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方法論記事

脳回路の非侵襲的切断に対する標的ニューロン損傷

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DOI:

10.3791/61271

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2020年9月27日

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1Department of Neuroscience, University of Virginia, 2Department of Radiology, Stanford University, 3Department of Neurology, University of Virginia, 4Global Internship Program, Focused Ultrasound Foundation, 5Department of Medicine, University of Virginia, 6Image Guided Therapy, 7Department of Neurosurgery, University of Virginia, 8Center for Brain, Immunology, and Glia, University of Virginia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

プロトコルの目的は、脳内の非侵襲的な神経病変を産生するための方法を提供することです。この方法は、脳のパレンチマに循環神経毒を送達するために、一過性および焦点的な方法で血液脳関門を開くために磁気共鳴誘導集束超音波(MRgFUS)を利用する。

要約

外科的介入は、特定のタイプの医学的に難治性の神経疾患を治療するのに非常に有効である。このアプローチは、てんかんや運動障害など、特定可能な神経回路が重要な役割を果たす障害に特に有用です。現在利用可能な外科的モダリティは、有効である一方で、一般的に侵襲的な外科的処置を伴い、非標的組織に外科的傷害をもたらす可能性がある。その結果、非侵襲的および神経毒性の両方である技術を含むように外科的アプローチの範囲を拡大することが価値があるだろう。

ここでは、非侵襲的な方法で脳内の神経細胞の焦点、病変を産生するための方法が提示される。このアプローチは、静脈内マイクロバブルと共に低強度の集中超音波を一過性および焦点を当てて血液脳関門(BBB)を一時的かつ局所的に開くことを利用する。一過性BBBの開口の期間は、その後、局所的に投与された神経毒を標的とする脳領域に送達するために利用される。神経毒キノリン酸(QA)は、通常BBB不透過性であり、腹腔内または静脈内に投与すると十分に許容される。しかし、QAが脳組織に直接アクセスすると、ニューロンに有毒です。この方法は、特定の脳領域を標的とするラットおよびマウスで使用されている。MRgFUSの直後に、BBBの開封成功が、コントラスト強化T1重み画像を用いて確認される。処置後、T2イメージングは、脳の標的領域に限定された傷害を示し、標的領域におけるニューロンの喪失は、組織学的技術を利用して死後に確認することができる。特に、QAではなく生理食動物を注射した動物はBBBの開封を示すが、ドットは傷害または神経喪失を示さない。この方法は、精密脳内非侵襲的誘導手術(PING)と呼び、神経回路の障害に関連する神経障害を治療するための非侵襲的アプローチを提供しうる。

概要

この方法の目的は、脳の標的領域において非侵襲的な神経病変を産生する手段を提供することにある。このようなアプローチを開発するための根拠は、神経疾患に寄与する神経回路を切断することです。例えば、外科手術は、薬剤耐性てんかん(DRE)1のような特定の医学的に難治性の神経疾患の治療に非常に有効であり1得る。しかし、利用可能な外科的モダリティのそれぞれは、脳に望ましくない担保損傷を生み出すという点で限界を有する。伝統的な切除手術は、出血、感染、血栓、脳卒中、発作、脳の腫脹、および神経損傷のリスクを伴う非常に侵襲的であり得る2。低侵襲または非侵襲性である防除手術の代替手段には、レーザー間質熱療法および放射線手術が含まれ、DREにおける発作を抑制するのに有効であることが証明されている。最近では、高強度集中超音波(HIFU)によって産生される熱病変は、発作を減らすという約束を示している。HIFUは非侵襲的です。しかし、その治療ウィンドウは、頭蓋骨の近くに位置する非標的組織への熱損傷のリスクのために、現在、脳のより中央の領域に限定されています。このような制限にもかかわらず、手術の利点は、多くの場合、潜在的なリスクを上回る。例えば、DREの手術は副次的な脳損傷を引き起こす可能性がありますが、発作を抑制し、生活の質を向上させる有益な効果は、通常、外科的リスクよりも優勢です。

本明細書に記載される方法は、精密脳内非侵襲的誘導手術(PING)であり、副次的な脳損傷を制限しながら、神経回路を切断することを目的に開発された。この方法は、神経毒を送達するために、BBBを開くためにマイクロバブルの静脈注射と組み合わせた低強度の集中超音波を利用する。このアプローチは,、脳3、4、5、6、74,5,6に熱病変を生成せず、BBB開口部の期間は、脳のパレンチマにBBB不透過性化合物を提供するために利用することができる。37BBBの開口部は一過性であり、磁気共鳴画像法誘導を用いて標的化された方法で製造することができる。我々の研究では、BBB開口の期間は、ラットおよびマウス,8、9における脳のパレンチマの標的領域に循環神経毒を送達するために利用8されてきた。キノリン酸は、静脈内10、動脈内10、または腹腔内1088、9、11を静脈内投与すると十分に許容される神経毒である。,9,11QA毒性の欠如は、そのBBB透過性が悪いためであり、これは無視できる10であると報告されている。対照的に、脳のパレンチマへのQAの直接注入は、隣接する軸索12、13,13を惜しむ神経病変を生じる。このように、循環QAがBBB開口部の標的領域で脳のパレンチマにアクセスすると、神経死は88,99を産生する。本手法は、このように正確に標的化された非侵襲的な方法で、焦点ニューロンの損失を生じる。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、バージニア大学動物のケアと使用委員会によって承認されています.

1. 試薬の調製

  1. 手術当日、6.0 mLの注射キノリン酸(QA)を準備します。450 mg の QA を 1.0 N NaOH の 4.0 mL に溶解します。0.6 mLの10x PBS、pHを7.4に加え、0.22μmのシリンジフィルターを通してdH 2 O.フィルターで6.0 mLの最終容積に持ち込みます。この溶液は4°Cで2週間安定である。
  2. デカフルオロブタンガスからのプローブ超音波処理により正常食ライン中のマイクロバブルの水分散を調製し、DSPC/PEGステアリン酸単層シェル12で安定化する。
  3. 正常な重力で浮揚によってマイクロバブルをサイズ化します。マルチサイザーIIIカウンターを使用してエレクトロゾーンセンシングによりマイクロバブル濃度とサイズを決定します。マイクロバブル濃度とサイズ分布は、それぞれ6 x 108/mLおよび〜2μm(平均粒子径)である必要があります。最大の気泡は浮揚除外/分離によって除去されます。
  4. あるいは、市販のマイクロバブルを購入する。

2. 動物の準備

  1. 動物(ラットまたはマウス)を出産後3日間順応する。ここで説明した実験では、スプレイグ・ドーリーラット(5~6週齢)またはテレンセファーリン内部構造ヘテロトピア(チッシュ)ラット(局所コロニー)を用いた。
  2. 12時間の光の下で動物を収容する:12時間の暗いサイクル。
  3. 動物の重みを記録します。この情報は、手順全体を通して重要です。
  4. 術前ベースライン画像を確立するために、FUS手順の前日にT2重み付けMR画像を取得します。T2 イメージングには、繰り返し時間/エコー時間 [TR/TE] =3,000/138 ミリ秒、3 平均、視野 =29 x 45 mm2、マトリックス サイズ = 125 x 192、スライス厚 = 0.23 mm のパラメータを使用します。
  5. イオブルラン(4%誘導、2%メンテナンス)で動物を麻酔します。つま先ピンチを使用して麻酔の適切な深さを確認します。眼の軟膏を目に当ててください。
  6. 動物の頭皮を剃り、脱毛クリームで残りの髪を取り除きます。
  7. マイクロバブル、造影剤、QAの注入には尾静脈カテーテルを使用してください。カテーテルは30 G x 1/2インチの針と合うPE10管の長さから成っている。1 mL の注射器にヘパリン化した生理食音を並べて残し、そのラインが注入に使用されるときに取り外して再び取り付けます。

3. MRI と PING の手順

  1. 勾配強度が 600 mT/m/ms の 7 T MR 単位で MRI を実行します (図 1 および 図 2)。FUSシステムに組み込まれた表面コイルを使用してMRI取得を行います。
    注:実験に使用されるFUSシステムは、3つの部分で構成されています:(i)超音波処理システムは、MR互換の事前焦点を当てた8要素の環状アレイ、1.5MHzトランスデューサ(球状半径= 20mm±2mm、アクティブ径=25mm(f-number = 0.8)、80%の電気音響効率を有するRF電源とRF電源を接続します。(ii) MR互換の電動ポジショニングステージで、トランスデューサを前部後方向および平凡横方向に移動させる。(iii) 熱路ワークステーションは、焦点深度を調整する位相変調を介した電子的な焦点を含む超音波処理の配信を制御する(図2)。
  2. 麻酔動物をMR対応FUSシステムのコイルそりアセンブリ(図1)に置きます。そりの揺りかごに組み込まれた切歯バーと耳棒を使用して動物を固定化します。
  3. 水濡れの頭皮に音響ゲルを適用します。気泡がないことを確認し、トランスデューサアセンブリの水循環器部分の膜バリアを動物の頭蓋骨の上に置き、トランスデューサアセンブリを頭蓋骨プレートに対して平行な平面方向で可能な限り下げる。トランスデューサの横隔膜を頭蓋骨板の上に動物の剃毛頭皮にしっかりと向けます。
  4. 呼吸を監視するために、手術用テープで体に空気圧センサーを取り付けます。左下リブケージに空気圧センサーを置きます。
  5. コイル、そり、および動物を含む FUS アーム アセンブリを 7T MRI ユニットに移動します (図 1)。
  6. T2-scout シーケンスを実行して、動物の頭部に対するトランスデューサアセンブリの一般的な物理的位置を決定し、必要に応じて機械的な調整を行います (図 2)。T2イメージングのパラメータは、繰り返し時間/エコー時間[TR/TE]=3,000/138ミリ秒、3平均、視野=29 x 45 mm2、マトリックスサイズ=125 x 192、スライス厚= 0.23mmです。サーモメトリーは、通常、このプロトコルでは使用されません。
  7. T2画像を取得して、トランスデューサの位置を調整します。正確には、トランスデューサの位置を定義し、ソフトウェアのターゲティング機能を使用して超音波処理の焦点を指定します。T2イメージングのパラメータは、繰り返し時間/エコー時間[TR/TE]=3,000/138ミリ秒、3平均、視野=29 x 45 mm2、マトリックスサイズ=125 x 192、スライス厚= 0.23mmです。
  8. 超音波処理の直前に、尾静脈を介してマイクロバブル14 の300 μL /kgを注入します。
  9. 1.5 MHzトランスデューサを使用して超音波処理(30ミリ秒波パケット、3%デューティサイクル、1 Hzバースト繰り返し周波数、240秒の持続時間/超音波処理)を生成します。
  10. 超音波処理の直後に、尾静脈を介してガドジアミド造影剤を注入し、次にT1加重プラスコントラストスキャンを行い、BBBの開口と標的化の精度を確認する。T1加重イメージングのパラメータ:TR/TE = 900/12ミリ秒、平均2、視野=24 x 30 mm2、マトリックスサイズ=208 x 256、スライス厚= 0.7mm。通常、単一の T1 スキャンが実行されます。
  11. FUSアームとそりをMRIから取り出し、2%イオフルラン麻酔を維持しながら、40°Cに設定された加熱パッドに動物を置きます。
  12. 超音波処理後30分から、注射器ポンプを使用して、16.8 μL/minの速度で1時間にわたって尾静脈を介してQA(75mg/mLストック溶液)を注入し、225mg/kg(q.s.〜1.0 mL生理食動物)の最終投与量を達成します。
  13. 注入が完了したら、麻酔を中止し、動物を警告まで加熱パッドに置きます。ケージに動物を置き、処置後数時間、15分ごとにその活動を定期的にチェックします。
  14. 動物をビバリウムに戻し、苦痛や不規則な活動のために初日を6時間ごとにチェックしてください。
  15. 1日の超音波処理後、超音波処理の領域内の任意の損傷を評価するためにT2重み付けMRイメージングを実行します。T2イメージングのパラメータ:繰り返し時間/エコー時間[TR/TE]=3,000/138ミリ秒、3平均、視野=29 x 45 mm2、マトリックスサイズ=125 x 192、スライス厚= 0.23mm。画像は、組織の損傷/浮腫の可能性を識別するために、高強度の領域について評価されます。

4. 神経細胞喪失の事後分析

  1. フルオロ・ジェイドの細胞化学で神経細胞の喪失を評価するための超音波処理後、4〜5日間の生存期間を許可します。
  2. イオブルランで動物を深く麻酔し、0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.4)で心内灌流を介して安楽死させ、続いてリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドを続けた。
  3. 頭蓋骨から脳を取り除き、4%パラホルムアルデヒドで2日間の後修正を行います。
  4. 脳を凍結保護のために30%スクロースに浸し、クライオスタットで20〜30μmの厚さで切り分をカットします。
  5. 凍結スタットセクションをゼラチン化スライドにマウントし、一晩で空気乾燥します。
  6. 蒸留水でスライドを水分補給し、昇順のエタノールで脱水します。脱水後、降順の等級エタノールでスライドを水分補給します。
  7. 軌道シェーカーで15分間、過マンガン酸カリウムの溶液にスライドを移します。
  8. 蒸留水で1分間滑り、0.1%酢酸でフルオロジェイドBの0.001%溶液に移します。室温で30分間穏やかな攪拌の下でインキュベート。蒸留水で1分間、3回滑ります。
  9. スライドウォーマーでスライドを乾かし、3分間キシレンで平衡化し、DPX取り付けメディアを使用してカバースリップします。

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結果

このセクションでは、新皮質異形成に位置するニューロンに対するPINGの効果について説明する。組織異形成は、薬剤耐性てんかん患者の脳において共通の特徴であり、および発作原発性異形成の外科的除去は、発作15の優れた制御を提供することができる。したがって、異形成脳組織に対するPINGの効果を定義することは重要な優先事項です。遺伝子皮質異形成のラットモデルは、チッシュラットが、通常位置付けされた新皮質の下に位置する異形成組織(皮質下バンドヘテロトピア)を呈するため、この問題を研究するために選択された(図3)16。16異形成と上層の新皮質の両方が機能し、特徴的な新皮質の結合性を示すニューロンを含み、17,18。17,

チッシュラット脳のヘテロトピアを標的とするPINGは、異形成ニューロンの焦点ニューロン喪失を生じに有効であ...

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ディスカッション

PING法は、非侵襲的な標的ニューロン病変を生じるように設計されている。,この方法は、焦点を絞った超音波,3、4、5、6、74,5の3分野における研究の強力で成長基盤に由来する。67BBBの一時的な開口部を介して脳のparenchymaの特定の領域への焦点アクセスを提供する能力は、通常、脳へのアクセスを得ない多種多様な薬剤を提供するための道を作り出した。この機会は、主に貧しいBBB透過性を有する治療薬の中央送達のために進められている。PING法は、神経機能障害に寄与する回路を破壊するという究極の目標を持つ神経毒を提供することによって、異なる方法で同じ機会を活用します。異常な神経回路は、特定の神経疾患22,151...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、ルネ・ジャック・ロイがMRI分野における優れた技術サポートを行ったことを認めた。この研究は、国立衛生研究所(R01 NS102194からKSL、R01 CA217953-01からMW)、チェスター基金(KSL)、フォーカス超音波財団(KSLおよびJW)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7T-ClinScan MRIシステムBruker Biospin, Ettinglen, GermanyMR Image Acquisition
Acoustic GelLitho CLEAR11-601高粘度 音響透過ゲル
DPX 埋込 中電子顕微鏡 Sciences13512樹脂ベースカバー ガラス封入剤
Fluoro-Jade BEDM MilliporeAG310高親和性染色変性ニューロン
フルオバック麻酔吸着器ハーバード装置34-0388有機麻酔スカベンジャー
FUSシステム画像誘導療法、ペサック、フランスLabFUSMR互換小動物焦点超音波システム
ガドジアミドGEヘルスケアAS、オスロ、ノルウェーOmniscanMR造影剤
ヘパリンSAGENTNDC2502140010抗凝固剤
皮下注射針 30G x 1/2Becton-Dickinson26027尾静脈カテーテル
インスリン注射器 28G1/2 (1ml)EXEL26027尾静脈カテーテルへの注射剤の投与
イソフルオランアトマイザーSurgiVetVCT302麻酔投与
イソフルランヘンリー・シャインNDC1169567762麻酔
KMnO4Sigma223468オロジェイドB染色に使用される試薬
バブル内部で製造:A.クリバノフ305106血液脳関門破壊剤
マイクロバブル (商業ソース)Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MADefinity マイクロバブル血液脳関門破壊剤
モニタリング &ゲーティングシステム小動物用器具モデル1030呼吸モニタリング
マルチサイザー 3 コールターカウンターベックマン・コールター、ハイアリア、FLマルチサイザー 3マイクロバブルの平均サイズを決定するために使用
Optixcare EYE LUBECLC MEDICA、オンタリオ州、カナダ11611角膜保護剤-アイルーブ
PE10 チューブベクトン・ディキンソン427401尾静脈カテーテル成分
キノリン酸サンタクルーズバイオテクノロジー、テキサス州ダラスCAS 89-00-9神経毒
Sprague-Dawley ラットタコニックバイオサイエンスSD-Mラットモデル
シリンジポンプカーネギーメディシンCMA 100キノリン酸の制御送達
サーモガイドソフトウェア画像誘導療法、ペサック、フランスサーモガイドドライブ ラボ FUS システム
Tish Rats社内コロニーラット モデル
Veet 脱毛クリームReckitt Benckiser頭皮の毛の除去
フルマイクロ

参考文献

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