糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師付き機械学習

Summary

細胞死の間に放出される細胞外DNA(ecDNA)は炎症を誘発し、炎症に寄与する。傷害部位におけるecDNAの測定は、標的器官における治療の有効性を決定することができる。このプロトコルは、機械学習ツールを使用して腎臓組織のecDNAの測定を自動化する方法を説明します。

Abstract

糸球体細胞死は、骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)の病理学的特徴である。細胞外デオキシリボ核酸(ecDNA)は、アポトーシス、壊死、ネクロトーシス、好中球外細胞トラップ(NETs)およびピロトーシスを含む細胞死の異なる形態の間に放出される。この細胞死の測定は、細胞死の異なる生化学的形態を同定するために必要ないくつかの異なるバイオマーカーで時間がかかる。ecDNAの測定は、一般に、病的損傷が起こる実際の標的器官ではなく、腎損傷の代理として血清および尿において行われる。腎臓のecDNAを調査する上で現在の難しさは、実験的およびアーカイブされたヒト腎臓生検の両方でホルマリン固定パラフィン埋め込み組織(FFPE)の方法の欠如である。このプロトコルは、FFPE組織(ヒトとマウスの両方)でecDNAを染色し、自家蛍光をクエンチし、一般に公開されているオープンソースImageJプラグインのトレーニング可能なWekaセグメンテーションから機械学習ツールを使用して、結果の画像中のecDNAを測定するために必要なステップの概要を提供します。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、プログラムが ecDNA を分類することを学習する糸球体の中の ecDNA に適用されます。この分類器は、後に取得した腎臓画像に適用され、個々の画像の手動注釈の必要性を減らします。トレーニング可能なWekaセグメンテーションの適応性は、実験的なマウス抗MPO糸球体腎炎(GN)から腎臓組織においてさらに実証され、NETおよびecMPOを同定し、抗MPOGNに共通の病理学的寄与者である。この方法は、トレーニング可能なWekaセグメンテーションプログラムが健康な正常な腎臓組織と病気の腎臓組織との間でecDNAを区別できる有効性を明らかに示す腎臓組織におけるecDNAの客観的な分析を提供する。このプロトコルは、他の臓器のecDNA、NETおよびecMPOを同定するために容易に適応することができる。

Introduction

骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)は、腺球体損傷による腎不全を有する自己免疫疾患であり、相当な細胞死および脱酸性ビオ核酸(DNA)1、2。^1,2DNAは、危険信号として機能することによって免疫系を活性化することができます。正常な健康な条件下では、DNAの核位置は免疫系への暴露からの保護を提供する。病原性プロセスまたは自己免疫の間に細胞外に放出される自己DNAは、免疫系によって、分子自己タンパク質(DAMP)3に関連する強力な炎症障害として見^られる。細胞外DNA(ecDNA)は、アポトーシス、ネクロトーシス好中球外細胞トラップ形成(NETs)、壊死またはピロプトーシス^4,4、5、6、7、8などの異なる生化学的経路によって支配されるいくつかの異なるメカニズムを介して死細胞から放出される。^5,6,7,8

我々は、MPO-AAV^99,1010の患者からの実験的抗MPO GNおよび腎臓生検からホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)腎臓のセクションで死細胞から放出されるecDNAを染色および測定する方法をここに記載する。血清および尿の両方から、およびインビトロアッセイ^11,12から循環二本鎖DNA(dsDNA)およびDNA複合体を検出するための複数の方法^が12存在する。これらの方法は、ecDNAの量を決定する際に正確であるが、ecDNAが解剖学的に放出される場所を決定しない。アポトーシスのためのチューンルや細胞デブリの測定などのecDNAの特異的測定を記述する方法があります^13,,14.病的損傷が起こるFFPE腎臓におけるあらゆる形態の細胞死から最高潮に達したecDNAの測定を記述する方法はない。これは、実験的治療が実際の標的器官の病的傷害部位からecDNAをクリアしているかどうかを判断するために重要である。

腎臓サンプルから複数の画像を取得すると、1人のユーザーによって一般的に分析される大量のデータが作成されます。これは、労力がかかり、時間がかかり、ユーザーの偏見のために、他のユーザーが信頼性の低い再現性を受ける可能性があります。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、機械学習アルゴリズム^15,,16を使用してピクセルを分類するために最先端のバイオインフォマティクスツールを使用する ImageJ 用のオープンソースソフトウェアプラグインです。この方法は、ユーザーのピクセルのセグメントの分類から学習し、新しい学習した分類を他の画像に適用する「トレーニング可能」です。この方法は、特定の「クラス」に属するものとしてセグメント内の各ピクセルを「分類」するために使用される ImageJ プログラム内の一般的な分析ツールに依存します。プログラムが「分類子」を学習すると、同じ画像内の他の類似した分類セグメントを識別するために使用できます。このモデルは、同じ実験内の他の画像セットに保存され、適用されます。

腎臓切片におけるその場でのecDNAの決定に対する現在の障害は、ホルマリンにおける固定からの内因性自己蛍光と画像の労働集約的な分析である。ここでは、この自己蛍光を消し止め、ecDNAを検出し、ecDNAの高スループット測定のための教師付き機械学習を使用する方法について説明します。我々は、以前に、ImageJのマクロを用いてNETおよび細胞外MPO(ecMPO)の測定を公表し、今では、教師付き機械学習¹を用いてこれらの方法の半自動化を実証する。同じ画像内でNETとecMPOの代替染色を分類するために、機械学習ツールの適応性を実証します。ecDNA、NETおよびecMPOを検出するためにここで説明するこれらの染色法は、ecDNA、NETSおよびecMPOが関節リウマチおよびルプス^17,18,18などの永続的疾患において役割を果たす他の固体器官および疾患に翻訳することができる。

Protocol

この方法は、細胞死のすべての形態からの汎ecDNAの検出を可能にする。同じ方法と抗体がヒト腎臓生検組織に使用される(ステップ4から)。すべての動物と人間の被験者は、モナッシュ大学、モナッシュヘルス、クレイトン、ビクトリア、オーストラリアからの倫理承認を受けました。

1. DAPIとβアクチンを用いたecDNAの染色

1. 抗骨髄ペルオキシダーゼ糸球体腎炎(抗MPO-GN)の20日間モデルを8-10週齢のC57/Bl6マウスで誘導し、コントロール⁹を用いた。
   1. CO2チャンバーを用いてマウスを人道的₂に安楽死させる。
   2. はさみで皮膚を通して前正中線切開を行うことによって腎臓を除去し、その後慎重に腹筋を切断し、解剖板にピンバックします。鉗子を使用して、前腎筋膜と頭頂腹を脇に押し出し、腎盂の尿管および血管(腎動脈および静脈)を切断することによって腎臓を自由に切断する。鉗子で取り出し、サイズ22メスで半分(矢状面)に腎臓を切断します。
   3. 腎臓を固定液(4%緩衝ホルマリン)に室温(RT)で16時間置く。処理前に24時間、固定腎臓を30%エタノールに取り除き、浸します。
2. 標準的な6時間サイクルを使用して腎臓を処理する:
   70%エタノール15分間
   90%エタノール15分間
   100%エタノール15分間
   100%エタノール20分間
   25分間のエタノール100%
   30分間のエタノール100%
   キシレン 20分間
   キシレン 30分間
   キシレン 40分間
   ワックス 30分間
   ワックス 35分
   ワックス 40分間
   注:腎臓は、目的の抗原を破壊することができるので、ワックスの熱に長時間暴露されるべきではないので、これは重要です。
3. マイクロトーム上で3μmのセクションをカットし、プラス電荷でコーティングされた市販のガラス顕微鏡スライドに取り付けます。一晩乾燥させます。
4. スライドラックにガラススライドを60°Cのオーブンに入れ、60分間置きます。
   注: ステップ 1.3 および 1.4 は、抗原検索ステップ中にセクションが浮かび上がらないようにするために重要です。
5. スライドを2回の溶剤(キシレンまたは代替品)にそれぞれ40分間、ヒュームフードに浸します。
6. 100%エタノール中のリハイドレートスライド、100%エタノール、70%エタノールをそれぞれ5分間用いた。水道水で5分間洗います。
7. ホットプレートをフュームフードに入れ、圧力鍋にプリボイルド抗原検索溶液(10 mM Tris、1 mM EDTA pH 9.0)を入れます。抗原の取り出し液が沸騰し始めたらすぐに、トングのペアを使用してポットにスライドを水平に置き、蓋をロックします。高い(15 psiまたは103 kPaに相当)で10分間沸騰させます。
   注:このステップは、抗原エピトープ(ホルマリン固定を介して架橋)を解除して目的の抗原を取り出し、エピトープ抗体特異的結合を可能にするため、その後の染色は、それなしでは機能しません。
8. 熱から圧力鍋を取り除き、シンクの蓋の上にコールドタップを実行してすぐに蓋を取り除きます。スライドを離れ、抗原検索液中で20分間平衡させます。
9. 軌道シェーカー上で0.01 Mリン酸緩衝生理食塩分(PH 7.4)で5分間スライドを2回洗浄します。
10. この時間に組織を乾燥させないように注意して腎臓組織の周りに円を描くために疎水性ペンを使用してください。
11. 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS(pH 7.4,0.01 M)の10%ニワトリセラで30分間、60μLのブロック組織。このステップの後に洗わないが、慎重に60 μLピペットを使用してブロッキング溶液を除去し、セクションを乾燥させないでください。
12. 1%BSA/PBS(pH 7.4,0.01 M)で1/1000希釈したβ-アクチン用の一次抗体カクテルを適用し、1セクションあたり60μL、4°Cの湿度チャンバーで一晩インキュベートします。
13. 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
14. 二次抗体、鶏抗ウサギ488(1/200)、1%BSA/PBS(pH 7.4、0.01 M)に希釈した1セクションあたり60μLをRTで40分間塗布します。
15. スライドを軌道シェーカーでPBS(pH 7.4,0.01 M)で5分間2回洗浄します。
16. スライドを0.3%スーダンブラックに70%エタノールで30分間コプリン瓶に浸します。
    注:このステップは、ホルマリン固定によって引き起こされる自己蛍光を消すために重要です。
17. スライドを水道水で洗浄して沈殿物を除去し、PBS(pH 7.4,0.01 M)に10分間浸して、さらにスーダンブラック沈殿が形成されるのを防ぎます。
18. DAPIを使用して3つの60 μLの取り付け溶液を使用して、共焦点ガラスカバーリップにスライドを取り付け、カバースリップの周囲に塗布することでマニキュアでカバーリップを密封します。
19. スライドがRTで24時間硬化し(DAPIが浸透するように)、光から保護された4°Cで保存することができます。
    注:蛍光プローブの退色を防ぐために暗闇の中に保管することが重要です。
20. 顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査ヘッドを用いて画像スライド。DAPI用405レーザーとベータアクチン用488レーザーでエキサイトスライド。ecDNAの検出に不可欠なラインシーケンシャルキャプチャと4ライン平均を使用して、単一平面1024 x1024ピクセル画像をキャプチャします。40x 1.0 NA油の目的が使用されます。
    1. サンプルあたり最低20個の糸球体を画像化します。ND2ファイルとして画像を保存します。

2. DAPIおよびβアクチン分析

1. イメージJをインストールします: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. [プラグイン] の下で、トレーニング可能な Weka セグメンテーションが利用可能であることを確認する |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.
3. ImageJ ツールバーにイメージをドロップします。[イメージ |色 |チャネルの分割:青い染色でDAPIを持つ1つの画像が表示され、緑色のβ-アクチンを持つ1つの画像が現れ、糸球体を示す。
   1. 単一の画像のマージされたファイルを作成し、色をクリックして、糸球体の関心領域(ROI)を描画します。チャネルの結合:ポップアップ ボックスは、各チャネルに色を割り当てるように求めます。各チャネルに色を割り当てた後、[合成の作成] ボックスと [ソース イメージの保持] ボックスにチェックマークを付けて[OK]をクリックします。合成画像が合成されます。
   2. βアクチン染色をガイドとして使用し、糸球体の房の周りにROIを描きます。このプロトコルの最後で ROI を使用するには、このイメージを脇に置いてください。
4. 単一の青色の DAPI イメージにガウス ブラーを実行します。[プロセス] をクリックして 、フィルタ |ガウスブラー、1-2.00に入れて。イメージは少しぼやけて見えますが、核は滑らかで背景が柔らかくなります。
   注: この手順は、ノイズを除去して、関連するイメージ属性の検出を妨げる可能性のあるアーティファクトからイメージをクリーンアップするために事前に作成されています。
5. プラグインをクリックしてください |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.
6. ImageJ のツールバーのライン ツールを使用して、まずフリーハンドツール(選択可能なライン、円形、四角ツールオプション)を使用して、無傷の核の周りをトレースし、[クラス 1の追加]ボックスに追加します。
7. ImageJ のツールバーのライン ツールを使用すると、バックグラウンドの領域が[クラス 2]ボックスに表示されます。
8. Weka セグメンテーションウィンドウの「新規クラスを作成」ボタンのラベルをクリックし、「ecDNA」というラベルを付けます。DAPI によって染色された核外 DNA を線分にする場合は、(ImageJ ツール バーから)ライン ツールを使用します。
9. トレーニング可能な Weka セグメンテーション ウィンドウのトレーニング メニューの [トレーニング分類子] ボタンをクリックします。
   注意:[STOP]ボタンは[列車の分類器]ボタンの代わりに表示され、トレーニングが終了するまで残ります。プロセスが中断されるので、トレーニング中にこのボタンをクリックしないでください。
10. [結果を作成]ボタンをクリックすると、すべての分類済みコンポーネント(無傷の核、背景、特定されたecDNA)を含む画像が作成されます。
11. [確率の取得] ボタンをクリックします。マウスを切り替えて、選択オブジェクトを白で強調表示して、すべてのクラスの白黒画像を表示します。
12. 画像をクリックしてこの画像を複製する |複製.
13. ecDNAを含むマウスボタンを使用して画面に切り替えます。しきい値を適用して、ecDNAとして識別されたものだけを取得します。しきい値が十分な場合は、[適用] をクリックします。
14. しきい値を設定した後、ecDNAではないDNAの領域が増えた場合は、トレーニングされた元の画像に戻り、分類器を追加し、手順2.1~2.13を繰り返します。
15. [イメージ |画像調整 |バイナリを作成します。ステップ 2.3 で作成した糸球体 ROI をコピーし、Ctrl + Shift + Eをクリックします。[編集] で Weka ウィンドウをアクティブにする |選択 |復元: 選択範囲を復元します。[パーティクルを解析] をクリックすると、糸球体内の ecDNA パーティクルのみが測定されます。
    注: 結果シートは、パーティクルの数、面積、平均ピクセル、ecDNA を含む糸球体の割合で計算されます。これらの結果は、スプレッドシートにエクスポートして保存し、後で統計分析を行うことができます。
16. デスクトップの ImageJ アプリにオプション メニューから[分類子を保存] をクリックして、分類子を ecDNA.classifier として保存します。次に、オプションメニューから「データを保存」をクリックし、ecDNA.arffとして ImageJ フォルダに保存します。ROIは、糸球体の大きさと形状が変化するので、毎回手動で追加する必要がありますが、プログラムはecDNAが何であるかを学びました。
17. モデルを後続のイメージに再適用するには、新しいイメージを使用して手順 2.1 ~ 2.5 を繰り返します。オプションメニューから「分類器を読み込む」をクリックし、ステップ 2.16 から ImageJ フォルダーのecDNAmodel.classifierをクリックします。ログメニューがポップアップしてモデルが実行されます。
18. モデルを実行したら、オプションメニューのデータのロードをクリックし、ステップ2.16からImageJフォルダに保存されたecDNA.arffファイルを選択します。[結果の作成] をクリックします。結果の画像がすべての核を拾うことができなかった場合、バックグラウンドまたはecDNAは再トレーニング分類子をクリックし、分類子を追加して新しいモデルを保存します。手順 2.9 ~ 2.16 を繰り返して、解析プロセスを完了します。
    注: 複数の画像を使用して、ecDNAの検出に使用する最終的なモデルを生成できます。これは、モデルを後続のイメージに適用し、分類子を追加して、新しいモデルとデータを ImageJ フォルダに保存することで実現されます。これは、異なるサンプルの背景が高い場合に特に重要です。Weka セグメンテーション プログラムは、一部の手順を自動化するために、コマンドの多くをマクロ記録可能にする ImageJ マクロ言語とも互換性があります。

3. 好中球細胞外トラップとecMPOの測定

注:この方法は、細胞外DNA、シトルリンヒストンペプチジルアルギネーゼ4(PAD4)およびMPOの共局在化によってNETを識別する。

1. 抗骨髄ペルオキシダーゼ糸球体腎炎(抗MPO-GN)の20日間モデルを8-10週齢のC57/Bl6マウスで誘導し、コントロール⁹を用いた。
   1. CO2チャンバーを用いてマウスを人道的₂に安楽死させる。
   2. はさみで皮膚を通して前正中線切開を行うことによって腎臓を除去し、その後慎重に腹筋を切断し、解剖板にピンバックします。鉗子を使用して、前腎筋膜と頭頂腹を脇に押し出し、腎盂の尿管および血管(腎動脈および静脈)を切断することによって腎臓を自由に切断する。鉗子で取り出し、サイズ22メスで半分(矢状面)に腎臓を切断します。
   3. 腎臓を固定液(4%緩衝ホルマリン)に室温(RT)で16時間置く。処理前に24時間、固定腎臓を30%エタノールに取り除き、浸します。
2. 標準的な6時間サイクルを使用して腎臓を処理する:
   70%エタノール15分間
   90%エタノール15分間
   100%エタノール15分間
   100%エタノール20分間
   25分間のエタノール100%
   30分間のエタノール100%
   キシレン 20分間
   キシレン 30分間
   キシレン 40分間
   ワックス 30分間
   ワックス 35分
   ワックス 40分間
   注:腎臓は、目的の抗原を破壊する可能性がありますので、ワックスの熱に長時間暴露しないでください。
3. マイクロトーム上で3μmのセクションをカットし、プラス電荷でコーティングされた市販のガラス顕微鏡スライドに取り付けます。一晩乾燥させる
4. スライドラックにガラススライドを60°Cのオーブンに入れ、60分間置きます。
   注: ステップ 3.3-3.4 は、抗原検索ステップ中にセクションが浮かび上がらないようにするために重要です。
5. スライドを2回の溶剤(キシレンまたは代替品)にそれぞれ40分間、ヒュームフードに浸します。
6. 100%エタノール中のリハイドレートスライド、100%エタノール、70%エタノールをそれぞれ5分間用いた。
7. 水道水で5分間洗います。
8. ホットプレートをフュームフードに入れ、圧力鍋にプリボイルド抗原検索溶液(10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0)を入れます。抗原の検索溶液が沸騰し始めるとすぐにトングのペアを使用して、ポットにスライドを水平に置き、蓋をロックします。高い(15 psiまたは103 kPaに相当)で10分間沸騰させます。
   注:このステップは、抗原エピトープ(ホルマリン固定法を介して架橋)を解除して目的の抗原を取り出し、エピトープ抗体特異的結合を可能にし、その後の染色はこのステップなしでは機能しません。
9. 圧力鍋を熱から取り出し、シンクの蓋の上に冷たいタップを実行してすぐに蓋を取り除きます。スライドを離れ、抗原検索液中で20分間平衡させます。
10. リン酸緩衝生理食塩分(PH 7.4,0.01 M)で5分間スライドを軌道シェーカーで2回洗浄します。
11. この時間に組織を乾燥させないように注意して腎臓組織の周りに円を描くために疎水性ペンを使用してください。
12. 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS(pH 7.4,0.01 M)の10%ニワトリセラで30分間、60μLのブロック組織。このステップの後は洗わないが、60 μLピペットを使用してブロッキング溶液を慎重に取り除いてください。セクションを乾燥させないでください。
13. 1チューブで1%BSA/PBS(pH 7.4,0.01 M)に希釈した一次抗体のカクテルを作ります。腎臓切片ごとに60μLを塗布する。一次抗体の濃度は次の通りである。
    ウサギ抗ヒト/マウスH3Cit 1/100
    マウス抗ヒト/マウスPAD4 1/50
    ヤギ抗人間/マウスMPO 1/200
14. 湿度チャンバーで4°Cで一晩インキュベート。
15. 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
16. 2次抗体のカクテルを1チューブで作ります。二次抗体は、次のように1%BSA/PBS、60μLのセクションに適用されます。
    チキンアンチウサギ 488 1/200.
    チキンアンチマウス647 1/200。
    チキンアンチヤギ594 1/200。
17. RTで40分間インキュベートします。
18. 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
19. 2次抗体1:200を1%BSA/PBS(pH 7.4,0.01 M)に1セクションあたりRT 60 μLで40分間塗布します。
20. 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
21. 0.3%スーダンブラックにスライドを70%エタノールに30分間浸します。
22. 水道水でスライドを洗浄して沈殿物を除去し、PBS(pH 7.4,0.01 M)に10分間浸して、さらにスーダンブラック沈殿が形成されるのを防ぎます。
23. DAPIを使用して3つの60 μLの取り付けソリューションを使用して、スライドをコンフォーカルガラスカバーリップにマウントします。カバースリップの周囲に塗布して、カバーリップをマニキュアで密封します。
24. スライドがRTで24時間硬化し(DAPIが浸透するように)、光から保護された4°Cで保存することができます。蛍光プローブの退色を防ぐために暗闇の中に保管してください。
25. 顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査ヘッドを用いて画像スライド。DAPI 用 405 レーザー、H3Cit 用 488 レーザー、MPO 用 561、PAD4 の場合は 647 を使用して、エキサイト スライドします。ecDNAの検出に不可欠なラインシーケンシャルキャプチャと4ライン平均を使用して、単一平面1024x1024ピクセル画像をキャプチャします。40x 1.0 NAのオイルの目的を使用してください。サンプルあたり最低20個の糸球体を画像化します。ND2ファイルとして画像を保存します。

4. 好中球細胞外トラップとecMPO分析

1. イメージJをインストールします: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. [プラグイン] の下で、トレーニング可能な Weka セグメンテーションが利用可能であることを確認する |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.
3. イメージを ImageJ にドロップします。[イメージ |色 |チャネルの分割:青でDAPIが青い色の1つの画像が表示され、H3Citが緑色に、1つの画像が赤でMPO、PAD4が白で1つの画像が表示されます。
   1. 色 |チャネルの結合:ポップアップ ボックスは、各チャネルに色を割り当てるように求めます。各チャネルに色を割り当てた後、[合成の作成] ボックスと [ソース イメージの保持] ボックスにチェックマークを付けて[OK]をクリックします。マージされたイメージが表示されます。以前の ecDNA のプロトコルとは異なり、コンポジット イメージを使用して残りの手順を実行します。
4. 合成画像にガウスブラーを実行します。これは核の滑らかにすることを可能にする。[プロセス] をクリックして 、フィルタ |ガウスブラー、1.00-2.00に入れて。画像は少しぼやけて見えますが、核は滑らかになり、背景は柔らかくなります。
   注: この手順は、ノイズを除去して、関連するイメージ属性の検出を妨げる可能性のあるアーティファクトからイメージをクリーンアップするために事前に作成されています。
5. プラグインをクリックしてください |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.分析対象の画像と Weka セグメンテーション固有のメニューツールを含む全く新しいウィンドウが表示されます。
6. ツールバー(ImageJ)のラインツールを使用して、最初にフリーハンドツールを使用して4つのNETコンポーネント(MPO、PAD4、DAPI、H3Cit)すべてで正の無い無傷の核の周りをトレースし、次にクラス1の追加ボックスに追加します。
7. ImageJ ツール バーのライン ツールを使用すると、バックグラウンドの領域が[クラス 2]ボックスに表示されます。
8. ラベルメニューの「新規クラスを作成」ボタンのラベルをクリックし、「NETs」というラベルを付けます。ライン ツールを使用して、共局化 DAPI (青)、MPO (赤)、PAD4 (白)、およびシトルリン化ヒストン (緑) として識別される NETS を示します。
9. ラベルメニューの「新規クラスを作成」ボタンのラベルをクリックし、「ecMPO」というラベルを付けます。ライン ツールを使用して、セルフリーの MPO (赤) を示します。
10. トレーニング可能な Weka セグメンテーション ウィンドウのトレーニング メニューの [トレーニング分類器] ボタンをクリックします。
    注意:[STOP]ボタンは[列車の分類器]ボタンの代わりに表示され、トレーニングが終了するまで残ります。トレーニング中にこのボタンをクリックしないでください、プロセスが中断されます。
11. トレーニングメニューの[結果を作成]ボタンをクリックすると、すべての分類されたコンポーネント(無傷の核、背景、ecMPOとして識別されたもの)で画像が作成されます。
12. トレーニングメニューの[確率を取得]ボタンをクリックします。マウスを切り替えて、選択オブジェクトを白で強調表示して、すべてのクラスの白黒画像を表示します。
13. 画像をクリックして、NET確率とecMPO確率画像の両方を複製する |複製.
14. NET を含むマウス ボタンを使用して画面に切り替えます。特定された NET の強調表示のみを確認するには、しきい値を適用します。ImageJ メニューツールバーで、画像|調整 |しきい値:スライド式トグルバーを移動して、NET コンポーネントがハイライト表示されるまで移動します。しきい値が満たされたら、[適用] をクリックします。ecMPO についても同じ手順を繰り返します。
15. しきい値を設定した後も ecMPO または NET の検出領域がある場合は、トレーニング済みの元のイメージに戻り、分類子を追加して手順 4.1 ~ 4.14 を再適用します。
16. [イメージ |画像調整 |バイナリを作成します。ステップ 4.3 で作成した糸球体 ROI をコピーし、Ctrl+ Shift + Eをクリックします。編集で Weka ウィンドウをアクティブにする |選択 |復元: 選択範囲を復元します。[パーティクルを解析]をクリックして、糸球体内の NET パーティクルのみを測定します。
17. ecMPO を含むマウスボタンを使用して画面に切り替えます。指定された ecMPO のみが取得されるようにしきい値を適用します。しきい値が満たされたら、[適用] をクリックします。上記のステップ 4.16 を繰り返します。
    注: 結果シートは、粒子の数、面積、平均ピクセル、および NET と ecMPO の両方を含む糸球体の割合で計算されます。これらの結果は、スプレッドシートに入れて保存し、後で統計分析を行うことができます。
18. オプションメニューから「分類子を保存」をクリックし、デスクトップ上の ImageJ アプリケーション (ImageJ フォルダー) にファイルを保存して、分類子を NETs.classifier として保存します。次に、オプションメニューから「データを保存」をクリックし、NETs.arffファイルとして保存します。糸球体ROIは、糸球体の大きさと形状が変化するので、毎回手動で追加する必要がありますが、プログラムはNETとecMPOの両方が何であるかを学びました。
19. モデルを後続のイメージに再適用するには、新しいイメージを使用して手順 4.1 ~ 4.5 を繰り返します。オプション メニューから[分類子を読み込み]をクリックします。ImageJ フォルダでNets.classifierをクリックします。モデルが実行されると、モデルがポップアップして実行され、モデルが起動し、オプションメニューのデータのロードをクリックしてNETs.arffファイルを選択します。
    1. [結果の作成] をクリックします。結果の画像がすべての核を拾うことができなかった場合、バックグラウンドまたはecDNAは再トレーニング分類子をクリックし、分類子を追加して新しいモデルを保存します。手順 4.11 ~ 4.19 を繰り返して、解析プロセスを完了します。
       注: ecDNA、ecMPO、および NET の検出に使用される最終的なモデルを生成するために、いくつかの画像を使用できます。これは、モデルを後続のイメージに適用し、分類子を追加して、新しいモデルとデータを ImageJ フォルダに保存することで実現されます。これは、異なるサンプルの背景が高い場合に特に重要です。Weka セグメンテーション プログラムは、多くのコマンドをマクロ記録可能にして一部の手順を自動化できる ImageJ マクロ言語と互換性があります。

Results

これらの画像は、誘導抗MPO GNを有するマウスから蛍光染色されたFFPE腎臓組織におけるecDNAの労力集約的な手動測定を最小限に抑えるために、トレーニング可能なWekaセグメンテーションを正常に使用するために必要な複数のステップを表しています。これらの手順は、図1と図 2に、Weka セグメンテーション プログラムから直接撮影された画像と共に、分析プロセスのすべてのステップを概説したものです。この分析からの測定値は、プログラムが糸球体に堆積する異なる量のecDNAを、対照組織において、誘導抗MPO GNなしで決定する能力を示す図3に示される。図4は、ecDNAのモデルが、コントロール患者(最小変化疾患患者は組織学的レベルで明らかな最小限の糸球体損傷を有する)から腎臓生検検中のecDNAを同定するために適応し、MPO-AAV患者からの...

Discussion

糸球体腎炎の患者およびマウスモデルの血清および尿中の炎症促進マーカーを測定する複数のプロトコルが存在する。この記述されたプロトコルは糸球体の中の細胞死の産物(ecDNA、NETおよびecMPO)を直接分析することを可能にする。このプロトコルの最も重要なステップは、組織の準備とイメージングです。蛍光染色法を用いて分析する主な制限要素は、組織自家蛍光です。ホルマリン固定パラフィン組織は、特定の蛍光染色を覆い隠すことができる自己蛍光の対象となります。スライドがスーダンブラックに浸漬される染色法の最終工程では、組織の自己蛍光を減衰させ、信号対雑音比¹⁹の低減を通じて抗体特異的染色の照明を可能にする。この組織のイメージングは、ecDNAおよびMPOの小さな断片を検出できるように、少なくとも40倍の油倍率で行う必要があります。イメージングを取得する場合、あるマーカーから別のマーカーへの蛍光の出血を防ぐために、連続したラインで行うことは重要です。

分析用のプロトコルの利点は、誰でも¹⁶にアクセスするた...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ウシ血清アルブミン	SIGMA	A2153	5%および1%溶液はPBSで作られており、バルクで作成でき、解凍後に冷凍廃棄することができます。
チキン抗ヤギIgG(H+L)交差吸収抗体 Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	抗体カクテル中の遊離コンジュゲートを避けるために、使用前にミニ遠心分離機で1分間スピン
チキン抗マウスIgG(H+L)交差吸収抗体、Alex Fluor 647	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-121468	抗体カクテル中の遊離コンジュゲートを避けるために、使用前にミニ遠心分離機で1分間スピン
チキン抗ウサギIgG(H + L)交差吸収抗体アレクサフルーア488	モフィッシャーサイエンティフィック	A-21441	抗体カクテルの遊離コンジュゲートを避けるために、使用前にミニ遠心分離機で1分間スピン
チキンセラ	グマ	C5405	1%BSA/PBS
カバースリップ24 x60 mm	アゼルサイエンティフィック	ES0107222	#1.5 これは標準的な厚さではありません-共焦点顕微鏡
で使用するように設計されていますEDTA 10mM	SIGMA	E6758	TRISとEDTAを蒸留水とpHで一緒に添加し、抗原賦活化のために、10倍溶液
エタノール30%、70%、100%	Chem Supply	UN1170	供給 100%非変性エタノール-蒸留水
ホルムアルデヒド、4%(10%中性緩衝ホルマリン)	TRAJAN	NBF-500	を使用して30%および70%に希釈腎臓はRTで16時間ホルマリンの3mlを含む5mlのチューブに入れられます、ホルマリンはヒュームフードで使用する必要があります
ガラス組織学スライド-ウルトラスーパーフロスト、メンゼルグレーズ、25x75 x1.0mm	TRAJAN	J3800AM4	正に帯電したコーティングされたスライドを使用することが不可欠です。抗原賦活化ステップ中に組織がスライドから離れるため、スライドのコーティングにポリ-L-リジンを使用することはお勧めしません
ヤギ抗ヒト/マウスMPO抗体	R&D	AF3667	到着時にマイナス80度でアリコートと凍結
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	200mlの染色ラック容器できちんと使用し、ヒュームフードで使用
疎水性ペン	VECTOR Labs	H-400	腎臓組織の周りに円を描くために使用
マウス抗ヒト/マウスペプチジルアルギナーゼ4(PAD4)	ABCAM	ab128086	到着時にマイナス80度でアリコートと凍結
ニコン C1 共焦点走査型レーザーヘッド ニコン Ti-E 倒立顕微鏡	コヒーレント サイエン		アリコートし、到着時にマイナス 80 度で凍結
リン酸塩緩衝生理食塩水	SIGMA	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl 一度に 5L をメイクアップ
圧力鍋 6L ティファール 5 ネオ ステンレス	ティファー	GSA-P2530738	地元の家庭用品店
Prolong Gold DAPI	で購入ライフテクノロジー	ズ P36962	カバースリップに直接滴を塗布
ウサギ抗ヒト/マウス ベータアクチン抗体	ABCAM	ab8227	到着時にマイナス80度で凍結
ウサギ抗ヒト/マウス H3Cit 抗体	ABCAM	ab5103	到着時にマイナス80度で凍結
染色ラック 24スライド	ProScitech	H4465	選択された染色ラックは、圧力下での沸騰と60度オーブンでのインキュベーションに耐えることができなければなりません
スーダンブラックB	シグマ	199664	0.3% 70%エタノールで1Lボトルに3gを追加し、ろ過し、室温で6ヶ月間光安定
トリス10mM	SIGMA	T4661	蒸留水とpHでTRISとEDTAを一緒に加え、pHを9に設定します。 抗原賦活化のために、10倍溶液で作ることができます
キシレン	トラヤヌ	XL005/20	ヒュームフードで使用する必要があります