記載されているのは、卵を数え、24個の井戸組織培養プレートを使用して個々の蚊の孵化率を決定する時間と省スペースの方法であり、これは胎児性および生殖能力アッセイの規模と速度を大幅に増加させることができる。
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方法論記事
24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善
この記事について
サマリー
要約
蚊は、様々な病原体のベクターとして重大な公衆衛生上の問題を表しています。蚊のフィットネスパラメータ、特に個々のレベルでの卵の生産と孵化率の評価を必要とするこれらの研究のために、従来の方法は、高い労働強度と実験室スペース要件のために調査官に大きな負担をかけている。説明は、各ウェルにアガロースを有する24ウェル組織培養プレート及び各ウェルのデジタルイメージングを用いた簡単な方法であり、時間と空間の要件を大幅に削減した個々のレベルで卵数およびハッチ率を決定する。
概要
ベクター媒介病原体からヒトを保護するための蚊の防除は、主に蚊によって運ばれるほとんどの病原体に対する効果的なワクチンの欠如のために、重要な公衆衛生目標である。多くの研究は、フィールドに適用可能な人口減少戦略1、2、3と組み合わせて蚊のフィットネスを減らすことを目指しています。これには、トランスジェニック蚊および/またはCRISPR / Cas9ノックアウトラインを作成するための広範な研究が含まれます。このような人口改変アプローチは、個々のフィットネスパラメータ4の詳細な評価を必要とする。雌の蚊の適性を評価するための従来の実験室技術は、100 mL容器内の交配された血液を与えられた雌の蚊の個々の封じ込めを含む5、50mL円錐管を改変、または浸出のための湿った綿およびフィルターペーパーディスクを使用して湿った表面を提供することによって変性されるショウジョウバエ飼育のためのチューブ(すなわち、卵紙)1、2、6、7。このような方法は、比較的大きな空間(例えば、30cm x 30cm x 10cm:最大100ショウジョウバエチューブのW x Lx H)と、卵を数え、幼虫を孵化させる個々の卵紙の操作を必要とし、労働集約的であり得る。この原稿は、蚊の卵を数え、これらの問題を回避するために卵位表面として24のウェルプレートとアガロースを使用してハッチ率を決定する方法を提示します 8.
同時に、イオシノら9 は、個々の雌から得られた卵の計数を行うために12および24のウェルプレートを用いた詳細な方法を説明した。彼らのプロトコルは、時間と空間9を節約する従来の方法から大幅な改善を表した。しかし、彼らが説明したプロトコルは、卵がしばしば下または折り畳みで見つかるので、カウントを得るために個々の紙を展開する必要がある排卵の表面としてウェットフィルターペーパーを使用し続けています。彼らのプロトコルには、イメージング技術の使用や幼虫計数の方法も含まれなかった。
提示された、卵の数(すなわち、胎児性)および孵化率(すなわち、生殖能力)をAe.aegyptiの24ウェル組織培養プレートフォーマットでオビジポジション表面として使用する、適合性アッセイを行う改良された方法である。これらのプレートは、Egg、アガローズ、およびLアルバから「EAgaL」プレートと名付けられました。 これらの24のウェルプレートは、卵を産むために最小限の表面を個々の蚊に提供し、卵と孵化した幼虫を数日間数え、維持するために必要な時間と労力を簡素化し、大幅に削減します。EAgaLプレートは、卵の紙を扱い、孵化したときに卵と幼虫を見つける必要がなくなる卵の表面に半透明のアガロースを使用しています。各井戸を撮影すると、結果の長期アーカイブ記録が確立され、時間と空間の両方でカウントプロセスが、時間が限られているリアリング/ハンドリングプロセスから分離されます。
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プロトコル
1. プレートの準備
- 〜1.6 mm (1/16 in) ビットの家庭用ドリルを使用して、24ウェル組織培養プレートリッド(ウェルあたり4-6穴)に穴を開けます(図2)。
注:これらの穴は、蚊が卵を産む可能性のある蓋に蓄積するアガロースからの水凝縮を防ぎます。女性 Ae.aegypti(「 リバプール」株)の標準サイズは〜3.11ミリメートルの翼幅です。プレートからの脱出を避けるために小さな蚊を使用する場合は、穴のサイズを小さくすることをお勧めします。 - 排卵実験の前日には、プレートを十分に洗って洗い流し、室温で30〜60分間1〜5%の漂白剤に浸します。流水を流し、乾燥させて徹底的に洗い流します。
注:このプロセスは、真菌や細菌がアガロースに成長する可能性を減らします。 - 脱イオン水中で2%でアガロースを溶かし、1,000 μLピペットを使用して24ウェルプレートの各ウェルに500μLの溶融アガロースをすぐに加えます(図3A、B)。アガロースがピペットチップを冷却して詰まらせ始めると、アガロースを再加熱し、新しいピペットチップを使用します。
注:それは女性が卵を産む可能性がある壁にアガロースの一部を残す可能性があるため、ピペット先端で井戸の壁に触れないようにし、イメージングとカウントプロセスを複雑にします。 - 使用前に、ラボベンチで一晩井戸壁の結露を乾かします(図3C、D)。
注:血液供給から幼虫イメージングまでのEAgaLプレートアッセイのタイムラインは、 図4に示されていますが、これはコロニー蚊(Ae.aegypti "Liverpool"は14時間光:10時間の暗い光サイクル、27°C、相対湿度80%、49.5cm x 9.cmyのトレイで500幼虫)を含む2秒の条件下で示されています。各実験室は、特に異なる株、異なる蚊種、ならびに異なる飼育プロトコルを使用する場合に、使用されている蚊とEAgaLプレートをテストすることをお勧めします。
2. 蚊の餌付け
注:幼虫栄養は蚊のフィットネスパラメータ10、11に影響を与えるので、すべての治療群と対照群に均一な条件で飼育された蚊を使用することが重要です。十分な食糧を伴う混雑していない状態での後部幼虫。雌の蚊は、交配が確保されるようにオスの存在下で閉じ、少なくとも3日間成熟させる。
- 授乳を強化するために、授乳の少なくとも16時間前に雌の蚊から水や砂糖の供給源を取り除きます。
- 37 °Cで人工給餌用の水サーキュレーターを加熱し、15〜30分間人工フィーダーに入れた脊椎動物の血液を使用して雌の蚊に餌を与える(図5A)。
- 蚊をCO2 または氷上で麻酔し、氷の上のガラス皿に移し、血液を含むもの(図5B)を、メスが排泄と卵の発達を終えると72時間以上30%のスクロース水を備えた容器に選びます。
注:メスにスクロース水の濃度が低い場合は、48時間後にスクロース水と濡れた表面を取り除き、メスが排卵するのを防ぎます。
3. オビポジション
- プレートに蚊を移す約1時間前に、移管ピペットを使用して各プレートウェルに2〜3滴(約80〜120μL)の水を加えます。
- 血液を摂食した後、少なくとも72時間、CO2または氷上で蚊をノックダウンし、氷の上のガラス皿に移し、氷の上の24ウェルプレートの逆蓋に各蚊を個別に置く(図6A)。
注意:この手順は、イオシノら9から適用されています。 - 24個の蚊をすべて取り付けたら、蓋を反転プレート底部(図6B)で覆い、蓋とプレートを新鮮な新しいゴムバンドで固定し、環境室(または飼育室)に置き(図6C)、蚊が回復するまで(〜10〜15分)、プレートを右に上げる(図6D)。
- メスの蚊に24-48時間のオビポジットを許可し、大きなケージにプレートからそれらを解放することによってメスを取り除きます。
注:個々のメスを追跡することが重要な場合は、プレートを冷やして麻酔をして氷の上で個別に取り除きます。女性が72時間のポスト血液食(PBM)より早くプレートに移された時、卵の数を妨げる遅発卵および暗い排泄物が観察された(図7D)。
4. 卵のカウント
- 時には蚊が井戸の壁やアガロース/プラスチック表面の余白に卵を産むので、24の井戸プレートの各井戸をチェックしてください。濡れたペンキのブラシを使って、アガロースの壁と縁に産んだ卵をアガロースの平らな表面に移動させ、すべての卵が均一な平面にあり、互いに重ならないようにします。
注:アガロースのエッジは、アガロース溶液の表面張力のために、通常、カメラの焦点面から外れです。 - 鉗子を使用して、卵のイメージングを妨げる可能性のある井戸の壊れた脚、翼、および他の粒子を取り除く(図7C)。
- プレートの下に白い紙を挿入して、立体顕微鏡のイルミエーターを用いてイメージングする前に、暗い蚊の卵とのコントラストを高める(図7A)。
- 顕微鏡モードでコンパクトなデジタルカメラを使用して各井戸の画像を撮り、ユーザーは1cm近くの物体に焦点を当てることができます。この機能により、カメラをプレート上に直接配置して、三脚やスタンドを使用せずに卵をイメージすることができます(図7A)。塊に産卵した卵を区別するには、細かいモードまたは超微細モードを使用して高解像度の画像をキャプチャし、クローズアップの詳細を見ることができます。
メモ:新旧画像の混乱を防ぐために、使用前にカメラのメモリカードをクリアしてください。 - プレートの各ウェルを撮影した後、後で各プレートを区別するために、撮像順ラベルを付けてプレート全体の画像を撮る(図7E)。
- 各ウェルに移管ピペットを入れた薄い層~5滴(約200μL)を加えて、アガロースプラグと卵が乾燥するのを防ぎ、胚の発生と孵化を誘発します。アガロースや蒸発による吸収による水分損失が発生する可能性があるため、最初の数時間は水位に注意を払い、毎日チェックしてください。幼虫が孵化するには水が低すぎる場合は水を加えます。
注:水の蒸発は、プレート内とプレートの積み重ね内の両方で不均一に発生します。乾燥は次の順序で起こることが観察されている:1)コーナーウェル(A1、A6、D1、D6)は最も速く乾燥する。プレートの外側の端に2)ウェル(A2-A5、B1、B6、C1、C6、D2-D5)が続きます。そして最後の3)内部の井戸。プレートが積み重なるとき、上板は最も速く乾燥する。 - イメージを ImageJ (フィジー) のコンピューターに転送し、ファイルの名前を変更して "[plate ID]_[well ID] .jpg(図 8A、B) などの組織を容易にします。
- 卵子の数(すなわち、胎児性)と幼虫の数を記録し、ハッチレート(すなわち、生殖能力)を計算するスプレッドシートファイルを作成する(図9E)。
- ImageJ (フィジー)12 で画像を開き、"マルチポイント" ツールを使用して各卵をマークします (図 9A-C)。"+" または "–" キーを使用して拡大または縮小して、束の中の卵を数えます。すべての卵をマークした後、 マルチポイントアイコン をダブルクリックしてマークの数を表示します(図9D)。結果をスプレッドシートに記録します。
5. 出生率評価
注:2日後に、最初のインスター幼虫が井戸の中で閉じ始めるかもしれません。すべての実行可能な卵が孵化することを確認するために、イメージング/カウントの前に3〜5日待ちます。
- 20mLの水に大さじ1/16(約168mg)の地魚類(すなわち、通常の蚊の幼虫食)を水に混ぜ、大きな固形物が沈着するのを待つことで幼虫の食物を準備する(図10A-D)。孵化した幼虫を含む井戸に食べ物(上清)を加え始める。
注:食品粒子の過剰添加は、孵化した幼虫のイメージングとカウントを妨げる可能性があります。 - 井戸に水を加えてから約5~8日後、砕いた氷で15~20分間覆い、幼虫を麻酔してプレートを冷却します。
- 卵と同じように氷の上にプレートを保ちながら、各井戸の画像を撮ります。幼虫画像の場合は、コントラストを高めるためにプレートの下に黒い材料を挿入して、暗い背景を提供します。プレートの各ウェルを撮影した後、後で各プレートを区別するために、撮像順ラベルを付けてプレート全体の画像を撮ります。
注:幼虫の動きがカウントを損なう可能性があるため、プレートが氷の上にある間に画像が撮影されます。プレートは再利用可能です。次の使用のためにきれいにするために蚊やアガロースを凍結し、除去します。EAgaLプレートは、幼虫を高度な段階に飼育するのに適していません。 - ImageJ (フィジー) で画像を開き、各幼虫をクリックしてカウントする "マルチポイント" ツールを使用します。3-5日間、特に幼虫の数が少ない井戸では、一部の幼虫が溶かされた可能性があります。したがって、カウントする際には、少し体を持つ頭のみの幼虫のように見える小屋のキューティクル(すなわち、滲出物)、または縮んだ幼虫を除外する(図10E)。結果をスプレッドシートに記録します。
6. 解析の実行
- 胎児性および生殖能力分析のために必要なデータをすべて収集し、適切な統計分析を行い、好ましいソフトウェアを用いてグラフを作成する。
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結果
蚊は、候補鉄輸送体(FeT)または対照遺伝子(EGFP)を標的とするdsRNAを注射し、血液を供給し、EAgaLプレート法を用いて胎児性および生殖能力出力について測定し、上記の手順に従った。
dsRNA注射後にFeT発現が沈黙した蚊は、卵数と孵化率の両方に有意な減少を示した(図11A−C)。すべての制御および治療蚊は、72時間PBM後にEAgaLプレートに入れられた。FeTの沈黙した蚊はまた、遅い排泄および小さくて明るい色の卵を示した(図12A、B)。例の結果は辻本ら8.にも見られる。
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ディスカッション
EAgaLプレートは、FT法と比較して Aedes aegypti で個々の胎児性および生殖能力アッセイを行う労力、時間、および空間を大幅に削減します。FT法とEAgaLプレートとの間の予備比較は、すべてのステップに対して短い時間をもたらした(撮像技術はFT法に適用された)(表1)。参考として、起動およびアッセイ当たりの推定値(1つの24ウェルEAgaLプレート対24 FT)コストを 表2に示します。
EAgaLプレートを使用する場合、考慮すべき点がいくつかあります。最初の懸念は、このような小さな空間に置かれた蚊は、限られた動きのためにすべての卵を産むわけではないということです。これが当てはまるかどうかを判断するために、蚊はEAgaLプレートで48時間を過ごした後、さらに48時間水でペーパータオルが並んだオビポジションカップを備えた大きなケージにまとめて移されました。蚊は確かに追加の卵を産んだが、女性1人当たりの卵の平均数はわずか2.1であり、ほとんどの場合、すべてではないにして...
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開示事項
著者らは、この研究に対する利益相反を宣言していない。
謝辞
私たちは、テキサスA&Mアグリライフ研究昆虫ベクター病助成プログラムに資金を提供してくれたことに感謝します。また、この方法の開発に役立ち、原稿を作成する際の提案に関するAdelmanラボのメンバー、およびケビン・マイルズのラボメンバーに感謝します。また、この原稿をより良くするために、レビュアーや編集者の助けに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.6 mm Φ ドリルビット | は、釘を交互に加熱 | ||
| 1000 μLピペットチップ(長) | オリンパスのプラスチック | 24-165RL | |
| 24ウェル組織培養プレート | サーモサイエンティフィック | 930186 | 透明、平底、リング状の蓋プレート |
| アガロース | VWR | 0710-500G | |
| コンパクトデジタルカメラ | オリンパス | TG-5/TG-6 | |
| コンピューター (Windows、Mac、Linux) | |||
| 脱イオン水 | |||
| フィジー(imageJ)ソフトウェア | のダウンロードから:https://fiji.sc/ | ||
| 鉗子 | デュモン | 鋭い鉗子は、蚊の体を壊す可能性があります | |
| ガラスペトリ皿 | VWR | ||
| 家庭用漂白剤 | |||
| 家庭用電気ドリル | |||
| イルミネーター実体顕微鏡(グースネック) | |||
| P-1000ピペット | ギルソン | ||
| ペイントブラシ | |||
| デジタルカメラの画像を記録するための | |||
| 表計算ソフト(Microsoft Excel) | マイクロソフト | どんな表計算ソフトでも動作します | |
| TetraMin魚の食品 | グラインダー、ブレンダーまたはモルタル&乳棒で挽いた | トラ | |
| ペット転送ピペット |
参考文献
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