内の様々な脊椎動物にDNAを送達するために適用されている。発達神経科学では、マウス新皮質の子宮エレクトロポレーションが2001年9年に10初めて報告された。この方法は、胚性脳の側心室におけるDNA混合物の注入と、その後のテキサ電極を用いた電界の適用7からなる。子宮内エレクトロポレーションでは、マウス新皮質中の内在性または異所性付加遺伝子の発現を操作するために核酸を送達するために適用されている。最近、マウス新皮質における子宮内電気ポレーションによるCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集の方法論を適用し、後味ニューロン12、13および神経前駆細胞14、および(2)ゲノム1215およびエピゲノム16編集において(1)遺伝子破壊を行うことで重要な進歩15が見られた。

マウスの最初の報告の直後に、子宮内のエレクトロポレーションが胚性ラット新皮質17,18,18に適用された。非げっ歯類は、フェレットの子宮エレクトロポレーションの最初のまで挑戦のままでした, 小さな食動物, で報告されました2012 19,,20.それ以来、フェレットの子宮エレクトロポレーションでは、神経前駆物質とニューロン20、21、22、23を標識し21,22,23、CRISPR/Cas9,技術24の使用を含む内因性遺伝子の発現を操作し、ヒト特異的20遺伝子21、22、25、ヒト特異的遺伝子を含むヒト特異性遺伝子を含21,22む神経皮質発達のメカニズムを研究するために応用されてきた。,25さらに、フェレットの子宮エレクトロポレーションにおいて、病理学的状態27,28,28におけるヒト新皮質の発達の特徴に対処するために用いられてきた。

新皮質の発達の文脈では、フェレットをマウスと比較してモデル生物として使用することの利点は、フェレットが一連の人間のような特徴をよりよく再現するという事実によるものです。解剖学的レベルでは、フェレットは、ヒトおよび他のほとんどの霊長類にも存在する皮質折りたたみの特徴的なパターンを示すが、マウスまたはラット44、29、30、3129,30,31には完全に存在しない。組織学的レベルではフェレットは、2つの異なる心室下胚芽帯を有し、内側および外側の心室領域(それぞれISVZおよびOSVZ)32、33、内32,33繊維層23によって分離される。これらの機能は、ヒトを含む霊長類とも共有されますが、マウス34では共有されません。フェレットおよびヒトのISVZおよびOSVZには豊富な神経前駆細胞が含まれているのに対し、マウスの心室領域(SVZ)は疎神経前駆物質21、32、35、3632,35,36のみを含む。21細胞レベルでは、フェレットは、哺乳類新皮質34、37、38,37,38の進化的拡張に役立つと考えられる基底または外径神経グリア(それぞれbRGまたはoRG)と呼ばれる神経前駆体のサブタイプの高い割合を示す。bRGは、したがって胎児のヒトおよび胚性フェレット新皮質に非常に豊富であるが、それらは胚マウス新皮質35、36,36では非常にまれである。さらに、フェレットbRGは、ヒトbRGの形態学的不均一性と同様の形態学的不均一性を示し、マウスbRG21に対してはるかに優れている。最後に、分子レベルで、フェレット新皮質の開発は、皮質フォールディングの発症を制御すると推測される胎児ヒト新皮質のものと非常によく似た遺伝子発現パターンを示す。とりわけ39。

フェレットbRGの細胞の生物学的および分子的特性は、ヒトbRGと同様に、それらを高度に増殖させる。これはニューロンの増加の生産と拡張され、非常に複雑な新皮質の開発に34.これらの特性は、マウス26,40,40ではモデル化できない新皮質発達の人間のような特徴を研究するための優れたモデル生物をフェレットにする。フェレットをモデル生物として最大限に活用するために、提示された方法が開発された。これは、ユビキタスプロモーターであるCAGの制御下でGFP(pGFP)を発現するプラスミドを有するE33フェレット胚の子宮エレクトロポレーションで構成される。電気電化胚は、胚または出生後に分析することができる。殺された動物の数を減らすために、雌のフェレット(ジル)は子宮摘出術によって殺菌され、ペットとして養子縁組のために寄付される。標的胚が胚期に収穫された場合、第二の手術が行われ、胚は帝王切開によって除去され、ジルは子宮摘出される。標的胚が出生後の段階で分析される場合、ジズは子犬が脱後または犠牲になった後に子宮摘出される。したがって、ジルの子宮摘出のためのプロトコルも提示される。

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プロトコル

すべての実験手順は、ランデスディレクション・ザクセンの承認を得てドイツ動物福祉法に同意して実施されました(ライセンスTVV 2/2015およびTVV 21/2017)。

1. 子宮内電気ポレーションの準備

  1. DNA混合物を準備します。このプロトコルでは、pGFPの最終濃度は1μg/μLが使用されます。PBSでDNAを溶解し、可視化を容易にするために0.1%の高速グリーンで補います。準備ができたら、数回上下にピペットまたは指のタッピングによってDNA混合物を混合する。使用するまで室温で保管してください。
    注意:コエレクトロポレーションの場合、DNA混合物は、PBSで希釈されたpGFPの0.5 μg/μLと共に、目的の遺伝子をコードするプラスミドの最終濃度1 μg/μLを含む準備が整います。
  2. 必要な工具と器具をすべて使って手術台を準備します。
  3. マイクロピペットプーラーを使用してガラスの毛細血管を引っ張ります。前述の41のように鉗子を使用して毛細管の遠位部分を切り落とすことによって毛細管先端の直径を調整する。

2. 手術用フェレットの準備

  1. 嘔吐のリスクを減らすために、手術前に少なくとも3時間E33断食で胚を持つ妊娠中のジルを保ちます。
  2. 手術前にオートクレーブですべてのツールを殺菌します。無菌状態で特別に割り当てられた部屋で手術を行い、潜在的な汚染源を排除します。
  3. 4%イソフルランとナルコシスボックスに妊娠中のジルを置きます。
  4. 麻酔をしたとき、フェレットをヒートパッドで操作テーブルの上に置き、鼻に一定の2〜3%のイソフルランの流れを持つナルコシスマスクを取り付けます。適切なレベルの麻酔を確実にするために、以下の反射神経の欠如を確認してください。
    1. 眼球の皮膚に触れることによる、触動神経反射
    2. 2番目 と3rdの間、または3番目 と4番目 の後肢のつま先の間の皮膚をつまんで屈筋反射
    3. もし、触動反射が存在せず、屈筋反射が明らかに減少している場合は、後肢の足の指を1本つまんで痛みの反射を確認する。
      注:必要に応じて心拍数とリズムを監視するために、聴診器を手元に持っていることを確認してください。
  5. フェレットを鎮痛薬(0.1mLのメタミゾール、体重50mg/kg)、抗生物質(0.1 mL/kgの体重20mg/kgのアモキシシリン+クラヴラン酸)、グルコース(5%グルコース溶液10mL)で皮下注射します。
  6. 外科的処置中の眼の脱水を防ぐために、目の上に眼軟膏溶液の滴を置く。
  7. フェレットの腹を剃ります。
  8. 水と石鹸で肌をきれいにし、70%エタノールスクラブで腹を消毒し、ヨウ素で2xを消毒し、乾燥させます。

3. フェレットの子宮エレクトロポレーションで

  1. 手術領域が無菌であることを確認する:滅菌組織に無菌の外科用具を置き、コートおよび手袋を変更する。
  2. 動物に無菌の外科用ドレープを置きます。
  3. メスを使用して、リネアアルバの腹を〜5cmの長いカットで外科的に開く。
  4. はさみを使って筋肉の層を切ります。
  5. 切開部位の周りにガーゼスワブを置き、PBSでそれらを濡らします。ガーゼ綿棒は、手術中に追加される追加のPBSを吸収します。
    注:手術中は熱とPBSのサポートを維持してください。
  6. フェレット子宮を露出させ、ガーゼ綿棒の上に置きます。
  7. 長い負荷チップを持つピペットを使用して、注入溶液でガラスキャピラリーをロードします。胚の数と実験条件の数に応じて、負荷量がおよそ5〜20 μLであることを確認してください。胚あたりの平均注入容積は3~5μLで、装填されたガラスキャピラリーをホルダーに取り付け、ホルダーの反対側をチューブとマウスピースに接続します。
  8. 最初の胚を検査し、頭を見つける。
  9. 視覚化を容易にするために、光ファイバー光源を胚の頭部の隣に置きます。
    注:フェレットの子宮壁は非常に暗く、光が直接光を当てない限り、それらを通して見ることは困難です。
  10. 脳半球の1つの心室への単一の心室内注射を行い、他の半球をそのまま維持して内部制御として機能する。心室自体は目で区別されにくいので、その位置は、目に見える色素虹彩の位置に基づいて推定されます。心室内注射は、ガラスキャピラリーに付着したホルダーを取り、ガラス毛細血管の先端で皮膚、頭蓋骨、脳組織を貫通することによって行われます。
    注:マウスプラセンタよりも暗い胎盤を損傷しないようにしてください。
    1. ガラスキャピラリーの先端が心室にある場合は、ガラスキャピラリーホルダーに接続されたマウスピースを使用して口ピペットで約3〜5μLの注入液を注入します。注入された溶液は0.1%の速い緑を含んでいるので、注入された心室は今暗緑色に変わり、腎臓形の構造として見える。
  11. 正極が標的となる領域の上に配置され、負極が注入された領域の下に置かるように、子宮の頭の上にツイーザー電極を置きます。
  12. エレクトロポレーターに次のエレクトロポレーション条件を設定します: パルス長 = 50 ミリ秒;パルス電圧= 100 V;パルス間隔 = 1 秒パルスの数 = 5。次に、エレクトロポレーターの「パルス」ボタンを押します。
  13. すぐに電気ポレート胚に暖かい1x PBSの数滴をドロップします。
  14. すべての胚に対して手順を繰り返します。子宮は常に暖かいPBSで濡れ続けます。
    注:膣に面した最初の胚に簡単にアクセスできない場合は、それらを電気ポレートしないことをお勧めします。
  15. すべての胚が電気ポポレートされたら、子宮を腹腔に戻します。
  16. 4-0縫合を用いて腹膜で筋肉層を縫合する。
  17. 同じ厚さを使用して皮膚を縫合し、傷口をアルミニウムスプレーでスプレーします。
  18. ケージに動物を置き、熱源で暖かく保ちます。目が覚まるまで動物を注意深く監視してください。

4. 対象動物の術後ケアと住宅

  1. 手術後3日間、動物が術後ケアを受けていることを確認します: 20 mg/kg アモキシシリン (抗生物質) 毎日 1x;25 mg/kg メタミゾール (鎮痛) 3x 毎日.
  2. フェレットが個別に収納されていることを確認します。
  3. フェレットは獣医によって1日に少なくとも1倍検査されることを確認してください。
  4. フェレットが配達中にできるだけ邪魔されていないことを確認してください。
  5. 子犬が泣いたり犠牲になったりした後、子宮摘出のためにジルを準備する。

5. フェレットの子宮摘出術

注意:除菌動物をペットとして養子に寄付できるように、殺された動物の数を減らすために子宮摘出術を行います。子宮摘出術の術前の手順は、ステップ2と同じです。

  1. 手順 3.1 および 3.2 で説明したようにフェレット腹を剃り、滅菌します。
  2. 外科的にリネアアルバで腹を開きます.筋肉層をカットします。筋肉層を持ち上げ、完全に筋肉層を開きながら指で腸を保護します。
  3. 切開部位の周りにガーゼスワブを置き、滅菌PBSでそれらを濡らします。フェレット子宮と卵巣を露出させ、ガーゼ綿棒の上に置きます。
  4. 動脈卵巣と頭蓋頭蓋を中隔に合体させることにより、片側で子宮摘出術を開始する。ライゲーションの両側にクランプを入れ、クランプに対して別のライゲーション頭蓋を行います。ライゲーションの端に3つ目のクランプを取り付けて保存します。反対側で繰り返します。
  5. クランプの間を切り、両側の腸間膜からコルヌア子宮を取り外します。
  6. 両子宮側の動脈子宮をオスティウム子宮にリゲートする。その後、膣をリゲートし、合字を修正します。それらを保存するために結紮の端にクランプを取り付けます。合字に2つのクランプ頭蓋を入れます。クランプの間を切り、膣から子宮を切り離す。子宮と卵巣を取り除き、処分する。子宮の尻から残った粘膜を削る。
  7. 残りのクランプをすべて取り外し、合字の端を短くします。クランプが取り外された後、出血を制御するようにしてください。
  8. ステップ3.16および3.17に記載されているように筋肉層および皮膚を縫合する。手順 3.18 および 4.1- 4.3 の手順に従って、術後プロトコルに従ってください。動物の動物を動物施設に少なくとも2週間保管し、定期的な獣医を訪問してください。動物が完全に回復した後、彼らは養子縁組のために寄付することができます。

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結果

E33におけるフェレットの子宮エレクトロポレーションでは、胚性新皮質の心室表面を裏打ちする神経前駆細胞を標的化した(図1)。これらの細胞は、アプリカル前駆物質と呼ばれ、高度に増殖し、開発中に他のすべての細胞タイプを生み出します。非対称分裂の際、有端な前駆体は、別の有端前駆体およびより分化された細胞、典型的には心室表面から剥離した基底前駆体(BP)を生成した。BPは二次胚分帯SVZに移行した。E33でエレクトロポレーションが行われたとき、多くの新生児のBPはSVZの基底部分に移行し、そこでOSVZ22を形成した。

E37で4日後にエレクトロポレーションの効果を調べた場合、標的細胞とその子孫のほとんどは胚細胞領域(VZ、ISVZ、およびOSVZを参照)にあり、細胞が皮質プレート(CP)でさらに基底に存在することはめったになかった。標的細胞の子孫は、主に神経前駆細胞型と新生児ニューロンから構成された。前駆体同一性は、PCN...

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ディスカッション

フェレットにおける子宮エレクトロポレーションでは、他の方法に関しては利点と欠点を有する重要な技術である。この方法には、重要な手順と制限事項、潜在的な変更、将来のアプリケーションが考慮されます。

Victor Borrellたちの先駆的な研究は、エレクトロポレーションまたはウイルス注射35、42、4342,43による出生後フェレット35新皮質の遺伝子操作に関する研究の先駆者として、遺伝的にアクセス可能なモデル生物となっています。子宮エレクトロポレーション19で胚発生時に遺伝子操作を確立する20は、初期の発達段階で神経前駆細胞を標的にできるようにすることで、新しい研究の可能性を開いた。出生後の操作と比較して、子宮エレクトロポレーションでは、新皮質のより大きな領域を標的にし、新皮質の他の...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

マックスプランク分子細胞生物学遺伝学研究所のサービスと施設に感謝し、フェレットとJ.ペイクルの優れた畜産と軽顕微鏡施設の彼のチームのために生物医学サービス(BMS)のチーム全体が提供された優れたサポートを提供しました。特に、BMSのカトリン・レッペとアンナ・プフェファーが優れた獣医支援をしてくれたことに感謝し、フットナー・グループのレイ・シンがフェレット手術を支援してくれたことに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1mlシリンジBD309628エレクトロポレーション
4-0 Vicryl縫合糸EthiconV392ZG手術
アルミスプレーcp-pharma98017手術
アモキシシリン+クラブラン酸(Synulox RTU)WDT6301手術
カピラリーホルダーWPIMPH6S12エレクトロポレーション
デクスパンテノール軟膏溶液バイエル6029009.00.00手術
ドレープシート45x75cmハルトマン2513052手術
電極ピンセット、プラチナメッキ5mmBTX45-0489ポレーション
エレクトロポレーターBTXECM830ポレーション
ファストグリーンシグマF7258-25Gエレクトロポレーション
Ferret Mustela putorius furoMarshallNA実験生物
光ファイバー光源オリンパスKL1500LCDエレクトロポレーション
鉗子Allgaier instrumente08-033-130手術
用鉗子 3C-SARubis Tech3C-SA手術
用鉗子 55デュモスター11295-51手術
鉗子 5-SAルビステック5-SA手術用
ガーゼ綿棒 大ハルトマン401723手術
ガーゼ綿棒 小ハルトマン401721手術
GFAP抗体ダコZ0334
GFP抗体アベスラボGFP1020抗体
ガラスカピラリー(フィラメント付きホウケイ酸ガラス、外径:1.2mm、ID:0.69mm、長さ10cm)サッター機器BF120-69-10エレクトロポレーション
グルコースBela-pharmK4011-02
用ヒートパッドハンス・ディンスラージュ・サニタスSHK18手術用
ヨウ素(ベタジン溶液100mg / ml)メダ997437外科イ
ソフルランCP21311手術
ローディングチップ20µlEppendorf#5242 956.003エレクトロポレーション
メタミゾールWDT99012手術
メッツェンバウム 解剖ハサミAesculapBC600R手術
マイクロピペットプーラーSutter InstrumentModel P-97エレクトロポレーション
pCAGGS-GFPNANAKalebic et al., eLife, 2018
PCNA 抗体ミリポアCBL407抗体、
pH3抗体アブカムab10543
Aesculap、294200104手術、
シェーバーブラウン、EP100手術、
Sox2抗体、R + Dシステム、AF2018
、外科用クランプ、13cm、WDT、27080、手術
外科用ダブルスプーン(Williger)WDT27232手術
用ドレープWDT28800手術
用ハサミ 小FST14090-09手術
縫合針ホルダーAesculapBM149R手術
Tbr2抗体Abcamab23345抗体
トランスファーピペット 3mlフィッシャー科学13439108手術用ウォーター
バスJulaboTW2Surgery
エレクトロエレクトロ抗体 手術、抗体メス、、抗体

参考文献

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