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方法論記事

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

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DOI:

10.3791/61242

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2020年6月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex vivo視覚化である。キャストされた組織の潜在的な用途についても議論される。

要約

血管は、3次元空間で複雑なネットワークを形成します。その結果、血管ネットワークが組織の表面を観察することによってどのように相互作用し、動作するかを視覚的に理解することは困難である。この方法は、肺の複雑な3次元血管アーキテクチャを可視化する手段を提供する。

これを達成するために、カテーテルが肺動脈に挿入され、脈管構造が同時に血液を洗い流され、化学的に拡張されて抵抗を制限する。肺は、標準的な圧力で気管を通して膨張し、ポリマー化合物は、標準的な流量で血管床に注入されます。動脈ネットワーク全体が満たされて治癒することが許されると、肺血管構造を直接可視化するか、マイクロCT(μCT)スキャナで画像化することができます。

正常に行われると、出生後の早期から成人までのマウスの肺動脈ネットワークを理解することができる。さらに、肺動脈床で実証されている間、この方法は、最適化されたカテーテルの配置およびエンドポイントを有する任意の血管床に適用することができる。

概要

この技術の焦点は、マウスにおけるポリマー系化合物を用いた肺動脈アーキテクチャの可視化である。脳、心臓、腎臓,,11、2、3、4、5などの全身血管床に関する広範な作業が行われてきたが、肺動脈ネットワークの準備および充填に関する情報は少ない。,2,345したがって、この研究の目的は、前の研究66、7、87,8に拡大し、調査官が肺動脈樹の高解像度画像を生成するために簡単に従うことができる詳細な書面および視覚的な参照を提供することである。

磁気共鳴画像、心エコー検査、CT血管造影,9、10など、肺血管構造の標識やイメージングには数多くの方法がありますが、これらのモダ9リティの多くは小さな血管を十分に充填および/または捕獲できず、研究できる範囲を制限しています。シリアル断面化や再構築などの方法は、高解像度を提供しますが、時間/労働集約型の11、12、13です。,12,13従来の腐食鋳造,,10、13、14、15、16で、軟部組織の完全性を取り巻く妥協がある。10,13,141516動物の年齢や大きさでさえ、カテーテルを導入しようとするときに、または、解像度が欠けている要因になります。一方、ポリマー注入技術は、動脈を毛細管レベルまで満たし、μCTと組み合わせると、比類ない分解能5を可能にする。出生後14日目の若いマウス肺からのサンプルは、8に正常にキャストされ、数時間で処理されました。これらは、無期限に再スキャンすることも、既存の軟組織17を損なうことなく組織学的準備/電子顕微鏡(EM)のために送ることさえできる。この方法の主な制限は、CT機器/ソフトウェアの先行コスト、血管内圧を正確に監視する課題、および同じ動物の中で縦方向にデータを取得できないことです。

この論文は、肺動脈注射技術をさらに最適化し、年齢/サイズ関連の境界を出生後1日目(P1)に押し下げて顕著な結果を生み出す既存の作業に基づいています。動脈血管ネットワークを研究したいチームにとって最も有用です。したがって、カテーテルの配置/安定化、フィルレート/ボリュームの制御の強化、鋳造成功の増加に対する注目すべき落とし穴のハイライトに関する新しいガイダンスを提供します。その結果、結果のキャストを将来の特性評価と形態解析に使用できます。おそらくもっと重要なのは、これは私たちの知る限りでは、この複雑な手順をユーザーに説明する最初の視覚的なデモンストレーションです。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、国立心臓肺血液研究所の施設動物のケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています。

1. 準備

  1. ヘパリン(1単位/gマウス体重)で腹腔内にマウスを注入し、2分間アンブレートさせます。
  2. CO2チャンバーで動物を安2楽死させる。
  3. 外科用基板の上の上の上の上の位置にマウスを配置し、テープでボードにすべての4つの手足を固定します。細かい解剖のために倍率を使用してください。

2. 肺と気管の露出

  1. 毛髪の干渉を最小限に抑えるために、マウスの腹側に70%エタノールをスプレーします。
  2. 鉗子で腹部の皮膚をつかみ、臍帯ではさみで小さな切開を行います。腹筋と皮膚の間の筋層にはさみの先端をスライドさせ、2つの層を分離し始めます。腹部、胸部、頸部から皮膚を取り除く、ロストレ的に働く。
  3. 腹部の筋肉をはさみで開き、横隔膜が露出するまで両側を横切って切ります。
  4. xiphoidプロセスを穏やかにつかみ、細い半透明の横隔膜を通して尾頭肺の視界を最大限に引き上げます。xiphoidプロセスのすぐ下にある横隔膜に小さな切開を慎重に行います。肺は崩壊し、横隔膜から引き離されます。胸部から隔膜を解剖し、肺のパレンチマをニックしないように注意する。
  5. 下の大静脈(IVC)と食道を見つけて切断し、横隔膜を通過します。ガーゼを使用して胸腔内の任意のプール血液をクリーンアップします, 肺との接触を避けます.
  6. もう一度xiphoidをつかみ、穏やかに持ち上げます。肺との接触を避けて、胸部を両側(大体中軸線)で切る。前胸部を完全に取り除き、骨膜の直前に胸骨の角度に沿って最終的なカットを行います。
  7. プリフィルドシリンジを使用して、乾燥を防ぐためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で肺を自由に濡らします。この手順を通してこのルーチンを続けます。
  8. 鉗子を使用して、マニュブリウムをつかみ、体からそっと離れて上昇します。はさみを使用して、マニュバーに1〜2mmの横をカットし、鎖骨を切断し、除去します。これは、下の胸腺を露出します。
  9. 胸腺のローブを一つずつ持ち、引き離して取り除きます。顎下腺でこの手順を繰り返します。最後に、気管を重ねている筋肉組織を取り除きます。
    注:解剖の後、心臓、上り大動脈(AA)、肺動脈幹(PAT)、および気管が見える必要があります。幹の初動脈枝が分かれて傷ついていないことを確認します。

3. PAカテーテル法および血液灌流

  1. ユニット1を組み立てるには、30G針のハブにPE-10チューブの糸15cmを組み立て、PBSで10-4 Mナトリウムニトロトルシド(SNP)をあらかじめ充填した1mLシリンジに取り付けます。このユニットからすべての空気がパージされるまでプランジャを進めてチューブをプライムする(図1)。
    注意:SNPは飲み込むと有毒です。皮膚や目との接触を避けてください。取扱い後、肌をよく洗ってください。適切な個人用保護具を着用してください。
    1. または、ユニット2を組み立てます。7日目(P7)以下のマウスの場合、止止めを使用してハブから追加の30G針を取り外し、針をユニット1のチューブの開いた端に通す(図1)。
  2. 針の代わりに、曲面の鋭い鉗子を使用して、長さ10cmのシルクの一方の端をつかみます。一方の側から入り込む心臓の頂点を貫通し、筋を通して、もう一方の側の外に鉗子の先端を渡す。別の鉗子でシルクをつかみ、約2cmの長さを引っ張って結びます。縫合糸の残りの8cmの端を取り、心臓を引っ張り、外科用ボードに最後をテープで留めます。
    注:これは緊張を作成し、さらに大きな血管を露出させ、心臓を所定の位置にテザリングし、肺動脈内のカテーテルの配置を容易にします。
  3. AAとPATの両方の下で湾曲した鉗子の先端をフックし、開口部を通して7-0シルクの3cmの長さを引き戻し、シングルスローの緩い縫合糸を作成します。
  4. はさみを使用すると、心臓の頂点に向かって1〜2mmの切開を行い、薄壁の右心室(RV)を貫通し、カテーテル(Unit 1)の挿入を可能にする。挿入する前に、システムに空気がないことを確認してください。プライミングチューブを右心室に導入し、半透明の薄壁PATにそっと進めます。
    1. カテーテルが左または右の肺分岐に進んでいないこと、および肺動脈分岐点に隣接していないことを視覚的に確認する。テープを使用して、チューブの遠位部分を外科用基板に固定します。
      注:RVを識別するには、フォースを使用して心臓の右側をつまむ。左心室とは異なり、RVの比較的薄い自由な壁は容易に把握されるべきである。
    2. P7より若いマウスの場合は、ユニット2をマイクロマニピュレーターに取り付け、マニピュレータを使用して上記のようにユニットの針端をPATに導入します。
  5. 両方の大きな容器の周りの緩い縫合糸を静かに締め、ステップ3.2で作成された縫合糸の8cmの長さをカットして、心臓を自然な休息位置に戻します。カテーテルは今しっかりとPAT内で固定されています。
  6. 心臓の左耳の大音をクリップして、パーフューズがシステムを終了できるようにします。
  7. シリンジポンプ内のSNP含有シリンジ(ユニット1またはユニット2、サイズ依存)を確保し、0.05 mL/minの速度で溶液を浸透させ、血液を洗い流し、脈管構造を最大限に拡張します。血液/パーフューズは、切り取られた耳介を介して出ます。パーフューズートが透明になるまで灌流を続けます(成虫マウスでは200μL程度、若い動物の場合は少ない)。
    注:低粘度のPBS/SNPを浸透させる場合、時間を節約するために比較的高い注入速度が使用されました。より粘性ポリマー化合物は、過充填、破裂を防止し、遠位端点の制御を最大化するために、より遅い速度で注入されます。

4. 気管切開と肺の膨張

  1. 肺膨張ユニットを構築する(図2)。
    1. 柔軟なプラスチック24G静脈内(IV)カテーテル(針を取り除く)/蝶の注入をストップコックに接続し、開いた50 mLシリンジ(プランジャーなし)に取り付けます。リングスタンドから注射器を掛けます。
    2. 10%緩衝ホルマリンをシリンジに加えます。栓コックを開き、ホルマリンがチューブに入り、システムからすべての空気をパージできるようにします。ストップコックを閉じ、半月板が気管の上に20cmになるまで注射器を上げる8.
      注意:ホルマリンは、引火性、発がん性、急性毒性、皮膚刺激、深刻な眼の損傷、皮膚感作、および生殖細胞変異原性を引き起こす。摂取を避け、皮膚や目と接触します。蒸気や霧の吸入を避けてください。点火の原因から遠ざけてください。適切な個人用保護具を着用してください。
  2. 2~4mm離れたクリコイド軟骨より下の2つの緩い縫合糸を置きます。
  3. はさみを使用して、縫合糸よりも優れたcrico甲状腺靭帯の小さな切開を行います。
  4. IVカテーテルを開口部に挿入し、2つの緩い縫合糸を超えて先端を進めます。
  5. 気管の周りの縫合糸を締め、栓コックを開きます。ホルマリンが重力で肺に入るようにし、肺が完全に膨張するまで5分待ちます。肺がインフレ時に胸部に付着する場合は、鈍い先端の鉗子で胸部の外側をつかみ、葉を解放するのを助けるためにすべての方向に移動する。肺と直接接触しないでください。
  6. 5分後、IVカテーテルを第1縫合糸を越えてリゲートを戻す。2 番目の縫合線についても繰り返します。肺は閉鎖された加圧状態で膨張するようになりました。

5. 血管系を鋳造する

  1. 1.5 mLチューブで、8:1:1溶液8 のポリマー:希釈剤:硬化剤の1 mLを調製し、良好な混合を確実にするために数回穏やかに反転します。
  2. 1 ccのシリンジからプランジャーを取り出し、手袋をした指で反対側の端を覆い、ポリマー化合物をシリンジに注ぎます。慎重にプランジャーを再挿入し、逆にし、すべての空気を除去し、シリンジの先端に半月板を形成するためにプランジャーを進めます。
  3. 針のハブからSNP/PBS注射器を取り出し、追加のPBSをハブに滴下して半月板を作成します。ハブに閉じ込められた空気がないか慎重に確認し、必要に応じて外し、半月板を改革してください。高分子化合物で満たされたシリンジにハブを結合します。
    注:両端に半月板を作成すると、空気がシステムに入る機会が大幅に減少します。
  4. 高分子化合物充填シリンジをシリンジポンプに取り付け、0.02 mL/minで注入します。
    注:小さな肺の場合、遅い速度は過剰充填を防ぐのに役立ちますが、必須ではありません。
  5. PEチューブを自由に下に移動し、PATに入る際にシリンジのボリュームに注意してコンパウンドを監視します。シリンジのボリュームをもう一度確認してください。
    注:数回実行した後、推定ボリュームを使用して、おおよそのエンドポイント(成人マウスの場合は〜35 μL、P1子犬の場合は約5 μL)を測定できます。ポンプが停止した後、システム内の残留圧力は、高分子化合物を肺動脈に押し込み続けます。すべての肺ローブは、同様の速度で満たされるべきです。
  6. 光ファイバークリーニングワイプで肺を覆い、PBSを自由に塗布し、死体を室温で30〜40分間邪魔しないようにします。この期間中、高分子化合物は硬化し、硬化します。
  7. カテーテルを取り外し、マウスの腕/下半分を切断し、ヘッド/胸郭を10%緩衝ホルマリンで満たされた50 mL円錐形に一晩置きます。
  8. 固定後、気管をつかみ、心臓/肺ユニットを残りの肋骨ケージと胸部からそっと分離します。ホルマリン充填シンチレーションバイアルに心臓/肺ブロックを入れる。残りを破棄します。

6. 鋳造用の代替血管床(表1)

注:各ターゲット血管床は、異なるカテーテルの配置、注入速度、および最適な充填時間を必要とすることができます。したがって、複数の動物が複数の臓器をキャストする必要があります。

  1. 横隔膜よりも優れたまたは劣った全身血管床については、上記の手順1.1〜2.5に従ってください。ポータル システムとダイヤフラムに関するその他の注意事項を参照してください (表 1)。
  2. 止血でxiphoidプロセスをつかみ、内部胸部動脈の直前に両側(大体中軸線)で胸部を切断する。
  3. まだ接続されている胸部を動物の首/頭の上に置き、胸腔を完全に露出させるような上に折り畳みます。
  4. 上記のステップ3.1に従い、肺を取り除きます。胸部大orta(TA)が見えたら、その下に湾曲した鉗子の先端を引っ掛け、横隔膜より約10mm優れた。7-0シルクの長さ3cmをつかみ、TAの下の開口部を引き戻し、シングルスローの緩い縫合糸を作成します。ダイヤフラムの上に約8mmこの手順を繰り返します。
  5. 横隔膜より優れた構造の場合、スプリングはさみを使用してTAの腹側部分に小さな穴(全周の30%)を作成し、ステップ6.4に配置された緩い縫合糸に対して〜2mm劣る。
    1. ダイヤフラムより劣る構造の場合は、代わりに、緩い縫合糸よりも優れた小さな穴〜2mmを作成します。
  6. 動物の大きさに応じて、ユニット1または2を容器に導入し、緩い縫合糸を超えて進み、容器を穏やかにリゲートします。
  7. ステップ3.7に従い、1.0 mL/minの速度でシリンジポンプを設定し、最低5 mLを浸透させる。パーフューズはIVC経由で終了します。
  8. 0.05 mL/minに注入速度を調整するステップ5.1-5.4に従い、リアルタイムで標的組織を目視的にモニタリングする。
    注:注入量は、臓器および動物の年齢に固有になります。容積は、非標的血管床(すなわち、脳、肝臓、腎臓、腸)につながる動脈枝を合流させることによってさらに制限することができる。
  9. 5.6に従い、標的組織を取り除き、ホルマリンに入れる。

7. マイクロCT用のサンプルマウント、スキャン、および再構築

  1. パラフィンフィルムを使用して、走査ベッドに平らな表面を作成し、この表面に湿ったサンプルを中心にします(図3A)。
    注: モーションアーティファクトが検出された場合、サンプルはさらに安定化を必要とする場合があります。
  2. 脱水を防ぐために、追加のパラフィンフィルムで軽くテント/カバーサンプル。組織に変形を起こす試料上にパラフィンフィルムを置かないように特別な注意を払ってください(図3B)。
  3. 表 2に示す設定を使用してサンプルをスキャンし、特定の実験内でこれらのパラメーターを標準化します。
    注: これは実験/エンドポイントに依存します。サンプル間の比較を容易にするために、選択したパラメータを標準化します。
  4. 後処理および分析のために再構築されたスキャンを転送します。

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結果

成功したキャストは、肺動脈ネットワーク全体の均一な充填を示します。これは、C57Bl/6Jマウスの年齢に及ぶ:出生後の日P90(図4A)、P30(図4B)、P7(図4C)、およびP1(図4D)でこれを実証する。Figure 4C流量を制御し、リアルタイムで充填を監視することで、最も遠位血管系の信頼性の高いエンドポイントが達成されました(図5A)。

一般的な課題には、肺の損傷、不完全な充填、不足充填、または過剰充填、カテーテルのくさび、動物の大きさなどがあります。

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ディスカッション

適切に実行され、この方法は、げっ歯類モデルの比較と実験を可能にする肺動脈ネットワークの印象的な画像を生成します。いくつかの重要なステップは、成功を保証します。まず、研究者は、肺血管系および心臓のチャンバーに血栓が形成されるのを防ぐために、準備段階で動物をヘパリン化する必要があります。これはポリマー化合物の完全な動脈輸送を可能にする。第二に、横隔膜を穿刺し、胸部を取り除くとき、不注意な損傷、切り傷または損傷から肺を保護するように注意してください。気道の漏れは完全な膨張を防ぎ、不正確なサンプル間の比較をレンダリングします。第三に、頂点で心臓をテザリングはカテーテルの配置を助ける。第4に、SNPのような強い血管拡張剤の使用は、動脈および毛細血管5,5、8の血液の除去および完全な充填の両方を助ける。第五に、カテーテルをPATに入れる際には、先端を分岐に埋めないように注意してください。これにより、流れの不均衡が生じ、ポリマー化合物を左側または右側にシャントし、不均一な圧力勾配を生じる。第六に、シリンジポンプの使用は、ユーザーが速度...

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開示事項

著者は開示するものは何もない

謝辞

この研究は、NHLBIイントラムラル研究プログラム(DIR HL-006247)によって部分的に支援されました。画像の取得と解析に関する指導を受け、NIHマウスイメージング施設に感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1ccシリンジベクトンディキンソン309659
20mlガラスシンチレーションバイアルフィッシャー03-340-25P
30Gニードルベクトンディキンソン305106
50mLコニカルチューブコーニン352098サンプルの保管とスキャン用
60ccシリンジベクトンディキンソン309653
7-0シルク縫合Teleflex103-S
Analyze 12.0 SoftwareAnalyzeDirect Inc.N/Aプライマリーソフトウェア
Amira 6.7 ソフトウェアThermo ScientificN/AAlternative Sofware
CeramaCut はさみ 9cmファインサイエンスツール14958-09
セラミックコーティング湾曲鉗子ファインサイエンスツール11272-50
CO2タンクロバートの酸素株式会社n/a
デュアル シリンジ ポンプコール パーマーEW-74900-10
デュモン ミニ鉗子ファイン サイエンス ツール11200-14
エタノールPharmco111000200
ホルマリンシグマ - ライフ サイエンスHT501128
ガーゼCovidien441215
Hemostatファイン サイエンス ツール13013-14
ヘパリン (1000USP Units/ml)HospiraNDC 0409-2720-01
Horos SoftwareHoros ProjectN/AAlternative Sofware
Induction chambern/a/a
KimwipeFisher 06-666光ファイバークリーニングワイプ
ラベリングテープFisher15966
マグネティックベース KanetecN/A
マイクロCT装置パーキンエルマークォンタムGX
マイクロフィル(ポリマーコンパウンド)Flowech Inc.キットB - MV-1228オンスのMVコンパウンド; 8オンスの希釈剤;MV硬化剤
マイクロマニピュレーターStoelting56131
Monoject 1/2 mlインスリン注射器Covidien1188528012
八角形鉗子ストレート歯サイエンスツール11042-08
ParafilmBemis company, Inc.
PE-10 チューブInstechBTPE-10
Phospahte buffered SalineBioRad#161-0780
リングスタンドFisherS13747高さ 24in.
ナトリウム ニトロプルスサイドシグマ71778-25G
鋼板N/AN/A16 x 16 インチ面積、1/16 厚さ
ストレート スプリングはさみファイン サイエンス ツール15000-08
SURFLO 24G テフロン I.V. カテーテルサンタ クルス バイオテクノロジー360103
サージカル ボードフィッシャー12-587-20これは変換されたスライド ホルダーです
ユニバーサル 3 ピン クランプフィッシャーS24280
ウィングド Inf. セット 25X3/4、12" チューブニプロPR25G19
ツァイス Stemi-508 解剖スコープツァイスn/a
糸 nファイン#PM999

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