方法論記事

意識のあるマウスのストレス誘発性高血糖を軽減するための腹腔内インスリン負荷試験前の順応

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DOI：

10.3791/61179

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2020年5月22日

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1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

この記事について

サマリー

ストレスによるグルコースレベルの上昇は、マウスの意識的な腹腔内インスリン負荷試験から得られたデータの解釈を混乱させる可能性があります。この記事では、ストレス誘発性高血糖を制限するために、インスリン負荷試験を実施する前にマウスを取り扱い、注射、および採血に順応させる方法について説明します。

要約

インスリン負荷試験は、げっ歯類の全身インスリン感受性を評価するための代謝研究で一般的に使用されます。これは、インスリンの1回の腹腔内注射後の経時的な血糖値の測定を含む比較的単純なテストです。意識のある状態で行われ、血液はテールスニップを介して採取されることが多いため、取り扱いや採血に伴う不安から動物からストレス反応を引き出す可能性があります。そのため、ストレスによる血糖値の上昇が発生する可能性があり、主要評価項目の測定値、つまりインスリンを介した血糖値の低下を検出して解釈することが困難になります。これは多くのマウス系統で見られ、インスリン投与後にグルコースレベルが減少するのではなく増加する可能性がある糖尿病のdb / dbマウスでは非常に一般的です。ここでは、インスリン負荷試験を行う前に、マウスを取り扱い、注射、および採血に順応させる方法について説明します。これにより、ストレスによる高血糖が低下し、全身のインスリン感受性をより正確に反映するデータが得られることがわかりました。

概要

げっ歯類の代謝試験は、グルコース恒常性を調節するさまざまなパラメータを評価するために定期的に実施されています1。in vivo で全身のインスリン作用を評価するためのゴールド スタンダードは、高インスリン血症-真血糖クランプ2 です。このテストでは、インスリンを投与して循環インスリンレベルを上げ、グルコースを注入して血糖を維持します。真血糖を維持するために必要なグルコース注入速度は、インスリン作用を示しています。.クランプ法は代謝研究において強力なツールですが、マウスのクランプ技術は技術的に困難で労働集約的であるため、代謝表現型を特徴付けるための初期スクリーニングツールとしてはあまり適していません。これらの理由から、より単純な腹腔内インスリン負荷試験(ITT)がしばしば選択されます。

ITTは、絶食期間(通常は4〜6時間)後の意識状態で実行されます。インスリンのボーラスを腹腔内に投与し、その後、血糖値を通常60分間にわたって監視します。血糖値は、インスリンがインスリン感受性組織へのグルコース取り込みを促進する能力により低下すると予想されます。これがどの程度発生するかは、全身のインスリン作用を示しています。.場合によっては、インスリン投与後にグルコースレベルが逆説的に減少するのではなく増加することが示されています。この現象は、ストレス反応に起因する可能性があります。取り扱い、注射、採血はすべてストレスを誘発し、視床下部-下垂体-副腎軸(HPA)と自律神経系(ANS)6,7,8の活性化をもたらす可能性があります。HPAとANSの両方が循環血糖値9,10,11の増加に寄与することはよく知られています。ITTの開始時にストレス誘発性高血糖が存在することは、インスリン投与時のグルコースの低下の速度と大きさを妨げるため、問題があります12。これは、インスリン抵抗性の存在に関して誤った結論につながる可能性があります。したがって、ITT中の血糖値に対するストレスの交絡影響を軽減するために、ITTを実行する前にマウスを取り扱い、注射、および採血に順応させる方法を開発しました。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、VAピュージェットサウンドヘルスケアシステムの施設用動物管理および使用委員会によって承認されています。

注:低血糖を経験する動物のモニタリングおよび/または介入に関する地域の要件は、ここに記載されているものとは異なる場合があります。

1. ファスティング (t= -210 分)

  1. 暗期サイクルが終了した後、マウスをセルロースや紙製の寝具などの栄養価の低い寝具(トウモロコシの穂軸の寝具ではなく、マウスが摂取すると代謝エンドポイントに影響を与える)を備えた新しいケージに移します13。絶食期間中、マウスに水への自由なアクセスを提供します。マウスのグループ間での空腹時と期間に一貫性を持たせてください。示されたデータでは、0700時間から0800時間の間に食物が取り除かれました。これは、ダークサイクルが終了してから1〜2時間後でした。
  2. ITTが実行される場所にケージを移動します。これは、温度、騒音、光、動きなどのストレス要因が最小限に抑えられる静かな空間であるべきです。

2. 順化 (t= -150 から -60 分)

重要: マウスはできるだけ優しく扱ってください。可能であれば、拘束装置の使用を避けてください。

  1. -150分で体重を測定します。これは、ITT に投与されるインスリンの量の計算に使用されます。
  2. マウスのテールをそっとつまみ、テールをそっと握ったまま、平らなテーブルトップの表面に置きます。20Gの針(または手術用ハサミ)を使って、尻尾の先端に小さな切開をします。その部位に一滴の血液が形成され始めるはずです。
  3. マウスを滑らかで硬い面に置き、マウスの尻尾を優しく拘束します。
    1. このときの血糖値を記録するには、ハンドヘルド血糖値のテストストリップに尾端から一滴の血液を置きます。必要に応じて、尾 を非常に優しく マッサージして一滴の血液を採取します。
  4. 100 μLの滅菌生理食塩水をインスリン注射器に吸い込みます。やさしく首筋を動かしてマウスを手に取り、腹腔内に注入します。生理食塩水注射の時間を記録します。
    1. 複数のマウスを研究している場合は、マウスに生理食塩水を1分間隔で注入して、以下の次のステップの時間を確保します。.
  5. 生理食塩水注射の15分後、マウスの尻尾を優しく拾い上げます。ガーゼを使用して、尾の先端の血栓をやさしく取り除きます。
    1. オプション: ステップ 2.3 で説明したように、この時点で血糖値を再度記録します。
  6. 生理食塩水注射の30分後に、マウスの尾を優しく拾います。必要に応じて、ステップ2.3で説明されているように、別の血糖測定値を取得します。
  7. マウスをケージに戻し、必要に応じて他のマウスについても繰り返します。マウスを-90分まで放置します。
  8. -90分で、必要に応じて血糖値の測定を含め、手順2.3から2.6を繰り返します。
  9. マウスをケージに戻し、必要に応じて他のマウスについても繰り返します。ITT(ベースラインの血糖測定が-5分で行われる)までマウスを邪魔しないでください。

3. インスリン負荷試験 (t= -5 から +60 分)

  1. 滅菌生理食塩水に通常のインスリン(注意)の作業溶液を準備し、希望の用量を4μL / g体重で注射できるようにします。.
    注:インスリンの取り扱いには注意が必要です。誤って注射すると低血糖を引き起こす可能性があるためです。
  2. マウスが介入を必要とする低血糖を発症した場合に備えて、滅菌生理食塩水に25%(v / v)デキストロース溶液を準備します。
  3. -5分後、マウスの尻尾をそっとつまみます。このときのベースライン血糖値を決定するには、ハンドヘルド血糖値のテストストリップに尾端から血液を一滴垂らします。必要に応じて、尾 を非常に優しく マッサージして一滴の血液を採取します。
  4. インスリン用溶液をインスリン注射器(体重4μL / g、典型的な用量範囲0.5〜2.0U / kg)に引き込みます。.やさしく首筋を動かしてマウスを手に取り、腹腔内に注入します。インスリン注射の記録的な時間。
    1. 複数のマウスを研究している場合は、マウスにインスリンを1分間隔で注射して、その後の採血と以下のデータ記録の時間を確保します。.
  5. インスリン注射の15分後、マウスの尻尾を優しくつまみ上げます。ガーゼを使用して、尾の先端の血栓をやさしく取り除きます。このとき、ステップ3.3で説明したように、血糖値を再度測定します。
  6. マウスをケージに戻し、低血糖の兆候(過度の嗜眠など)を監視します。マウスに低血糖の症状が現れた場合は、ステップ5で説明したように血糖を測定し、必要に応じてデキストロースを投与します。.デキストロース介入を受けているマウスは、この時点でITTプロトコルから削除されます。
  7. インスリン注射の30分後に手順3.5と3.6を繰り返します。
  8. インスリン注射の45分後にステップ3.5と3.6を繰り返します。
  9. インスリン注射の60分後に手順3.5と3.6を繰り返します。
  10. マウスを自宅のケージに戻し、ケージの床にいくつかの食物ペレットを入れて、ITTからの回復を助けます。30分間モニターを続け、マウスが正常な活動/行動を取り戻していない場合は、ステップ3.6で説明されている手順に従ってください。
    注: 図1 は、上記の順応とITT手順をまとめたものです。

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結果

図2A および 図3A は、インスリン投与後15分間の糖尿病db/dbマウスにおける血糖値の逆説的な上昇を示す代表的なデータ(それぞれ個別および平均データ)であり、ストレス誘発性高血糖と一致する。なお、同じ手順を受けた対照の非糖尿病同腹仔(db/+または+/+)では、血糖値の上昇は見られませんでした。ITT手順への順応がこの血糖値の増加を緩和するのに効果的であるかどうかを判断するために、同じマウスに上記の順応プロトコルを受けました。各主要なステップはグラフ内の垂直線で示され(図2B)、マウスが処理されるたびに血液サンプルが採取されました。-150分での取り扱いおよび/または生理食塩水注射により、4 db/dbマウスのうち3匹で血糖値が上昇しました(赤い丸)。4匹目のマウスの血糖値は>600mg/dLでした。使用した血糖値計の検出上限は600mg/dLであるため、4匹目のマウスで血糖値が上昇するかどうかは確認できませんでした。その後の-90分での取り扱いに...

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ディスカッション

高インスリン血症-正常血糖クランプは、in vivo でのインスリン作用を評価するためのゴールド スタンダードと考えられています。クランプを実施するための方法論の修正は、頸動脈を介した血液サンプリングおよび頸静脈を介した注入を可能にするために、以前に2カテーテルシステム14を使用してカテーテル化された意識のある、拘束されていないマウス2において技術が行われる結果となった。これにより、処置中にマウスを取り扱うか拘束する必要性が制限され、それによってストレス反応が減少する2。代謝研究において、ストレスがさまざまなエンドポイント測定を混乱させる可能性があることはよく認識されています1,3。ストレスは、採血、嗅覚刺激、騒音、光、麻酔など、取り扱いに加えてさまざまな要因によって誘発される可能性があります

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所の助成金P30 DK-017047(ワシントン大学糖尿病研究センター、細胞機能分析コア)、および米国退役軍人省のVAピュージェットサウンドヘルスケアシステム(ワシントン州シアトル)の支援を受けました。この原稿の内容は、米国退役軍人省または米国政府の見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デキストロース-50ファイザー注射剤00409-6648-16マウスが低血糖を経験した場合に使用します。
ガーゼパッドフィッシャーサイエンティフィック22037907尾の先端の血栓を取り除きます。
血糖値計Accu-ChekM001_us血糖値を測定します。
グラムスケール体重を測定するため。
インスリン(ノボリンR)ノボノルディスク0169-1833-11注射用。
インスリン用シリンジVWRBD-329461注射用。
ミニッツタイマー
滅菌済み 20G ニードルVWRBD-305175テールスニップ用。
滅菌生理食塩水ライフシールド1261699注射用。
外科用ハサミファインサイエンスツール14088-10テールスニップ用。
テストストリップAccu-Chek06908217001_us血糖値を測定するため。

参考文献

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