ここでは、軽度から中等度の外傷性脳損傷の神経生物学的および病態生理学的影響を調査するためのげっ歯類のための爆風波モデルのプロトコルを提示する。圧力センサーを備えたガス駆動のベンチトップセットアップを確立し、爆風による軽度から中等度の外傷性脳損傷の信頼性と再現性の発生を可能にしました。
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方法論記事
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ここでは、軽度から中等度の外傷性脳損傷の神経生物学的および病態生理学的影響を調査するためのげっ歯類のための爆風波モデルのプロトコルを提示する。圧力センサーを備えたガス駆動のベンチトップセットアップを確立し、爆風による軽度から中等度の外傷性脳損傷の信頼性と再現性の発生を可能にしました。
外傷性脳損傷(TBI)は、大規模な公衆衛生上の問題です。軽度のTBIは、神経外傷の最も一般的な形態であり、米国で多数の医療訪問を占めています。現在、TBIに利用可能なFDA承認の治療法はありません。軍事関連の爆風誘発性TBIの発生率の増加は、効果的なTBI治療の緊急の必要性をさらに強調する。したがって、ヒト芽球関連TBIの側面を再現する新しい前臨床TBI動物モデルは、軽度から中等度のTBIの根底にある神経生物学的および病態生理学的プロセスの研究努力、ならびにTBIに対する新規治療戦略の開発を大きく前進させるであろう。
ここでは、軽度から中等度の芽球誘発性TBIの分子的、細胞的、および行動的影響の調査のための信頼性が高く再現可能なモデルを提示する。我々は、一貫した試験条件を保証するために圧電圧力センサを備えたガス駆動ショックチューブからなるベンチトップセットアップを使用して、げっ歯類における閉頭、爆風誘発軽度のTBIのためのステップバイステップのプロトコルを説明する。私たちが確立したセットアップの利点は、比較的低コスト、インストールの容易さ、使いやすさ、高スループット容量です。この非侵襲的TBIモデルのさらなる利点には、ブラストピーク過圧のスケーラビリティと制御された再現可能な結果の生成が含まれます。このTBIモデルの再現性と関連性は、神経生物学的、神経病理学的、神経生理学的および行動学的分析を含む多くの下流アプリケーションで評価されており、軽度から中等度のTBIの病因の根底にあるプロセスの特性評価のためのこのモデルの使用を支持している。
外傷性脳損傷(TBI)は、米国だけで毎年200万回以上の病院訪問を占めています。自動車事故、スポーツイベント、または転倒によって一般的に生じる軽度のTBIは、すべてのTBI症例の約80%を占めています1。軽度のTBIは、患者は最初の侮辱の数日後や数ヶ月で明白な症状を経験しないことが多いため、「静かな病気」と考えられていますが、人生の後半で深刻なTBI関連の合併症を発症する可能性があります2。さらに、爆風誘発性軽度のTBIは軍人の間で蔓延しており、慢性CNS機能不全と関連している3,4,5,6。芽球関連軽度TBIの発生率の上昇により7,8、軽度のTBIに関連する神経生物学的および病態生理学的プロセスの前臨床モデリングは、TBIに対する新規治療介入の開発における焦点となっている。
歴史的に、TBI研究は、重篤なヒトTBI症例の数が比較的少ないにもかかわらず、主に重度の形態の神経外傷に焦点を当ててきた。制御された皮質衝撃(CCI)9,10および流体パーカッション傷害(FPI)11モデルを含む、重篤なヒトTBIの前臨床げっ歯類モデルが開発されており、これらは両方とも信頼できる病態生理学的効果を生み出すために十分に確立されている12,13。これらのモデルは、TBIにおける神経炎症、神経変性、およびニューロン修復について今日知られていることの基礎を築いた。TBIの病態生理学に関するかなりの知識が開発されているが、TBIに対して利用可能な有効なFDA承認の治療法は現在存在しない。
より最近では、TBI研究の焦点は、効果的な治療介入を開発するという究極の目標を掲げて、TBI関連病理のより広いスペクトルを含むように拡大されている。それにもかかわらず、測定可能な効果を示した軽度のTBIの前臨床モデルはほとんど確立されておらず、軽度のTBIスペクトルを調査した研究はごくわずかです2,14,15。軽度のTBIがすべてのTBI症例の大多数を占めるため、新しい治療戦略を開発するために、ヒトの状態の病因および神経病態生理学の研究を促進するために、軽度のTBIの信頼できるモデルが緊急に必要である。
生物医学エンジニアや航空宇宙物理学者と協力して、軽度から中等度のTBIのためのスケーラブルでクローズドヘッドブラストウェーブモデルを確立しました。この前臨床げっ歯類モデルは、軍事戦闘、スポーツイベント、自動車事故、転倒で得られた人間の軽度のTBIに関連する爆風波や加速/減速運動などの力力学の影響を調べるために特別に開発されました。爆風波はヒトで軽度のTBIを引き起こす力力ダイナミクスと相関するため、このモデルは、ポンド/平方インチ(psi)*ミリ秒(ms)として測定されるインパルスで一貫したフリードランダー波形を生成するように設計されています。インパルスレベルは、前臨床調査を実施するために、マウスおよびラットについて定義された肺致死率曲線を下回るようにスケーリングされます16,17,18。さらに、このモデルは、動物の頭の急速な回転力によるクーデターおよびコントレクティブ傷害の調査を可能にする。この種の傷害は、軍人および民間人集団の両方で観察されるものを含む、いくつかのタイプの臨床TBI提示に固有のものである。したがって、この汎用性の高いモデルは、TBIの複数の臨床提示を包含するニーズに適合する。
ここで提示された前臨床モデルは、多数の先行研究によって実証されているように、臨床的軽度TBIに関連する信頼性が高く再現可能な病態生理学的変化を生じる17、19、20、21、22、23。このモデルを用いた研究では、低強度の芽球波を受けたラットが、神経炎症、軸索損傷、微小血管損傷、神経細胞損傷に関連する生化学的変化、および短期可塑性およびシナプス興奮性の欠損を示すことが示されました19。しかし、この軽度のTBIモデルは、中等度から重度の侵襲的TBIモデルを用いた研究で一般的に観察されている組織損傷、出血、血腫および挫傷19を含む巨視的な神経病理学的変化を誘発しなかった10,24。以前の研究19,21,22,23は、この前臨床モデルが、軽度および中等度のTBIの病因の根底にある神経生物学的および病態生理学的プロセスを特徴付けるために使用され得ることを示している17,19,20,21,22,23。 このモデルはまた、新しい治療化合物および戦略の試験、ならびに効果的なTBI介入の開発のための新規で適切な標的の同定を可能にする19,21,22,23。
このモデルは、げっ歯類の分子、細胞、行動の結果に対する爆風波と急速な回転力によって誘発される影響を調べるために開発されました。ここで提示された爆風波モデルと同様に、ガス駆動の過圧波を用いて軽度から中等度のTBIを再現しようとする多くの前臨床モデルが開発されている2,14,17,25,26,27,28。他のモデルの制限のいくつかが含まれます:動物は金網のガーニーに固定され、頭は衝撃時に固定されます。末梢器官は脳に加えて波にさらされ、多発性外傷の交絡変数を作り出す。また、モデルは大きくて静止しているため、重要なパラメータを変更して、人間のTBIを連想させるより良いモデル条件に適応させることが制限されます。
このベンチトップのガス駆動ショックチューブセットアップの利点は、取得およびランニングコストが比較的低コストであること、および設置と使いやすさです。さらに、このセットアップにより、マウスとラットの両方で、ハイスループットな操作と制御された再現可能なブラスト波と in vivo 結果の生成が可能になります。一貫した試験条件(すなわち、一定のブラスト波および過圧)を制御するために、セットアップには圧力センサが装備されています。TBIに対するこのモデルの利点には、傷害の重症度のスケーラビリティと、軽度のTBIが非侵襲的で閉鎖的な頭部処置を使用して誘導されることが含まれる。ピーク過圧とそれに続く脳損傷は、より厚いポリエステル膜とともに、一貫したスケーラブルな方法で増加します17。TBIの重症度を膜厚によってスケーリングする能力は、特定の転帰尺度(例えば、神経炎症)が明らかになるレベルを決定するための有用なツールである。末梢器官に保護遮蔽を提供することで、肺または胸部損傷などの全身損傷の交絡変数を回避または低減することによって、軽度のTBIメカニズムへの集中的な調査も可能になる。さらに、この設定により、爆風波が頭部に当たる/貫通する方向(すなわち、正面から、側面、上または下)を選択できるため、さまざまな種類のTBI誘発侮辱を調査できます。ここで説明する軽度から中等度のTBIを誘導する標準的な手順は、急速な回転力によるクーデターおよびコントレクエイプ傷害と組み合わせた爆風波傷害の影響を評価するために、側方暴露を使用する。さらに、もっぱら爆風誘発傷害を調査するために、このモデルではトップダウン爆風波ばく露を採用することができる。
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このプロトコルは、シンシナティ大学とウェストバージニア大学の動物ケアガイドラインに準拠しています。動物を含むすべての手順は 、施設動物 ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、 実験動物のケアおよび使用のためのガイドの原則に従って実施された。
1. ブラストTBIセットアップのインストール
2.圧力センサー記録を使用したセットアップとブラスト波特性の評価。
3. げっ歯類における実験セットアップの準備と軽度のTBIの誘導
注:TBI実験開始の30分〜1時間前にげっ歯類を保持領域に移して順応させる。手順の異音の影響を最小限に抑える保持領域を選択します。
4. 爆風波/回転力および制御にさらされるげっ歯類の下流用途
注:以前の研究では、爆風波および回転力に曝露した後の様々な時点での軽度から中等度のTBIの影響を、生化学的、神経病理学的、神経生理学的、および行動学的分析を含む下流のアプリケーションを用いてげっ歯類において評価した19。
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ブラスト波セットアップのスケーラビリティは、25.4、50.8、76.2 μmの3つの異なる膜厚を使用してテストされました。ピーク圧力レベルは、圧電圧力センサを用いてショックチューブ装置のヘッド配置領域および出口において評価された(図 1 および 図2を参照のこと)。ピーク圧力は、両方のセンサ位置で膜厚と一致して増加し(図3A、B)、ピーク圧力が本質的にスケーラブルであることを示しています。セットアップのこのプロパティを利用して、手順 2.3 で説明したように、システムを較正し、スケーラビリティを評価できます。
インビボでの芽球誘発性TBIの影響を評価するために、成体、生後3ヶ月、雄、野生型C57Bl/6Jマウスを、ここで説明するプロトコルを用いて、このセットアップによって生成された爆風波に曝露した(図1
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ここでは、費用対効果が高く、セットアップと実行が容易で、高スループットで信頼性が高く、再現性のある実験結果を可能にする前臨床軽度TBIモデルを紹介します。このモデルは、末梢器官に保護シールドを提供し、軽度のTBIメカニズムへの集中的な調査を可能にしながら、全身損傷の交絡変数を制限する。対照的に、他の爆風モデルは末梢器官に損傷を与えることが知られている2,39,40。このモデルの別の利点は、他のブラストモデル40における固定位置と比較して任意の所望の角度からブラスト波を送達する能力である。これにより、脳の脆弱性をよりよく理解するための焦点を絞った解剖学的研究が可能になります。
ヒト芽球関連TBIを研究するために、TBIの関連モデルは、TBI誘導中に被験者が経験したものに匹敵する生体力学的力を生成するべきである。臨床的に関連するモデルはまた、軽度のTBI...
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著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
我々は、TBIモデルの開発に貢献したR. Gettens、N. St. Johns、P. Bennet及びJ. Robsonに感謝する。Brain & Behavior Research Foundation(F.P.およびM.J.R.)からのNARSAD Young Investigator Grants、Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease(F.P.)からの研究助成金、PhRMA Foundation Award(M.J.R.)がこの研究を支援しました。この研究は、米国薬学教育財団(A.F.L.およびB.P.L.)の博士前フェローシップを通じて支援されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3/8 SAE高圧油圧ホース | イートンAeroquip | R2-6-6-36M | グレインジャーから入手可能 |
| 3/8インチ クイックコネクト メスプラグ | ケルヒ | ャーKAR 86410440 | |
| 3/8インチ クイックコネクトオスプラグ | ケルヒ | ャーKAR 86410440 | |
| ANY迷路ビデオ追跡ソフトウェア | Stoelting Co. | ANY迷路ソフトウェア | |
| Clear Mylar membrane | ePlastics.com | POLYCLR0.003 | http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003;クリアマイラーメンブレンは、さまざまな厚さで販売されています。すべて上記のベンダーによって販売されています。 |
| コンパウンドスライドテーブル(X2) | グリズリーインダストリアル | G5757 | |
| デッドマン ガスコントロールボールバルブ | コネラコ | 71-502-01 | "アポロ"、グレインジャー |
| ドライバーと駆動セクション(マウス) | 自身の設計/生産 | n / a | 、著者 |
| ドライバーと駆動セクション(ラット) | 自身の設計/生産 | n / a | 詳細については、著者にお問い合わせください |
| Ear Muffs | 3M | 37274 | インジャー |
| から入手可能ガスレギュレーター - ハイフロー 3500-600-580 | ハリス | 3003539 | |
| ヘリウムガス | エアガス | HE 300 | タンクは様々なサイズで利用可能 |
| 吸入麻酔システム | VetEquip | 901806 | |
| 入力モジュール | ナショナルインスツルメンツ | NI 9223 | |
| イソフルラン | バクスター | NDC 10019-360-40 | 獣医師 |
| による注文ラボ用タイマー/ストップウォッチ | Fisher Scientific | 50-550-352 | |
| Labviewバージョン12.0 | National Instruments | Data Acquistion Software | |
| 磁気ダイヤルインジケータ/マイクロメータ | Grizzly Industrial | G9849 | |
| MATLAB | MathWorks | 圧力記録解析用ソフトウェア | |
| 酸素レギュレータ | Medline | HCS8725M | |
| データ処理用PC | Dell | ||
| Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm | FORMUFIT | P001FGP-WH-40x3 | |
| 圧力センサ | PCB Piezotronics | 102A05 | |
| レシーバ USBシャーシ | National Instruments | DAQ-9171 | |
| センサ 信号コンディショナ | PCB Piezotronics | 482Cシリーズ | |
| ステンレスNSF定格取り付けテーブル | |||
| Tハンドルアレンレンチ - 3/16'' | S&K | 73310 |
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